Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Özet

Primer hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürleri, nörotrofik faktörleri sağlamak ve uzun ömürlülüğü sürdürmek için genellikle glia besleyici tabakaya ihtiyaç duyar. Burada, spesifik nöronal-otonom mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştıran yüksek yoğunluklu bir nöronal besleyici tabakanın varlığında cam lameller üzerinde ultra düşük yoğunluklu nöronları kültürlemek için basitleştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz.

Özet

In vitro birincil hipokampal nöronları Kültürleme nöronal gelişimi birçok yönlerini mekanik sorgulama kolaylaştırır. Ayrışmış embriyonik hippokampal nöronlar, genellikle, serum içermeyen koşullar altında, yüksek yoğunlukta cam lameller üzerine başarılı bir şekilde büyüyebilir, ancak düşük yoğunluklu kültürleri, tipik ederek trofik faktöre kaynağı gerektirir zaman alıcı olabilir hazırlanması bunun bir glia besleyici tabaka ile ortak kültür ve zahmetli. Buna ek olarak, glia varlığı nöron spesifik mekanizmalarına sonuçları ve preclude çalışmaların yorumlanmasına neden olabilecek. Burada basitleştirilmiş bir yöntem serumsuz koşullar altında ve glial hücre desteği olmadan bir ultra-düşük yoğunluklu (~ 2.000 nöronlar / ^cm2), uzun dönemli (> 3 ay) primer hipokampal nöron kültürü için sunulmuştur. Düşük yoğunluklu nöronlar poli-D-lizin kaplı lamelleri yetiştirilen ve 24 oyuklu bir plaka içerisinde yetiştirilen yüksek yoğunluklu nöronlar üzerinde ters çevrilmiş olan. Bunun yerine betwee bir alan oluşturmak için parafin nokta kullanarakn İki nöron katmanları, deneyci sadece düşük yoğunluklu nöron büyümeye elverişli bir MICROSPACE oluşturmak için, yüksek yoğunluklu nöronlar ikamet hangi kuyunun plastik altını, etch olabilir. ko-kültür böylece kolayca bu nöronların morfolojik ve fizyolojik çalışma kolaylaştıran düşük yoğunluklu nöronların önemli bir kayıp olmadan> 3 ay muhafaza edilebilir. Bu başarılı kültür koşulundaki göstermek için, veri uzun süreli kültürden sonra, düşük yoğunluklu hücrelerinde bol sinaps oluşumunu göstermek için verilmiştir. Bu eş-kültür sistemine, aynı zamanda, poli-D-lizin substratlar ve böylece autaptic bağlantıların oluşumu adaları yetiştirilen seyrek bireysel nöronların hayatta kalmasını kolaylaştırır.

