Yöntem makalesi

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

DOI:

10.3791/53818

⸱

28 Mart 2016

 ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotostimülasyon, biyolojik olayları mükemmel uzamsal ve zamansal çözünürlükle kontrol etmenin invaziv olmayan bir yoludur. Doğal ortamlarında eksprese edilen endojen proteinleri foto-regüle etmek için yeni yöntemler istenmektedir. Burada, genetik olarak kodlanmış doğal olmayan bir amino asit (Uaa) kullanarak bir nöronal proteinin işlevini doğrudan nöronlarda optik olarak kontrol etmek için bir yaklaşım sunuyoruz. Kehribar kodonunu baskılamak için ortogonal bir tRNA/aminoasil-tRNA sentetaz çifti kullanılarak, foto-reaktif bir Uaa 4,5-dimetoksi-2-nitrobenzil-sistein (Cmn), içe doğru doğrultucu bir potasyum kanalı olan bir nöronal protein Kir2.1'in gözeneğine spesifik olarak dahil edilir. Hacimli Cmn, kanal gözeneğini fiziksel olarak bloke ederek Kir2.1'i iletken hale getirir. Işık aydınlatması, Cmn'yi anında daha küçük bir doğal amino asit Cys'ye dönüştürerek Kir2.1 kanal fonksiyonunu aktive eder. Bu photo-indüklenebilir inward r ektifiyeedici potasyum (PIRK) kanallarını sıçan hipokampal primer nöronlarında ifade ediyoruz ve PIRK'nın ışık aktivasyonunun, aktive edilmiş Kir2.1 kanallarından K + akımının dışarı akışı nedeniyle nöronal ateşlemeyi durdurduğunu gösteriyoruz. Utero elektroporasyon kullanarak, embriyonik fare neokorteksinde in vivo olarak PIRK'yı da eksprese ediyoruz ve neokortikal nöronlarda PIRK'nın ışık aktivasyonunu gösteriyoruz. Genetik olarak kodlayan Uaa, hedef protein tipine veya hücresel konuma herhangi bir kısıtlama getirmez ve farklı doğal amino asit kalıntılarını modüle etmek için bir fotoreaktif Uaas ailesi mevcuttur. Bu nedenle bu teknik, beyindeki farklı süreçlerin optik regülasyonunu sağlamak için genel olarak birçok nöronal proteine uygulanma potansiyeline sahiptir. Mevcut protokol, moleküler düzeyde nöronal protein aktivitesinin foto kontrolünü sağlamak için in vitro ve in vivo nöronlarda karmaşık Uaa katılımı için erişilebilir bir prosedür sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldığında, photostimulation örneklerinin fizyolojik sisteme en az müdahale ile daha zamansal ve uzamsal çözünürlük sunuyor. 1971 1 nöronların teşvik etmek lazerler kullanarak gösteri yana birçok yaratıcı yollar dışsal olarak ışık ile nöronal aktiviteyi kontrol etmek icat edilmiştir. Photocaged agonistlerin Optik sürümü uzun ligandlar 2,3,4 nöronal ağ fizyolojik yanıtı incelemek için kullanılır olmuştur. Bu teknik sayesinde kafesli agonistlerin difüzyon özgünlüğü sınırlıdır. Genetik özgünlüğü ektopik ifade ışığa duyarlı opsin kanalları ile elde ve 5,6,7 pompalar ve başarıyla çeşitli model organizmaların seçilen nöron ağları modüle uygulanmıştır edilir. Bununla birlikte, diğer proteinlere opsin proteinlerden photoresponsiveness aşılama için, optik olarak çeşitli diğer nöronal proteinlerin kontrol etmek için bu yöntemi uygulamak zor olacaktır olacağını gerÇalışmanın altında proteinin doğal özelliklerini değiştirebilir yoğun mühendislik gerektiren d. Kimyasal olarak bir proteine ​​bir ekzojen ışığa ligand kanal proteinlerinin 8,9,10 işlevselliğini kontrol etmek için başka bir yol göstermiştir hayvan zinciri. Ligand sunulan veya azobenzen yarımının fotoizomerleşme yoluyla protein bağlama sahasına geri çekilir. Bağ kimyası hücre tarafı ve hücre içi proteinleri hariç temel olarak zar proteinlerinin hücre dışı tarafına uygulanmasını kısıtlar.

