Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

11K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53814

⸱

10 Mart 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

Bu makalede

Özet

Bu yayın, çocuklardan nazal epitel mukozasının başarılı bir şekilde örneklenmesi ve kültürlenmesi ve bu hücrelerin indüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için yöntemleri göstermektedir.

Özet

Nazal epitel hücreleri (NEC'ler), hava yollarının hava kirleticilerine yanıt veren kısmıdır ve solunum yolu virüsleri ile enfekte olmuş ilk hücrelerdir. Ayrıca doğuştan gelen bağışıklık tepkileri ve bağışıklık ve hava yolu stromal hücreleri ile etkileşimleri yoluyla birçok hava yolu hastalığında rol oynarlar. NEC'ler, klinik ziyaretler sırasında erişilebilirlikleri nedeniyle çocuklarda yapılan çalışmalar için özellikle ilgi çekicidir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) birden fazla hücre tipinden üretilmiştir ve insan gelişimini ve hastalığını modellemenin yanı sıra rejeneratif tıptaki potansiyel uygulamaları için güçlü bir araçtır. Bu, araştırma amacıyla pediatrik katılımcılardan türetilen NEC'lerden iPSC'lerin başarılı bir şekilde üretilmesi için yöntemler ortaya koyan ilk protokoldür. Çocuklardan nazal epitel hücrelerinin nasıl elde edileceğini, bu örneklerden birincil NEC kültürlerinin nasıl oluşturulacağını ve birincil NEC'lerin iyi karakterize edilmiş iPSC'lere nasıl yeniden programlanacağını açıklar. Burun mukozası örnekleri, çocuklarda hava kirliliğinin etkileri ile ilgili epidemiyolojik çalışmalarda faydalıdır ve hava yolu hastalığını incelemek için önemli bir araç sağlar. Birincil burun hücreleri ve bunlardan türetilen iPSC'ler, astım ve KOAH araştırmaları da dahil olmak üzere hava yolu epitel biyolojisinin çeşitli alanlarında hastaya özgü araştırmalar için sınırsız materyal sağlamak için bir araç olabilir.

Giriş

insan örneklerinde (hiPSCs) den uyarılmış pluripotent kök hücreler kök hücre araştırmalarının bir hızla gelişen teknolojidir. Onlar çok daha az etik ve ahlaki sakıncaları 1,2 ile embriyonik kök hücre (hESC) araştırma bir alternatif sunuyoruz. Bunlar HESC 3-5 epigenetik özdeş olmayan, ancak hiPSCs gelişimi ve hastalığın fenotipleri modellemek için benzersiz bir yol sunar, ve hastalık durumunun 5-8 ilgili dokulardan elde edilebilir. Üreten hiPSCs yeni yöntemler sürekli transplantasyon için uygun GMP kalite iPSCs hazırlamak ve aynı zamanda yeniden programlama sürecinin 6,9-11 zamanında ve verimliliği artırmak için bir yol olarak, başlamak için en uygun hücre tiplerini belirlemek için araştırılmaktadır.