Giriş

In vitro koşullarda hipokampal nöronlar Büyüyen gözlem ve in vivo olarak başka türlü mümkün olmayan bu nöronların deneysel manipülasyon sağlar. Bu deneysel yaklaşım yaygın büyüme, kutuplaşma, akson şartname, insan ticareti ve proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, sinaps oluşumu ve işlevsel olgunlaşma ¹ nöronal mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılır. Geç embriyonik aşamada hasat zaman Bu in vitro kültür hipokampal nöronlar, piramidal morfoloji ² (>% 90) glutamaterjik hücreler nispeten saf bulunmaktadır. Nöronlar in vitro koşullarda bir 2-D yüzeyinde yetişen Çünkü, bu yöntem tek bir odak düzlemi ³ ile boyama gibi canlı görüntüleme veya immünsitokimya (ICC) kolay gözlem, izin verir; Böyle ilaç tedavisi ve transfections ^3-6 veya manipülasyonlar. yüksek yoğunlukta yetiştirilen zaman, nöronlar, çünkü daha yüksek co hayatta kalma yüksek oranlarına sahip olma eğilimibüyüme ortamından, ve aynı zamanda çünkü akson temas bağımlı mekanizmalar ⁷ sindirim desteğinin yanı sıra salgılanan büyüme faktörlerinin ncentrations. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu hipokampal nöronlar bağımsız bir nöron bütünüyle görüntülenecek veya ICC analizi için boyandı morfolojik çalışmalar için de arzu edilir. Düşük yoğunluklu nöronlar nedeniyle parakrin destek eksikliği nedeniyle kültüründe korumak zor ve bu nedenle sık sık önceki nöron kültürü ² hazırlıklı olmak olan bir glial (genellikle kortikal astrosit) besleyici tabaka, gelen trofik desteği gerektirir. Bir glial hücre besleyici tabaka ile kültürlü işbirliği yaparken, düşük yoğunluklu nöronlar lamelleri yetiştirilen ve düşük yoğunluklu nöronlar ve glia birbirine bakacak şekilde daha sonra glia tabakasının üstüne çevirdi. Glia ve nöronlar arasındaki küçük bir kapalı alan, bu nedenle bir 'sandviç' düzen ^2,8,9 yaratma, lamelleri köşelerindeki parafin noktalar yerleştirerek oluşturulur. düşük yoğunluklu nöronlar w büyüyecekglia ve nöronlar ve glia tarafından salgılanan konsantre faktörler ile bir müsamahakar mikro oluşturur lamel arasında kapalı alana ithin. Bu yaklaşım, düşük yoğunluklu, makul aralıklı olan tam gelişmiş nöronlar, bu nedenle kolaylaştırma ICC etiketleme ya da canlı görüntüleme çalışmaları verir.

yana zaman alıcı ve zahmetli olmaktan nöron glia ortak-kültürünün bir görünür sakıncası, bu nörona özgü veya hücre-bağımsız, düzenekleri önlemesidir. Bu sistem çok daha az karmaşık daha olmasına rağmen in vivo sinir dokusu, deneyler ¹⁰ bulandırabilir salgılanan, zaman henüz tam olarak tanımlanmış faktörleri ile nöron gelişimi üzerindeki glia etkisi. Bu nedenle, nöron spesifik mekanizmaların soruşturma, serum ve glial destek tabakası gerekli kaldırmak tanımlanan kültür koşulları gerektiren deneylerde. Bir önceki çalışmada, bir inci kullanılarak nöronların düşük konsantrasyonlarda (~ 9.000 hücre / cm ²⁾ kültüre başarmıştırree boyutlu hidrojel matrisi ^11. nispeten saf nöronal popülasyon glial desteksiz serumsuz koşullar altında, yüksek yoğunlukta kültürlenebilir yana, hipokampal nöronlar ultra düşük yoğunluklu ile serumsuz tanımlanmış bir kültür ortamı içinde yetiştirilen Hipotezimize olarak, yüksek yoğunluklu nöronlar ile ko-kültür geleneksel olarak kabul nöron glia ko-kültür benzer bir şekilde. Gerçekten de, bir "sandviç" yapılandırmada, yüksek yoğunluklu hipokampal nöron kültürleri en son özel magnoselüler endokrin nöronlar ¹² az sayıda destek kullanılmıştır.