Işığa duyarlı UAAS, proteinler dahil edildikten sonra, ışık proteinleri işlemek için genel bir strateji sunar. Photocaged UAAS kendi yapı-işlev ilişkilerinin 12,13,14 ileri düzeyde tanıyorsanız membran reseptörleri ve iyon kanalları 11, içine UAAS dahil etmek Xenopus oosit içine mikroenjeksiyon edildi erken çabalarında, tRNAs kimyasal asile.Bu mikroenjeksiyon yaklaşım esas olarak büyük oosit ile sınırlıdır. Bir UAA'nın Genetik birleşme canlı hücreleri 15,16,17,18 endojen protein çeviri yoluyla UAA içeren bir dikey tRNA / sentetaz çifti kullanarak tRNA asilleme ve mikroenjeksiyon teknik açıdan zor atlar. Nöronal proteinlere UAA birleşme birincil nöronlar ve nöral kök hücreler 19,20 ortaya konmuştur. Daha yakın zamanda, ışığa cevap UAA genetik ilk kez 21 in vivo memeli beyninde nöronal protein içine dahil edilmiştir. Bu gelişmeler kendi ana hücresel ortamda UAAS ile nöronal proteinler incelemek mümkün kılar.

Içe doğru doğrulan potasyum kanal Kir2.1 hücre dışına daha içine daha kolay K + akımları geçer güçlü bir doğrultucu olduğunu ve hücre uyarılabilirliği, damar tonusu, kalp atım hızı, yeniden dahil fizyolojik süreçleri düzenleyen esastırnal tuz akışı ve insülin 22 bırakın. Kir2.1 overekspresyonu az uyarılabilir 23,24 olur hedef nöron, membran potansiyelini hiperpolarize. Optik olarak doğal hücrelerde Kir2.1 kontrol etmek için, Kang ve diğ., Genetik olarak Kir2.1 bir foto-duyarlı bir UAA memeli hücreleri, nöronlar ve embriyonik fare beyinleri 21 olarak ifade dahil. ışık kısa bir darbe böylece hedef Kir2.1 proteini aktive doğal bir amino asit Cys içine UAA dönüştürmek mümkün oldu. Bu foto-uyarılabilir içeri doğru rektifiye potasyum (Pirk) kanal proteini sıçan hipokampal primer nöron ifade edildiğinde, ışık aktivasyonuna yanıt olarak nöronal ateşleme bastırılır. Buna ek olarak, Pirk kanalı embriyonik fare neokorteks ifade edildi ve kortikal nöronlar ışık aktif Pirk akımı ölçülmüştür. Memeli beyninde in vivo UAA teknolojisinin başarılı bir şekilde uygulanması optik nöronal proteinleri kontrol etmek için kapıyı açarkendi doğal ortamında, moleküler düzeyde nöronal işlemleri ve mekanizmalarının optik diseksiyon sağlayacak olan.

Bu protokolde, kültür ve in vivo olarak embriyonik fare beyninde primer nöronlara UAAS genetik dahil edilmesi için işlemleri açıklar. ışığa cevap UAA CMN ve Kir2.1 sürecini göstermek için kullanılır. Yöntem başarılı UAA katılmasını ve sağlanan nöronal protein aktivitesinin optik kontrolünü değerlendirmek için. Bu protokol, genetik olarak nöronlar ve in vivo UAAS kodlayan ve optik da ışığa UAA ile nöronal protein fonksiyonunu düzenlemek için açık bir kılavuz sağlar. Biz bu protokol nörobilim ve optogenetic biyolojik çalışmalar için in vivo UAA teknolojisinin benimsenmesini kolaylaştırmak için bekliyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut çalışmada tüm işlemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Biyolojik Araştırmalar, The Salk Enstitüsü, La Jolla, CA hayvan taşıma için protokolleri onayladı kullanılarak yapıldı