Havayolu epitel hücreleri allerjik inflamasyon 12 gelişiminde kritik ve epitel Immun ile etkileşim yoluyla alerjik tepkiler ve havayolu yeniden önemli bir sürücüE ve stromal hücreler. solunum yolu epitel Kalkış ve astım gibi akciğer hastalıklarının kalıcılığı önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, alt solunum yolu epitel hücreleri, özellikle sağlıklı kontrol ve çocukların, bir klinik ortamında elde edilmesi zordur. Hava kirliliği ve alerjenlere karşı tepkileri okuyan özellikle birkaç çalışmalardan elde edilen veriler, burun mukozasından epitel hücreleri alt solunum yolu epitel hücreleri 13-20 için geçerli ve pratik vekil olduğu öncül desteklemektedir. Burun mukozası% 90'dan fazla kirpikli hava yolu epitel hücreleri oluşur ve diğer hücre / doku örnekleme tekniklerine göre daha az invazif ve olduğu gibi bu burun epitel hücreleri (UEM) örnekleme kolayca yaş dört ya da beş gibi küçük çocuklarda yapılabilir enfeksiyon 20-23 gibi olumsuz olayların en az risk ile ilişkili. Bu, uzun gereksiz ve sıklıkla ağrılı bronkoskopi procedu olmadan sağlıklı ve hastalıklı çocuklara hem de örnek bir hızlı ve basit bir yol sunuyorsedasyon gerektiren res. Daha önceki çalışmalar, astım şiddeti ile ilişkili bir hastalık alt tipleri burun mukozası gibi astım çocuklardan alınan bronş hücre numuneleri hem de ayırt edilebilir olduğunu bulduk, ve iki doku tipleri arasında gen ekspresyonu olmayan yerde gen 22 yaklaşık% 90 benzer olan 24. iPSCs için bir kaynak olarak, UEM diğer sık ​​kullanılan hücre türleri üzerinde avantajlar sağlar. Fibroblastlar genellikle iPSC üretimi için kullanılan, ancak bu hücreler kolayca cilt biyopsisi kültüre olabilir, ancak, bu süreç genellikle lokal anestezi, bir kesi ve dikişler gerektirir ve enfeksiyon bazı riski ile ilişkilidir. Bu nedenle, biyopsi bu tip hastaların bilgilendirilmiş onayını aldıktan 25 zor olabilir. fibroblastlar için bir alternatif periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) 'dir. Bununla birlikte, çocuk hastalar arasında iPSC oluşturulması için yeterli derecede kan elde etmek zor olabilir. Buna ek olarak, alt-AP sınırlamalar vardırfibroblast ve kan hücresi kaynaklı iPSCs, belirli hücre tipleri 5,26 özellikle kendi farklılaşma kapasitesi komplikasyonların. Bu nedenle, nispi erişilebilirlik ve kendi koleksiyonu aşağıdaki yan etkileri düşük riski göz önüne alındığında, UEM pediatrik popülasyonların gelen iPSC nesil için ideal bir hücre kaynağını temsil etmektedir.

iPSCs yeni hastalık modelleri, insani kalkınmayı okuyan üretmek için bir platform olarak son zamanlarda ilgi çok aldı ve kişiselleştirilmiş tedaviler için hücrelerin potansiyel bir kaynağı olarak var. Bu teknolojinin tam potansiyelini fark edilebilir önce yeniden programlama sürecinin moleküler temellerinin açıklanması gerekir, ama şimdi bu protokol ve içinde belirtilen usuller havayolu maruz odaklanmış araştırmalar ışık tutacaktır için, yanı sıra bir platform sağlamak iPSCs içeren kişiselleştirilmiş tıp etkilerini araştırmak.

Birkaç laboratuarları işbirlikçi çalışma Generatio yol açmıştırburun mukozasının örnekleme değil, aynı zamanda UEM kültürlenmesi ve iPSCs 23 bu hücrelerin yeniden programlanması sadece için başarılı bir teknik n. Bu makale optimum örnekleme, kültürleme ve yeniden programlama koşulları için bir protokol bir özeti verilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıdaki protokol kurumları insan araştırma etik komitesinin kuralları takip eder.

1. Burun mukozasının Örnekleme

NOT: viral solunum yolu enfeksiyonu belirtileri ücretsiz konulardan örnekler alın.