Bu nedenle, yüksek yoğunluklu nöronlar ile ko-kültür düşük yoğunluklu nöronlar uzun süreli sağkalım sağlamak için yeterli trofik faktörler destek almak için izin verebilir. kültür ultra-düşük yoğunluklu nöronların Bu protokol, böylece formüle ve onaylanmıştır. protokol yüksek yoğunluklu hazırlayarak, tek bir deneyde içinde uygulanabilir (~ 250.000 hücre / ml) disBirlikte olan hippokampal nöronlar, önce ve sonra bir yoğunluğa ~ 10,000 nöronlar vermek üzere bir seyreltme yapılmadan / ml (~ 3000 nöronlar / lamel veya ~ 2.000 nöron / ^cm2), en düşük yoğunlukta kültür bildirilen daha düşüktür, ^{2,3,9 , 11,13.} Bu kültür durum gevşek 'ultra-düşük yoğunluklu' kültür olarak adlandırılan ve 'düşük yoğunluklu' arası istikrarsızca kullanılır. yüksek yoğunluklu nöronlar, poli-D-lisin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine plakalanır; düşük yoğunluklu nöronlar poli-D-lizin kaplı 12 mm'lik cam lameller üzerine ekildi ise başka bir 24-çukurlu plaka içinde yerleştirilir. nöronlar indiler ve lamelleri bağlı sonra düşük yoğunluklu nöronları yapışmış olan lamelleri 2 saat sonra yüksek yoğunluklu nöronların üstünde çevrileceği. Buna ek olarak, bunun yerine yüksek yoğunluklu nöron katman üzerinde lamelleri yükseltmesine parafin noktalar kullanılarak, bir 18 G şırınga iğnesi, iki paralel çizgi 24 yuvalı plakalar alt aşındırma için kullanılmıştır. Ortaya çıkan displNahl.Acad, bitişik plastik cam lamelleri için yükseltilmiş bir destek sağlar. Bu alan sürekli konsantre trofik faktörler ile mikro sağlarken yeterli oksijen ve kültür ortamı alışverişini sağlayan 150-200 mikron, ölçülür. Bu durumda, düşük yoğunluklu nöronlar yoğun büyür ve kültürde üç ay ötesinde yaşayabilir. Bu nöronlar kültüründe üç hafta sonra GFP plazmid ile transfekte edildiğinde, dendritler bolca dendritik dikenler çivili. ilkesinin bir kanıtı olarak, veriler, bu ko-kültür sistemi nöronları hücre araştırma kolaylaştırabilir autaptic bağlantıları oluşturan poli-D-lizin mikro-adalar ", üzerine ekildi hipokampal nöronlar ultra düşük yoğunluklu kültürleri desteklediğini göstermek için sunulmuştur -autonomous, ağ-bağımsız mekanizmalar.

Protokol

fareler içeren tüm deneysel prosedürleri Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan ve NIH kurallarına uyduğu bulundu.

Hipokampal Nöron Kültürü 1. Doku Kaynağı

1. Hipokampal nöron kültürü için prenatal fare yavrular üretmek için evi ¹⁷ yetiştirilen zaman gebe farelerin (C57BL6 / J) kullanın. vajinal fiş algılama ile gün E0.5 olarak belirlenmiştir. kültür için planlanan hasat zamanı E16.5-E17.5 olduğunu.
   Not: Bu protokol, düşük yoğunluklu nöronlarla ko-kültür, iki yüksek yoğunluklu nöron iki 24-yuvalı plakalar kültürleri tarif (48 lamelleri toplam) hazırlandı. daha fazla levha, ancak malzeme ve reaktif için uygun şekilde ölçeklenebilir.

Yüksek Yoğunluklu nöron kültürleri 2. 24 oyuklu plakalar hazırlanması

Not: embriyoların planlanan hasattan önce aşağıdaki adımları (2-3) gün yapın.

1. İki 24 kuyu getirhücre kültürü kaputu içine plakaları, bireysel ambalaj açın.
2. 1 ml'lik plastik tek kullanımlık şırıngaya 18 G şırınga iğnesi bağlayın.
3. şırınga tutun ve de alt merkezi sol ~ 1 mm iğne ucu amaçlamaktadır. kuyu (~ 1 mm uzunluğunda) alt etch orta kuvvet (~ 250 gr) uygulayın. Bir oluk oluşmuş ve plastik malzemeler düz dipli kuyu yüzeyi üzerinde yükseltilmiş bir destek oluşturacaktır yerinden edilecektir. Benzer bir şekilde alt merkezinin sağındaki ~ 1 mm bir yaklaşık 1 mm uzunluğunda paralel oluk Etch.
4. İki 24 oyuklu plakaların tüm oyuklara için yineleyin. Yüksek yoğunluklu kültürü için kullanılan iki adet 24 oyuklu plakalar artık, poli-D-lisin (aşağıdaki adımı 3.8) ile kaplama için hazırdır.