1. UAA Kir2.1 Şirketleşme ve İlköğretim Nöronal Kültür Sonuç Pirk İfadesi

  1. DNA İnşaat
    1. UAA katılması için Kir2.1 bir hedef site seçin. Işığa cevap UAA Incorporated ile seçilen sitesi Kir2.1 fonksiyon 21 optik modülasyon sağlar, böylece Kir2.1 yapısı ve fonksiyonu hakkında ön bilgi ve bilgi Exploit.
    2. TAG amber durdurma kodonunun mutasyona seçilen site ile bir rekombinant DNA şifreleyen Kir2.1 gen yapısı. Bir memeli ifade plazması içine Kir2.1-Tag DNA klonlamak için standart klonlama teknikleri 25 kullanın.
    3. UAA için spesifik olan ve tepki olarak UAA dahil Klon tRNA / sentaz genleriBaşka bir memeli ifade içine TAG durdurma kodonu 21 plazmid.
      Not: iyi UAA dahil için, (tRNA, sentetaz ve Kir2.1 için), farklı promoterler ve gen kasetlerinin kombinasyonları, değişik plazmid test edilebilir.
    4. miniprep kullanarak yüksek kaliteli plazmid DNA'lar elde veya üreticinin protokolüne göre ticari kitler Maxiprep. 260/280 oranı 1.9 etrafında saflaştırılmış DNA için en uygunudur. Gerekli olduğunda, prepped DNA 25 saflığını kontrol etmek için bir agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin. yüksek saflıkta, süper plazmid DNA'lar nöronal transfeksiyon için en iyisidir.
  2. Kültür Sıçan Hipokampal İlköğretim Nöronlar
    1. Talep cam lamelleri (daireler, 12 mm çapında) 24 oyuklu plakalar içerisinde, her bir ilgili bir lamel ve kaplama her bir 0.5 mg, 250 ul / ml poli-D-lisin (100 mM borat tamponu: 1.24 g borik damıtılmış iyonu giderilmiş 400 ml asit ve 1.90 g sodyum tetraborat H2, O ya da GKD 2 O) sızdırmaz. yavru başına yaklaşık 10-12 kaplı lamelleri hazırlayın.
    2. Diseksiyon gününde, izofluran ile anestezi ve decapitating sonra doğum sonrası sıçan yavrularında (1-4 doğum sonrası gün) yenidoğan beyinleri toplamak. izofluran (% 2-4) ihtiva eden bir Anesthetization odası içinde yavrular anestezisi. Onlar bilincini kaybeder ve dokunsal uyaranlara ve pençeleri kısma yanıt vermeyen kadar bekleyin.
    3. Standart teknik kullanımı 26 (~ 37 ° C), tuzlu su (10 mM HEPES ve Hank dengeli tuz çözeltisi içinde 20 mM D-glukoz), sıcak beyin hippocampi incelemek ve 4.5 ml ılık salin ile konik bir tüp içinde hippocampi toplamak .
    4. Hipokampuslardan (% 0.25 son tripsin konsantrasyon)% 2.5 tripsin 500 ul ekleyin ve 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde 10 dakika inkübe edilir.
    5. İyice tuzlu su (3 x 10 mi) ile öğüterek ile doku yıkayın.
    6. 1 ml w ayrışmış nöronlar kurtarma% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş en az temel ortam (MEM) içeren bir kolu büyüme ortamı, 21.2 mM D-glukoz, 2 mM L-glutamin,% 2 B-27 ve% 0.1 serum uzatıcı içermektedir.
      Not: yeni büyüme ortamı hazırlamak için diseksiyon gün L-glutamin ve B-27 ekleyin.