  1. katılımcı ziyareti öncesinde bir 15 ml konik taze hazırlayın ve 2 ml Begm (Bronş Epitel Hücre Büyümesi Orta) artı 20 ul steril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (% 0,01) ekleyin.
  2. Açık sitoloji sadece örnek almadan önce fırça ve steril fırça tutmak için emin olun ve burun yüzeyleri dışında herhangi bir yüzeye dokunmayın.
  3. Hala oturup tavana doğru kafasını eğmek için katılımcı isteyin. küçük ya da daha fazla huzursuz çocuklar ellerinde oturmak ve / veya uzak fırça swatting önlemek için yatarken.
  4. geçit daraltır (küçük kara delik gibi görünüyor) burun arkasındaki fırça yöneltin. aşağı fırça kaydırın ve fırça Nostri kaldırılır olarak bileklerini büküml.
  5. konik fırça yerleştirin ve Begm daldırın. Fazla fırça kesti ve tüp kapağını kapatın. VORTEKS DO NOT.
    NOT: katılımcı istekli ise, aynı şekilde ancak ikinci burun deliğine ikinci fırça edinin. Her iki burun deliklerinin bir fırçalama Edinme örnekleme başarılı olacaktır daha yüksek bir olasılıkla sonuçlanacaktır. Aynı burun deliği Örnekleme kanama neden olabilir ve büyük olasılıkla örnek iyileştirmek değil.
  6. ılık su ile bir beher kullanarak taşıma sırasında mümkün olduğunca 37 ° C kadar yakın örnekleri tutun.

2. Hücre Sayımı ve sitospin

  1. Yavaşça Begm fırçayı ajite ve hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı için örnek 10 ul alır. canlı / ölü leke 10 ul ekleyin ve sadece mikroskop altında hücrelerin canlı saymak.
  2. örnek 50 ul almak ve 1 x PBS ile 200 ul'ye seyreltilmiş. 2 dakika boyunca 300 rpm'de cam slayt ve spin bağlı Sitospin huni ekle. followin kuru O / N ve leke slayt slayt edelimg üreticinin talimatlarına. tercihen karanlıkta, O / N kurumaya bırakın.
  3. Hema 3 Stain ile Leke Slide
    1. Her solüsyonu (; Hema 3 Çözüm I, pembe, Hema fiksatif, açık mavi ve Hema 3 Çözüm II, mavi derinlik) aktarın boyama kabına; Kullanılmadığı zaman kapalı tutun. slayt boyama tekne içine slaytlar ekleme
    2. Daldırma slaytlar sürekli 30 sn için sabitleyici olarak, daha sonra fazla drenaj sağlar. Daldırma 30 sn için, daha sonra fazla drenaj sağlar Çözüm sürekli olarak kayar. Dip daha sonra fazla süzülmesini bekleyin, 30 saniye boyunca sürekli Çözüm II slaytlar
    3. Su berrak bitene kadar deiyonize su ile durulayın. Karanlıkta, tercihen O / N kurumaya bırakın
  4. epitel hücrelerinin yüzdesini belirlemek, mikroskop ve sayım hücreleri altında slayt bak. örnekleme iyi ise% 90 veya daha fazla olmalıdır.

3. Tohum Hücreler

NOT: Uygun ve sertifikalı doku kültürü tüm hücre kültürü prosedürlerini yürütmekdavlumbaz steril tekniği kullanarak.

  1. Sığır dermal kolajen (BDC) ile kaplayın plakaları, tip 1 49.5 mi 1 x PBS içinde seyreltilmiş, 3 mg / ml BDC 0.5 ml ilave edilir. sadece bir kaç plakaları kullanılacak olursa az hazırlayın. Kat 2 saat boyunca 37 ° C 'de, bir T25 2 mi BDC şişe ve steril bir başlık O inkübe / N veya gerekirse.
  2. İnkübasyondan sonra, herhangi bir geri kalan sıvı aspire. steril bir muhafaza içinde 30 dakika, UV ışığına şişeler Açığa. ama bir ay kadar 4 ° C Mağaza şişeler, hücrelerin ekim önce C RT getirmek ya da 37 °.
  3. Tohum için hazır olana kadar 37 ° C'de Begm fırçayı ve hücreleri tutun. Yavaşça homoseksüel konik içinde fırça, ancak girdap yok.
    1. Plaka, bir T25 şişesi içinde 7 x 10 5 hücre. az olması durumunda, daha küçük bir kap, bir 6-yuvalı plaka gibi bir de kullanmak. Bu boyut plakası yaklaşık 3 x 10 5 hücre gerektirir.
      NOT: Bu birçok hücre yoksa, o devam etmek tavsiye edilmez.
  4. steril Kaputun altında, tüp ve ge dışına fırça almakntly kaplama kazımak için dikkatli olmak, kaplanmış balonun yüzeyi üzerinde fırça döndürün. uygun bir biyolojik tehlikeli atık kabına fırça atın.
  5. Yavaşça konik dışına ve T25 balona Begm kalan hücrelerin pipetle. mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Dalgalı bir hücre sayısı görülmektedir ve bu aşamada (Şekil 3A) olarak uygun olan burun, çıkan toz olabilir.