Düşük Yoğunluklu Nöron Kültürler 3. Lameller Hazırlık

1. 12-mm çaplı 1. tur camını kullanın.
2. 100 mm çaplı steril plastik petri içinde 50 lamelleri yerleştirin ve lamelleri daldırın20 mi% 70 etanol çözeltisi içinde. bir saat boyunca, orta (70 rpm) dönüş hızı ile dönen bir platform üzerinde, bu petri yerleştirin. % 70 etanolü çıkarmak ve daha sonra% 70 etanol taze toplu ile değiştirin. Döndürün ve bir saat daha yıkayın.
3. % 70 etanol temizleme solüsyonu atın. (0.2 mikron filtre birimi ile filtrelenmiştir) steril su ekle. elle petri çevirerek titizlikle lamelleri durulayın. üç kez taze steril su ile değiştirilmesi her zaman durulayın.
4. laminer akış steril bir hücre kültürü kaput içinde lamelleri ile petri yerleştirin. Vakum hattı üzerinden durulama suyu aspire ve lamelleri sokmak için steril su filtrelenmiş 10 ml ekleyin. lamelleri steril olmalıdır ve yüzey poli-D-lisin kaplama için yeterince temiz olmalıdır.
5. bireysel ambalaj açma iki adet 24 oyuklu plakalar ve başlık koyun.
6. kaputu vakum hattında açın. vakum hattına 200 ul pipet bağlayın ve bir SCIS kullanınsor daha büyük bir açılış oluşturmak için ucu kesmek için.
7. petri, bir anda birinden lamelleri pick up ve tamamen lamel kurumaya vakum hattını kullanmak için ince uçlu 5. cımbız kullanın. Daha sonra, 24 gözlü bir levhanın gözleri her birine, bir lamel. 50 temizlenmiş lamelleri, iki 24-çukurlu tablalara, her bir doldurmak için yeterli olmalıdır.
8. borat tampon maddesi (pH 8.5) ile çalışma çözeltisi (0.1 mg / ml) içine poli-D-lizin stok çözeltisi (1 mg / ml) ile seyreltilir. (Kazınmış dipli, iki yüksek yoğunluklu plakaları dahil), dört 24 oyuklu plakalar için toplam çalışma çözeltisinin 30 ml hazırlar.
9. cam kapak slipleri, her bir oyuğa 300 ul 0.1 mg / ml poli-D-lizin çalışma solüsyonu ekleyin. lamelleri solüsyon içinde tamamen batırılır emin olun. Değilse, kuyunun dibinde karşı lamelleri bastırın # 5 cımbız ucu kullanın ve lamelleri tüm yüzeyini kapsayacak şekilde poli-D-lizin çözüm rehberlik ucu kullanın. Görme Herhangi yüzeylerin olmak için tüm lamelleri incelemekHiçbir hava yeniden plaka ve lamelleri arasında sıkışıp edildi.
10. Ekle 300 ul 0.1 mg / kazınmış dipli yüksek yoğunluklu kültür plakasının her bir oyuğuna ml poli-D-lizin çalışma çözeltisi. Kuyunun tüm alt kapağı çözüm yaymak için elle döndürün.
11. kültürü inkübatör poli-D-lizin ile dört tabak dönün ve / N O kuluçkaya yatmaktadır.

Kültür 4. Yıkama ve Ön şartlandırma Tabaklar

Not: Aşağıdaki aşamalar (4-9), doku hasat gününde gerçekleştirilir.

1. lamelleri ve 24 oyuklu plakalar göre O / N inkübasyon / Kaplamadan sonra, dört Levhalar, kültürün davlumbaz içine (donör lamelleri, kazınmış plastik dipli, iki alıcı yüksek yoğunluklu plakaları ile iki adet) getir. poli-D-lisin çözeltinin ayrılması için vakum hattı kullanın.
2. Hemen her bir plastik bir transfer pipeti kullanılarak ~ 1 ml steril su ekle, poli-D-lisin çözeltisinin çıkarılmasını takiben. Tüm oyuklar sıkıldıktan sonrasu ile 10 dakika süreyle bekletin. Daha sonra, (ya da cam lameller olmadan) kuyunun alt kapak her bir 300 ul yıkama ortamı ekleyin vakumla su çıkarın. poli-D-lizin kaplama kurumasına izin vermeyin.
3. Hücre inkübatör dört tabak dönün. Plakalar dağınık hipokampal nöronlar hazırlanır kez kullanıma hazırdır.