    7. Bir hemasitometre ile nöronların sayın ve 1.0-1.5 x 10 5 hücre 24 oyuklu plakalarda lamelleri üzerine bunları plaka / oyuk 500 ul büyüme ortamı ile yoğunluğu sonra 40 um naylon elekle filtrelenmiştir.
    8. % 5 CO2 içinde 35 ° C 'de nöronal kültür inkübe:% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka 2-3 hafta. En iyi sonuç için, inkübasyon sırasında mümkün olduğunca kültürü rahatsız etmemek.
  3. İlköğretim Nöronal Kültür kalsiyum fosfat (Ca-P) Transfeksiyon
    1. 4 ° C'de stok çözelti ve mağaza sağlayın: 0.5 M BES (N, N-bis [2-hidroksi-etil] -2-aminoetansülfonik asit) diretkeni (10x); 150 mM Na-2 HPO 4 (100x); 2.8 M NaCI (10 x); Steril GKD 2 O; Steril 1 N NaOH.
    2. Transfeksiyon gününde, 0.22 um filtre ile GKD 2 O taze 2.5 M CaCI2 çözeltisi ve steril filtre edin. 0.22 um filtre ile pH 7.00 (NaOH ile pH ayarlanır) ve steril filtre 50 mM BES, 1.5 mM Na 2 HPO 4 ve 280 mM NaCI ihtiva eden taze 2x BES tamponlu tuz (BBS) tampon sağlayın.
      Not: transfekte edilecek CaCl2 çözeltisi ve lamelleri sayısına bağlı olarak BBS tampon miktarını hesaplayın. Ayrıca 1.3.4 bak.
    3. 500 ul taze önceden ısıtılmış transfeksiyon büyüme ortamı ile kültür büyüme ortamı değiştirin. (Transfeksiyon ortamı MEM artı 21.2 mM D-glükoz ile yapılabilir).
      Not: eski medya atmayın.
    4. GKD 2 O miktarını hesaplayın ve 1.65 ul CaCl2, 0.7 ug DNA ve 16.5-ihtiva eden transfeksiyon solüsyonu (her lamel başına 33 ul) yapmak için eklemek için hazırlamak# 181; l 2x BBS.
    5. Kültür eklemeden hemen önce transfeksiyon solüsyonu hazırlayın. Yavaş yavaş tüp çalkalanırken hazırlamak için, öncelikle CaCl2 ve GKD 2 O birleştirir. solüsyon içine DNA eklemek yavaş yavaş ajitasyon devam edin ve. ajite ederken Son olarak, 2x BBS tampon damla damla ekleyin.
    6. Hemen nöronal kültür her lamel transfeksiyon solüsyonu 30 ul ekle.
    7. 45 dakika-1 saat boyunca bir% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka makinesinde: çözelti karışımı ve% 5 CO2 içinde 35 ° C de inkübe etmek kültür kabı birkaç kez sallayın. nöronlar transfeksiyon solüsyonu ile inkübe edildikten sonra, çok ince bir Ca-P çökeltiler nöronlar kapsayan bir tabaka oluşturmak olacaktır.
    8. 500 ul önceden ısıtılmış yıkama tamponu (135 mM NaCI, 20 mM HEPES, 4 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, pH 7.3, 10 mM glukoz, steril transfeksiyon ortamı yerine 0.22 um'lik bir filtreden süzüldü) ve 35 inkübe6; C,% 5 CO 2: 15-20 dakika boyunca% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka makinesinde. Ca-P çökeltiler yıkama adımından sonra yok olur.
    9. 500 ul taze büyüme ortamı ile yıkama tamponu değiştirin. Yine, kaydedilmiş orijinal medya ile büyüme ortamı değiştirin.
    10. 1 mM nihai konsantrasyon elde etmek kültür (50 ul, sıcak büyüme ortamı içinde önceden karıştırılmış) UAA CMN ekleyin.