4. Hücre Kültürü

  1. Hücrelerin ekim sonra, onları kesinti olmadan 48 saat (Şekil 3) razı olsun. 48 saat sonra, yavaş yavaş ve hafifçe 2 ml sıcak Begm ve steril Penisilin / streptomisin / Fungizone (P / S / F) 20 ul ekle.
    NOT: Medya orijinal 2 ml aspire ETMEYİN.
  2. Tohumlama sonra 4. gününde, dikkatlice sıvı aspire ve taze 4 ml ile değiştirin, Begm artı 1x Pen / Strep (fungizon artık gerekli değildir) ısındı. Her iki gün medya değiştirin ve takmak için hücreleri değerlendirmekment, büyüme ve izdiham. Hücreler ulaştığında ~% 80 izdiham, genellikle 2-3 hafta içinde, onlar pasajlanır hazırdır.
  3. Bir T25 şişesi (yaklaşık 2.5 x 10 6 hücre olduğunda konfluent), üç T25 şişelerinde ya da bir T75 şişesi içine geçişli olabilir. İlk geçişten sonra, hücreler her üç günde bir kaynaşmaya eriştikten, sağlam ve sağlıklı olmalıdır.

5. Pasajlanması Hücreler

  1. Yavaşça plakadan medya aspire. yaklaşık 4 dakika için inkübatör plaka ve yere T25 şişesi başına 1 ml% 0.05 tripsin solüsyonu ekleyin veya hücreler plaka ayrılana kadar. hücrelerin her 2 dakikada bir dekolmanı seviyesini kontrol edin ve daha uzun 10 dk tripsin bırakmayın.
  2. enzimi etkisiz hale getirmek 5 ml Tripsin Giderici Çözüm (TNS), ya da serum içeren medya ekleyin. 15 ml konik tüp içinde şişesi ve yerden tüm sıvı ve hücreleri çıkarın.
  3. 5 dakika boyunca 200 x g'de (hızlanma 0 yavaşlama 0) Santrifüj, bir hücre peleti elde edilmiştir. aspire SupernaYeni şişelere için gerekli olan hacimde S Begm bölgesindeki + U / tant ve tekrar süspansiyon hücreleri (T75 şişeye bir T25 şişesi 4 mi, 10 mi)
  4. (2.1) yukarıda açıklandığı gibi bir ölü / canlı boya ile hücre sayımı gerçekleştirin. kaplanmış şişelere Begm ve hücrelerin uygun miktarda ekleyin ve inkübatör dönmek. Yukarıda detaylı Bakım veya ml başına 0.5-2 x 10 6 hücre konsantrasyonunda ortam (% 70 Begm,% 20 FBS ve% 10 DMSO) dondurma cryopreserve.

iPSCs 6. yeniden programlanması

NOT: iPSCs oluşturmadan önce, nesil ve insan iPSCs kullanımını düzenleyen tüm kurumsal düzenlemelere uyumu sağlamak. Kültür ortamı rutin antibiyotik içermeyen steril bir teknik, iPSC kültürleri için özellikle önemlidir. UEM sağlıklı görünen ve sağlam başarılı yeniden programlama için proliferatif olduğu önemlidir.