Enzimatik sindirme 5. tam kültür ortamı içinde hazırlanması ve Tripsin Çözeltisi

1. malzemeler (Malzeme) karıştırarak 60 ml Komple Kültür ortamı hazırlayın. iki adet 50 ml konik tüp içine tam kültür ortamı filtre bir 0.2 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtresi ile birleştirilmiş bir 50 ml şırınga kullanın. Her tüp 30 mL tam kültür ortamı içerir.
2. Ayrı bir 50 ml konik tüp, ~ 30 mi yıkama ortamı (Malzeme) ve 37 ° C'ye kadar ısıtmak ekleyin. Bu enzimatik sindirimden sonra doku yıkamak için kullanılır.
3. enzimi sindirimi ortamı hazırlayın. 15 ml konik tüp, 4.5 mi yıkama ortamı ve 0.5 ml% 2.5 tripsin solüsyonu ve 50 ul 100X DNase ilave
4. Tam kültür ortamı, yıkama ortamı yerleştirin ve 37 ° C su banyosu içinde sindirim ortam enzim.

Cerrahi Araçlar 6. hazırlanması

1. Bir sterilizasyon kese tüm cerrahi aletleri sterilize: iki küçük makas, forseps bir çift ve iki 5. cımbız.

Hippocampi E16.5-E17.5 Fare Embriyolar ve Diseksiyon gelen Brain 7. Kaldırma

1. Hazırlama iki adet 10 cm'lik petri buz soğukluğunda steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile doldurulmuş kaplar.
2. (Bir hacme ~ 0.5 ml, 100 mg / kg), sodyum fenobarbital ile karından bir enjeksiyonla fare baraj öldürülür. baraj ayak tutam yanıt kaybeder kez enjekte edildikten sonra, servikal dislokasyon ile kurban.
3. % 70 etanol ile baraj karın alan sprey, ve ortaya çıkarmak için karın orta hat boyunca 2 cm uzunluğunda kesi yapmakrahim.
4. embriyolar çıkarın ve soğuk kesme HBSS tamponu ile 10 cm çapında bir Petri tabağına bağımsız olanlar yerleştirin.
5. Bir forseps kullanarak boynundan embriyo tutun ve beyin dokusu üzerinde beyincik düzeyi ve bölümünün altında orta hatta ilk kesim doğru yapmak için küçük bir makas kullanın. embriyoyu başını kesmek yok.
   1. tüm yol embriyonik beynin rostral kısmından, açık kesilerek kaudal bölgede küçük makas sağ tarafı ucu takın (çapraz orta hat yok) ve kafa tabanı düzeyinde sol tarafında bir kesim yapmak.
   2. Sağ tarafta bir kesim yapmak için tekrar sola yan makas ucu takın. tüm beyin kolay çıkarılması için bir kenara saygısız böylece, rostral sonunda kesilmemiş kafatası kemik ve cilt dokusunun dar bir bant bırakın.
   3. HBSS çözeltisi içine embriyonik beyin oymak için makas ucu kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında beyin kontrol edin. Beyin hiçbir brüt kesme o ile sağlam olmalıdırff bölgeler.
   4. Tüm embriyo beyinleri toplamak için bu adımları tekrarlayın.
6. 20 ml soğuk HBSS tamponu içeren yeni bir petri tüm bozulmamış beyin toplayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında petri yerleştirin.
7. ventral taraftan beyin görüntüleyin. kaudal ucunda forseps ile beyin basılı tutarken, orta rostral noktası ve kaudal-temporal bölge arasında bir kesim yapmak için çapraz keskin 5. cımbız yerleştirin. diğer yarımkürede için bu işlemi tekrarlayın. Beyin sapı dokuların geri kalanından bozulmamış hipokampus ile ayrı iki hemisfer kestikten sonra.
   1. beyinleri her biri için bu işlemi tekrarlayın.
8. tüm disseke hemisferlerin havuz ve 5. cımbız iki çift kullanarak meninksler kaldırmak.
9. temporal lob içinde katlanmış kavisli bir yapı olarak gelişen hipokampus tanımlayın. kortikal dokuları bitişik hipokampus ayırmak için cımbız iki çift alternatif. Toplayın ve tüm hippocam havuzpi doku (Şekil 1).