    11. % 5 CO2 içinde 35 ° C 'de, transfekte kültürü inkübe:% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka deneylerinden önce 12-48 saat.
  4. Işık Aktivasyon ile tüm Hücre Kaydı
    1. Ekstra / hücre içi çözümler hazırlayın. Hücre-içi solüsyon 135 mM potasyum glukonat, 10 mM NaCI, 2 mM MgCI2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2.56 mM K 2 ATP ve pH 7.4'te 0.3 mM Li 2 GTP içerir. Hücre dışı kayıt çözeltisi, 150 mM NaCI, 3 mM KCI, ihtiva eden 5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM glukoz, pH 7.4, 10 mM HEPES.
    2. Tam hücreli yama sıkma için elektrofizyoloji teçhizat ayarlayın: mikroskop 4X ve 20X hedefleri, diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve mCitrine filtresi ile donatılmış (: 495/10 nm, emisyon: eksitasyon 525/25 nm); manipülatör; patch-kelepçe amplifikatör; sayısallaştırıcı; veri toplama ve analiz yazılımı.
      1. 45 ° 'lik açıyla 1 cm uzakta odak noktasına ışık sunmak için teçhizat mikroskop ile 385 nm emisyon ile bir ışık yayan diyot (LED) yükleyin. hafif bir güç metre ile LED gücünü kontrol edin.
    3. 3-6 MQ pipet direncine sahip olması ticari bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam elektrotlar yama pipetler çekin. mikropipet çektirmenin kurmak için üreticinin talimatlarını izleyin.
      1. pipet direnci test etmek için, öncelikle hücre içi solüsyonu ile pipet doldurmak ve elektrot tutucu üzerine yerleştirin. mikroskop p yerleştirilen hücre dışı solüsyonu ile dolu bir 35 mm kültür çanak pipet, Diplatform. Bir devreyi tamamlamak için çanak içine bir toprak elektrot batırın.
      2. amplifikatör / sayısallaştırıcı açın ve bir veri toplama yazılımı başlatın. Bir zar test protokolü ile pipet direnci izleyin.
    4. inkübatör nöron kültürü bir lamel çıkarın ve hücre dışı çözeltide kez yıkayın. Vakum gres kullanarak, taze hücre dışı solüsyonu ile dolu bir 35 mm kültür çanak ortasında lamel basılı tutun.
    5. elektrofizyoloji mikroskop platformu üzerinde lamel / çanak yerleştirin.
    6. Standart yama sıkma teknikleri kullanılarak, mCitrine floresan 27 ile bir nöron yama. Geçerli kelepçesini (I-kelepçe) yöntemi kullanılarak Tutanak nöronal aktivitenin. İlk olarak, küçük bir akım enjekte edilerek etrafında -72 mV dinlenme potansiyelini ayarlayın. Ardından, aksiyon potansiyelinin sürekli ateş (5-15 Hz) ikna etmek için bir adım akımı (10-200 pA) enjekte edilir.
    7. El ile ya da veri toplama yazılımı kullanarak, bir darbe flaş (bir günahnöron LED ışığı 100 milisaniye -1 sn süresi) ve gle darbe kayıt ve aksiyon potansiyelleri etkilenen olmadığını görmek ise.
    8. Banyo için 0.5 mM BaCl 2 ekleyin ve aksiyon potansiyelleri kurtarıldı olmadığını kontrol edin.