  1. Plaka 6 gözenekli bir doku kültürü plakasının oyuk başına 5 x 10 5 UEM. 24 saat sonra, polybrene eklemeBegm için ortama Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc ifade lentiviral partikülleri ilave edilmiş 8 ug / ml transdüksiyonu UEM bir nihai konsantrasyona seyreltildi. ~ 5 27 enfeksiyonu (İçişleri) çokluğu sağlamayı hedefliyoruz.
    1. İçişleri Bakanlığı belirlenmesi için, konsantre-lentiviral stokunun seri dilüsyonları hazırlamak ve bu seyreltmeleri ile HT1080 hücreleri nakletmek. HT1080 hücrelerinde dTomato ifadenin ilk tümden algıladıktan sonra, dTomato-pozitif hücre / her seyreltme hücrelerin küçük kümeleri sayısını puanlama "ml transducing birim /" sayısını hesaplamak.
      NOT: Genellikle, çok yüksek dilüsyonları (her şey dTomato pozitif) ve çok düşük (yok ya da pozitif hücrelerin sadece bir çift) olacaktır.
    2. hücrelerin ayrı ayrı pozitif hücreler / küçük kümeleri tespit edildiği dilüsyonları puanlama gerçekleştirin. Uygun seyreltme faktörü ile birim / ml transducing sayısını düzelterek titresi belirlemek. İB, sonra sayısına oranıdırvirüs partiküllerinin 27 sayısına hücreleri transdüse.
      NOT: Her dTomato pozitif hücre / küçük yığın, tek bir virüs partikülü kaynaklandığı varsayılmaktadır.
  2. Yaklaşık 3 saat sonrası transdüksiyon, medyayı çıkarın ve taze Begm ile değiştirin. kurumsal onaylı prosedürler kullanılarak lentivirüs içeren ortam atın. 3 gün için kuluçka makinesine geri kalıt UEM dönün.
  3. 3 gün, taze Begm ile medyayı değiştirmek ve daha sonra başka 3 gün kuluçkaya yatmaktadır. Aspire medya, 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve iyice 1 ml% 0.05 tripsin çözüm ekleyin geçirdi. Tripsin ile Passage hücreleri (Bölüm 5) Yukarıdaki yazılı olarak. Dikkatle 4 ml Begm + P / S supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. Hücreler, işlem bittikten (bir sonraki adıma bakınız) BDC ile kaplanmış bir 6 yuvalı plaka yeni bir oyuğuna geçişli veya MEF kültürlere ilave edilebilir.
  4. MEF kaplı tabak hazırlayın. 4. günde () +/- Thiazovivin (SPT yerine adım 6.6 kadar) de bir 6 2 oyuklarına (1 ml / oyuk) ve% 0.1 jelatin çözeltisi ilave edilir. Bir sonraki ongün, inaktive MEFS 28 bir şişe çözülme.
  5. MEF ortamı (DMEM + 1 x NEAA +% 10 dFCS) 10 ml MEFS yerleştirin. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj pelet. MEF medyada süspanse. Aspire 6 plaka jelatin ve jelatin kaplı 6 plaka oyuk başına 1.87 X 10 5 MEFS ekleyin. 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe ya da 24 saat içinde en az.
  6. Begm Devri 2 mi önceden kaplanmış 6 plaka 2 kuyulara oyuk başına hücreleri transdüse ve / nO inkübe içeren. Bir sonraki gün, 4 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü ihtiva eden, standart HESC ortam oyuk başına 2.5 ml Begm değiştirin. taze hESC medya ile hücrelerin besleyin +/- SPT 10 gün boyunca günde
    NOT: Bu UEM 23 etkinliği ve yeniden programlama kinetiğini arttırmak için küçük moleküller (SB431542, PD0325901 ve Thiazovivin (SPT) kokteyli) oluşan bir karışımla ilave edilmesi mümkündür.
  7. On gün sonra, SPT olmadan HESC ortamını kullanarak günlük beslemeye devam ediyor. hESC benzeri koloniler kadar günlük kültürleri beslemek(Şekil 5A, P0 koloni) görünür. sitoplazmik oranı ve belirgin nükleol: yüksek çekirdeği tarafından varsayılan iPSCs barındıran koloniler belirleyin.
  8. hESC benzeri morfolojisi ile manuel olarak tüketim ve transfer koloniler bir besleyici içermeyen sistemde ayrı satır olarak kültür ve genişleme için kuyu ayırmak için. Eksize koloniler bu koşullara hızla adapte edilmelidir.
    1. kaplama eksize koloniler sonra bu ayrık varsayımsal iPSC hatları artık geçit 1 (p1) olarak kabul edilir. Günlük mTeSR1 ile yem kültürleri. Passage ve standart prosedürler kullanılarak iPSC hatları genişletmek. p1 koloniler onlar pasajlanır edilmesi gereken büyüklüğe ulaşması için bir hafta birkaç gün sürebilir.