Tek Nöronlar içine ayrı 8. Enzimatik Sindirim,

1. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, 15 ml konik bir tüp içinde% 0.25 tripsin + 1X Dnaz I ile 5 ml yıkama ortamı içeren enzimatik sindirim çözeltisi içine tüm parçalara hippocampi aktarın.
2. Bir su banyosu içinde Tüp ve her 5 dakikada bir kez tüpün kesikli yumuşak invertli, 25 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
3. 25 dakika sonra, dikkatli bir şekilde aspire edilerek bir el pipet kullanılarak enzim çözeltisi çıkarın. 10 ml ılık Yıkama orta ekleyin ve yavaşça yavaşça tüpü 5 kez ters yüz edilerek doku yıkayın. Yıkama ortamı çıkarın ve ilave bir yıkama için tekrar 10 mi yıkama ortamı ilave edin.
4. Yıkama ortamı çıkarın ve tekrar taze sıcak Yıkama orta 3 ml ekleyin. dokudan sindirilmiş nöronlar çıkarmak için elle sıkı 15 kez tüp sallayın. Orta Hücreler, bir kez bulanık bir hale gelmelidirYıkama ortamı içine dokudan ayrılır yeniden. tüp içinde kalan doku bırakırken, yeni bir 15 ml konik bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu toplanır.
5. dokuya bir 2 mi yıkama ortamı ekleyin ve yavaşça ~ 15 kat için plastik bir pipet ile öğütülerek kalan doku ayırın. 5 dakika bekletin. 'Shake-off' hücreleri toplanır içeren yeni 15 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu Havuz.
6. Bir hemasitometre ile nöronların yoğunluğunun sayın. Tipik haliyle, mikrolitre başına 3.000-5.000 hücre parçalara embriyo sayısına bağlı olarak elde edilebilir. Altı embriyolar varsayılarak kesilir ise 2.5 x 10 ⁷ nöronların arasında ortalama bir sayı olduğu tahmin edilmektedir.
7. 30 mi kadar tam kültür ortamı ilave edildiğinde 250.000 nöron / ml'lik bir yoğunluğa elde etmek için, bu hücre süspansiyonunun gerekli hacmi hesaplayın. Yüksek yoğunluklu nöron kaplama ortam elde edilmesi için, 30 ml komple kültür ortamı içeren iki konik boruların biri için bu hacim.
8. başka bir 30 ml için bu yüksek yoğunluklu nöron çözeltisi Aktarım 1.2 mi tam kültür ortamı ~ 10,000 nöron / ml'lik bir konsantrasyon elde edilir. Düşük yoğunluklu lamelleri tohum Bu seyreltme kullanın.

Nöronlar ve Uzun Vadeli İşbirliği kültürünün 9. Kaplama

1. Hücre kültürü davlumbaz içine yüksek yoğunluklu nöronların kazınmış tabanları iki 24-kuyu tabak getirin. vakum ile 300 ul önkoşulu orta çıkarın. 250.000 nöron / ml 0.6 ml yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonları Plate.
2. kültürü kaputu içine lamelleri ile diğer iki 24-kuyu plakaları getirin ve vakum ile 300 ul önkoşulu orta kaldırmak. İki 24 oyuklu plakalar içinde lamelleri 10.000 nöron / ml'de Levha 0.6 mi düşük yoğunluklu hücre süspansiyonları.
3. inkübatör dört 24 oyuklu plakalar döndürür. 2 saat bekletin.
4. yüksek yoğunluklu kültürü nöronlar kalarak düşük yoğunluklu lamelleri çevirin. Nöronlar (yani, n birbirine bakacak emin olun) Cam lamel ile ayrılmış ot. Daha sonra inkübatör ko-kültürü ile iki tabak döndürür.