2. UAA Kir2.1 Şirketleşme ve In Vivo Fare Embriyonik Beyin Sonuç Pirk İfadesi

  1. DNA İnşaat
    1. Adım 1.1 gibi benzer plazmid DNA tasarlayın. In vivo ekspresyon için, örneğin CAG (CMV arttırıcı tavuk beta-aktin promoteri) gibi güçlü bir promoter kullanımı.
    2. üreticinin protokolüne uygun olarak bir endotoksin içermeyen maksi ticari kit ile DNA saflaştırılır. (2-5 mg / ml kondanse) son derece yüksek kaliteli DNA elde etmek için etanol ile çökeltme 25, ardından fenol-kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin.
  2. Fare Embriyonik Neokortekse utero elektroporasyon
    Not: Temel Techniutero elektroporasyon için que önce 28 tarif edilmiştir.
    1. sodyum pentobarbital (intraperitoneal enjeksiyon, gram vücut ağırlığı başına 50 mg) veya izofluran (inhalasyon,% 2-4) ile embriyonik gün 14.5 (E14.5) bir zaman aşımına hamile fare anestezisi. bilinç kaybı ve dokunsal uyaranlara yanıt kontrol ederek ve pençelerinin sıkıştığı anestezi derinliği izleyin.
    2. Karın orta hat küçük bir kesi yapmak. Yavaşça forseps ve parmak uçları ile rahim boynuzları maruz kalmaktadır.
    3. rahim duvarı içeri sokulan bir cam pipet ile, her yavru yanal ventrikül içine 1 ul DNA çözeltisi (her plazmid 2-5 ug / ml, yapısına göre) enjekte edilir. Pek çok durumda, toplam embriyoların yaklaşık% 60-80 enjekte edilir.
    4. Bir Elektroporatör (33-35 V, 50 msn süresi 950 msn aralık, 4-8 bakliyat) ile embriyolar electroporate.
    5. için hafifçe karın boşluğuna rahim boynuzları dönmekceps ve parmak uçları. kas duvarını dikin ve daha sonra cerrahi sütür ile cilt embriyoların gelişimi devam etmesi için.
  3. UAA Mikroenjeksiyon
    1. E16.5 tekrar karın orta hat küçük bir kesi yapmak ve yavaşça forseps ve parmak uçları ile rahim boynuzları maruz kalmaktadır.
    2. Elektroporasyona yan veya rahim duvarında sokulan bir cam pipet ile lateral ventrikül her iki taraf için yaklaşık 2-5 | il CMN-Ala (500 mM) enjekte edilir. In vivo 21 Kazablanka teslim dipeptit CMN-Ala (CMN-alanin) kullanın CMN biyoyararlanımını arttırmak için.
    3. Yine, forseps ve parmak uçlarınızla hafifçe karın boşluğuna rahim boynuzları geri dönün. kas duvarını dikin ve daha sonra cerrahi sütür ile cilt embriyoların gelişimi devam etmesi için.
  4. Akut Beyin Dilimler elde
    1. 119 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.3 mM MgCI2, 2.5 mM CaC ihtiva eden 1 L'lik yapay serebrospinal akışkan (ACSF) yapmak 2, pH 7.3 1 mM NaH 2 PO 4, 26.2 mM NaHCO 3 ve 11 mM glükoz.
    2. 20-30 dakika boyunca -80 ° C'de 200 mi ACSF ve hızlı dondurma al. Kabarcık% 5 CO 2 ile ACSF kalan:% 95 O 2 gazı, oda sıcaklığında.
    3. Hazırlayın ve embriyoların beyinleri hasat cerrahi aletler sterilize. Ayrıca bir kova buz hazırlamak.
    4. bir mikrodalga içinde ısıtılarak bir şişe içinde ~ 100 mi% 4 düşük erime noktasına sahip agaroz çözeltisi olun. katılaşmaya başlamadan önce yaklaşık 5 dakika boyunca çözelti önce soğumaya.
    5. CO 2 doz aşımı ile CMN-Ala enjeksiyonundan sonra fare 12-24 saat euthanize. Karın alanda büyük kesiler yapmak ve ince makas ve forseps ile rahim Electroporated / microinjected embriyoların teşrih.
    6. ince makas ve forseps ile embriyoların hasat beyinleri.