7. Kültür iPSCs bakımı

  1. Yem ve günlük kültürleri değerlendirir. El ile özel tüketim alanları steril bir cam pipet veya mikro pipet ile kazıyarak açık farklılaşma sergileyen. Günlük toplama sonra ortamı değiştirin.
  2. Passage hücreleri approxima sonrately her dört günde: yavaşça aspire ortam, 6-çukurlu bir tablaya (yarısı besleme hacmi) oyuk başına 1 mi, sıcak Dispase (1 mg / ml) ekleyin, sonra yaklaşık 4 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kolonilerin kenarları kolonisi etrafında beyaz bir anahat gibi görünüyor, hangi kaldırmaya başlayacaktır. Yavaşça Dispase aspire ve ısıtılmış DMEM / F12 ile 3x yıkayın.
  3. 2 ml mTeSR1 ekleyin ve plaka koloniler kaldırmak için bir hücre kaldırıcı kullanmak. koloniler küçük kümeler halinde kırılmış kadar yavaşça hücreleri çiğnemek için 5 ml serolojik pipet veya P1000 mikropipet kullanın.
    1. sağkalım ve daha sonra proliferasyon optimal olacak şekilde, çok küçük bir küme veya tek üreten hücrelerin kaçının. koloniler yeniden kaplama yaparken, 1: 4 ile 1: 6 bölünmüş optimum koloni yoğunluğu koruyacaktır. Yavaşça plaka koloniler ve ortamı çıkartın ve yeni, Matrigel kaplı kuyucuklara ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burun girişinde adı burun ilk kısmı, kıkırdak 29 ile alandır. Fırça burun valfi (ostium iç dünyasıyla, ya da Nare arkasında görülen "kara delik") ötesinde, burun bu alandaki geçmiş sorunsuz gitmek gerekiyor, ve örnek alt konka (Şekil 1) elde edilir. Burun konkalar, burun 29 yüzey alanını arttırmak örnekleme için onları ideal bir konuma yapma kemiksi yapıları vardır. Alan da yakından alt solunum yollarının balataları benzer ve çevresel maru...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burun epitel hücreleri (UEM) havayolu hastalığı eğitimi için erişilebilir bir platform olup, NEC-iPSCs hastalık geliştirme, tedavi ve terapi 1,31,32 keşfetmek için heyecan verici bir cadde sunuyoruz. UEM kolayca stresli ya da potansiyel olarak zararlı prosedürler 6,23 olmadan elde edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, bu protokol açıklandığı gibi nazal mukozanın örnekleme daha az stresli ve daha iyi çocuklar için kan toplama daha algılanan gibi görünüyor. Bu nedenle, bu yöntem havayolu hastalıkla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar Pluripotent Kök Hücre Tesisi ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Konfokal Görüntüleme Çekirdek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ve 2U19AI70235 (GKKH) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 ml konikFisher Scientific14-959-49DProtokolü Adım 1.1.
BEGMLonzaCC-3170Protokolü Adım 1.1.
Penn/Strep/FungisitYaşam Teknolojileri15240-062Protokolü Adım 1.1.
Penn/StrepYaşam Teknolojileri15140-122Protokolü Adım 4.a.
cytosoft sitoloji fırçasıFisher Scientific22-263-357Protokolü Adım 1.2.
tripan mavisiFisher ScientificMT-25-900-CIProtokolü Adım 2.1.