10. Co-kültür Sürdürmek

1. Diğer birçok çalışmalarda bildirilen orijinal Komple Kültür ortamı% 50 çıkarmak gerek yoktur 5. in vitro (DIV) 'de günde (Malzeme bakınız) 300 ul taze Besleme orta ekleyerek ortak kültürleri besleyin. besleme ortamı, aynı zamanda 15 uM sitosin arabinosid (ARA-C, 5 um bir son konsantrasyon elde etmek üzere), glia kirlenme ve çoğalma şansını en aza indirmek için içerir.
2. Bu ilk beslenme ardından, her hafta kuyuya Ara-C olmadan 300 ul taze Yem orta ekleyin. Kültür birden fazla ay boyunca tutulmalıdır (DIV33 ilk ve orta yarım değiştirme ile) bir ay zaman noktasında ötesinde her hafta taze Yem orta orta yarısı değiştirin. Morfolojik olarak, yüksek ve düşük dansiteli nöronlar hem yukarı üç ay (exper tarafından gözlemlenen en uzun süre sağlıklı görünüyorsunimenters).

Deneysel Manipülasyon-düşük yoğunluklu Nöron Transfeksiyon 11. İllüstrasyon

Not: Düşük yoğunluklu nöronlarında transfeksiyon istendiğinde, basit bir kalsiyum fosfat protokolü kullanılabilir. Bu düşük yoğunluklu kültürleri DIV12 önce kalsiyum fosfat işlemi daha da transfeksiyon randımanına sahip olduğunu bulduk, ancak bu süre boyunca dendritik dikenler belirgin DIV21 veya daha büyük, çok daha düşük verimlilik ile transfekte edilebilir. kültürlenmiş düşük yoğunluklu nöron transfeksiyonu fizibilitesi bir pEGFP-C3 plasmidi ile transfekte nöronların gösterilmiştir (aşağıya bakınız).

1. DIV21 da eş-kültür, her kuyudan orta Koşulları 600 ul çıkarın ve yeni bir 24 oyuklu plakaya transfer. Sonra geri orijinal hacminin getirmek için ko-kültür için 600 ul taze Yem orta ekleyin.
   1. orta durumunu 600 ul yeni 24-iyi plaka içine lamelleri aktarın. emin olundüşük yoğunluklu nöronlar yukarı bakacak şekilde. yüksek yoğunluklu plakaları ve inkübatör geri lamelleri ile yeni tabak yerleştirin.
2. İki 1.5 ml steril tüpler hazırlayın. bir tüp içinde, 600 ul 2X HEPES tuz (HBA) çözümü tamponlu ekleyin. plazmid konsantrasyon dayalı 12 mikrogram pEGFP-C3 DNA hacmini hesaplayın. Diğer tüp içinde, 74 ul _CaCl2 (2 M stok) ve plazmid ekledikten sonra 600 ul yapacak su hacmi ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve daha sonra plazmid DNA ekleyin. Yavaşça iyice karıştırın. Her iki tüpler oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
3. 2X HBS tüpü elle tutma ve orta bir mikserde çözüm ajite ederken, 600 ul 2X HBS tüpüne damla DNA _CaCl2 çözüm damla ul 600 tüm ekleyin. Oluşan çökelti, 'ince kum "granül şeklinde olmasına özen gösterilmelidir. daha muhtemel büyük 'kar flake' benzeri çökeltileri üretecek beri çok güçlü ve çok hızlı karıştırma, yüklenebileceğini arzu değildirh bizim gözlemlerine dayalı önemli ölçüde daha düşük transfeksiyon verimine sahiptir.
4. Çökelti, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta oluşturulması için devam edelim.
5. lamelleri düşük yoğunluklu nöron içeren her bir kuyunun 100 ul çökelti ekle, eşit damla ve damla. Plakaları kuluçka makinesine geri dönün ve 2 saat süreyle inkübe edin. _CaCI2 en varsayarak bu uzun süreli kuluçkadan sonra nöronlar için toksik olabilir, ~ 17.6 mM Ca2 ⁺ konsantrasyonda sonuçlanır serbest formdadır.
6. , ~ 50 ml yıkama ortamı ile 50 ml konik tüp hazırlanır, 37 ° C'ye ısıtın.
7. 2 saat sonunda, davlumbaz içine çökelir DNA, kalsiyum fosfat ile düşük yoğunluklu nöron getir. keskin 5. cımbız ile her lamel Pick up ve kısaca yıkamak için 50 ml Yıkama ortamında bunu üç kez batırın. Sonra düşük yoğunluklu nöronlar aşağıya bakacak şekilde, özgün ko-kültür plakaları yüksek yoğunluklu nöronlar iade.
8. kadar kültür Devamlamelleri düşük yoğunluklu kültür nöronları etütlerin yapılması için alınır.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol besleyici tabakası olarak hizmet eden glial hücreler gerek olmadan başarılı ultra düşük yoğunluklu saf glutamaterjik nöronların uzun dönemli kültür sağlar. Protokol bu ayrı ayrı (poli-D-lizin kaplı cam lameller üzerine) (24 kuyu kaplanmış poli-D-lisin ile) yüksek yoğunluklu hazırlanmasını ve düşük yoğunluklu nöronları içeren, Şekil 1 'de diagramed, ve daha sonra eş-kültür edilir üç aya kadar muhafaza edilmelidir.