hemasitometreFisher Scientific02-671-54Protokolü Adım 2.1.
PBSFisher ScientificBP2438-4Protokolü Adım 2.2.
Sitoloji Huni KlipsleriFisher Scientific10-357Protokolü Adım 2.2.
cytospin hunisiFisher Scientific23-640-320Protokolü Adım 2.2.
Cytospin 4Fisher BilimselA78300003Protokolü Adım 2.2.
boş slaytFisher ScientificS95933Protokolü Adım 2.2.
hema 3 leke kitiFisher Scientific22-122-911Protokol Adım 2.2.
Sığır Dermal Kolagen, tip 1Yaşam TeknolojileriA1064401Protokolü Adım 3.2.
T25 şişesiFisher Scientific08-772-45Protokol Adım 3.3.
TrypsinLonzaCC-5012Protokolü Adım 5.2.
Tripsin Nötralize Edici ÇözeltiLonzaCC-5002Protokolü Adım 5.2.
Fetal Sığır Serumu (FBS), 65 ° C'de ısıyla sterilize edilmiş; 30 dakika için CSigma-AldrichF2442Protokolü Adım 5.5.
Dimetil sülfoksit Hybri-Max™, steril filtreli, BioReagent, hibridoma için uygun, &; %99.7Sigma-AldrichD2650Protokolü Adım 5.5.
polisistonik lentivirüs*ör MilliporeSCR511Protokolü Adım 6.4. 
Ticari bir yeniden programlama vektörü kaynağı listelenmiştir. Voelkel ve arkadaşları (PMID: 20385817) tarafından bildirilen 4'ü 1 arada plazmidi rutin olarak VSV-G-psödotipli polisistronik yeniden programlama lentivirüsünü kurum içinde oluşturmak için kullanıyoruz. Bu plazmit ile iletişime geçilerek elde edilebilir 
polibreneSanta Cruz Biyoteknolojisc-134220Protokolü Adım 6.4.
Işınlanmış CF1 MEF'lerGlobalStem GSC-6301GProtokolü Adım 6.4.
hESC ortamıAdım 6.11'deyer alan tarife bakın
SB431542Stemgent04-0010Protokolü Adım 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006Protokolü Adım 6.11.
Tiazovivin Stemgent04-0017Protokol Adım 6.11.
hESC nitelikli MatrigelBD Biosciences354277Protokolü Adım 6.13.
Corning plakası, 6 kuyuluFisher Scientific08-772-1BProtokolü Adım 6.13.
mTeSR1Kök Hücre5850Protokolü Adım 6.13.
250 ml tek kullanımlık filtre şişesi (0.22 & mikro; m)FisherSCGP-U02-RE 
dispaseStemCell7923Protokolü Adım 7.3.
DMEM/F12Yaşam Teknolojileri11320-033Protokol Adım 7.3.
hücre kaldırıcıFisher Scientific08-100-240Protokolü Adım 7.4.
hESC Ortamı**Protokol Adım 6.11.
bileşenleri karıştırılmalı ve ardından filtre ile sterilize edilmelidir. Medya 4 & derecede tutulabilir; İki haftaya kadar C. Ortamı ısıtırken 37 ° C'de bırakmayın; C 15 dakikadan daha uzun
DMEM-F12 50/50 medyaInvitrogen  11330-032Son Konsantrasyon
KO replasman serumu (KO-SR)İnvitrojen10828-0280.2
200 mM L-glutaminInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-merkaptoetanolInvitrogen21985-0230.1 mM
100x esansiyel olmayan amino asitlerInvitrogen11140-0501x
2 &mikro; g/ml Bazik-Fibroblast Büyüme Faktörü (b-FGF)İnvitrojen13256-0294 ng/ml
Protokol .

Kaynaklar

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076(2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Primer H cre K lt rLentiviral Transd ksiyonYeniden Programlama ProtokolPediyatrik Havayolu rneklemesihESC BesiyeriMEF KaplamaKoloni Geni letmeBesleyici H cresiz Sistem
Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.