Tartışma

Serum içermeyen koşullar altında, ultra düşük yoğunluklu hipokampal glutamaterjik nöronların uzun süreli kültür için ayrıntılı bir protokol mevcut. ~ 2000 nöronlar / cm ^2, yoğunluk ya da mevcut literatüre ^2,3,11,13,14 tarafından bildirilen glia desteği olmadan en 'düşük yoğunluklu' kültür hazırlıkları kat daha en az iki düşüktür at. ultra düşük yoğunluklu olmasının yanı sıra, bu protokol, yeni ve iki yönden önemlidir. düşük yoğunluklu nöronlar yakın fiziksel temas içinde olan yüksek yoğunlu...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nörobazal ortam	Yaşam Teknolojileri	21103-049	Işıktan koruyun
B27 takviyesi	Yaşam Teknolojileri	17504-044	alikot, 0.6ml boyutunda saklayın
GlutaMAX-I	Yaşam Teknolojileri	35050-061	seyreltik 100X
antibiyotik-antimikotik (AA)	Yaşam Teknolojileri	15240-096	seyreltik 100X
Komple Kültür ortamı			1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I ile nörobazal ortam
Nörobazal ortam' ile aynı	yıkama ortamı
1X B27 takviyeli Nörobazal	ortamı
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	MW'de 100X stok hazırlayın
			70000-150000
borat tamponu	Sigma-Aldrich	B6768 (borik asit); 71997 (boraks)	1.24g borik asit ve 1.9g boraks 400ml H2O, pH ila 8.5 HCl 12
mm yuvarlak cam lameller	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 cam, Carolina Biological Supply'den satın alın
proFection transfeksiyon kiti	Promega	E1200	ayrıntılar için
protokole bakın2X HEPES tamponlu salin (HBS)	Promega	E1200	ayrıntılar için protokole bakın
Şırınga filtresi	Pall Corporation	4192	0.2um gözenek boyutu
Transfeksiyon dereceli plazmit DNA	endofree plazmit hazırlık kiti	Qiagen	12362
	MAB3418	millipor,	klon AP20
anti-p-Tau antikoru	Millipore	AB10417	tavşan poliklonal antikoru
anti-NR1 antikoru	Millipore	MAB1586	fare antikoru, klon R1JHL
anti-GluR1 antikoru	Millipore	AB1504	tavşan poliklonal antikoru
Hank'in dengeli tuz çözeltisi	ThermoFisher	14025092	500ml boyut