    7. buz kovası yerleştirilen 10 cm kültür çanak her beyin yerleştirin. Keskin bir bıçak kullanarak iki hemisfer bölün ve her yeryemeğin dibini dokunmadan midsagital uçağı ile yemeğin üzerine yarımkürede. Çabuk (yarımkürede başına 500 ul civarında) beyinleri üzerinde agaroz çözüm dökün.
    8. Keskin bir bıçak kullanarak, kare bir beyin gömülü agaroz blok yapmak için bir beyin çevresinde agaroz kesti.
    9. doku yapıştırıcısı kullanarak, vibratome için bir montaj üzerinde agaroz bloğunun midsagital düzlem yüzeyi aşağı tutkal. Önceden soğutulmuş ACSF vibratome odasına doldurun ve 200 mikron sagital beyin dilimleri kesti.
    10. % 95 O 2 gaz:% 5 CO2 ile kabarcıklar ise 42 dakika boyunca 33 ° C'de 3 mM miyo -inositol, 0.4 mM askorbik asit ve 2 mM sodyum piruvat ile takviye edilmiş ACSF akut dilimleri inkübe edin.
    11. 42 dakika sonra, ısıtıcıyı kapatın ve köpürme ile oda sıcaklığında dilim inkübe devam ediyor. ısıtıcı kapattıktan sonra tüm hücre yama kaydetmeye en az 15 dakika başlatın.
  5. Işık Aktivasyon ile tüm Hücre Kaydı
    1. InTrac hazırlayın130 mM potasyum glukonat, 4 mM MgCI2, 5 mM HEPES, 1.1 mM EGTA, 3.4 mM Na-2 ATP, 10 mM sodyum fosfat, kreatin ve KOH ile ayarlanmış pH 7.3 0.1 mM Na-3 GTP ihtiva ellular çözeltisi.
    2. 3-6 MQ pipet direncine sahip olması ticari bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam elektrotlar yama pipetler çekin.
    3. tam hücreli yama sıkma için dilim elektrofizyoloji teçhizat kurmak ve 2 ml / perfüzyon pompası ile en az oranda ACSF kayıt odasına superfuse. yaklaşık 33 ° C'ye odası sıcaklığını ayarlamak.
      Not: Dilim elektrofizyoloji teçhizat bir perfüzyon odasının, bir suya daldırma objektif ve bir sıcaklık kontrolörü ile donatılmıştır. Ayrıca, GFP filtresi (uyarma: 480/30 nm, emisyon: 535/40 nm) ve mCherry filtre (uyarma: 580/20 nm emisyon: 675/130 nm) gereklidir.
      1. Bir 45 ° 1 cm uzakta odak noktasına ışık sunmak için teçhizat mikroskop ile 385 nm emisyon LED yükleyinaçısı. hafif bir güç metre ile LED gücünü kontrol edin.
    4. Dikkatle perfüzyon odasında bir cam pipet ve yer ile bir beyin dilim almak. Bir harp ile dilim basılı tutun.
    5. Neokortikal bölgeden 27 MCherry / GFP floresan ile bir nöron yama. Gerilim kelepçesini (V-kelepçe) yöntemini kullanarak kayıt Pirk etkinliği. İlk olarak, -60 mV membran potansiyeli tutun. Ardından, sabit negatif membran potansiyelleri (-100 mV) veya voltaj rampaları (40 mV -100 mV) rekor akımları. Özellikle, -100 mV Kir2.1 belirli içeri doğru akımlar izlemek.
    6. El ile ya da veri toplama yazılımı kullanarak, kayıt sırasında nöron LED ışık darbe (100 milisaniye -1 sn süresi, tek bir darbe) yanıp söner ve Pirk proteinleri aktive olmadığını görmek. Pirk aktive edildiğinde, -100 mV'de içeri doğru akımlar önemli ölçüde artacaktır.
    7. Banyo için 0.5 mM BaCl 2 ekleyin ve Pirk yeniden inaktive olup olmadığını kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

genetik olarak nöronların bir proteinin bir UAA birleştirmek için birinci önemli bir adım, uygun bir gen sunar ve nöronlarda etkin genleri ifade etmek yapıları tasarlamaktır. UAA dahil edilmesi için, üç genetik bileşen vardır: (1) UAA dahil (2) mutasyona uğramış TAG durdurma kodonu tanımak için bir ortogonal tRNA, ve (3) bir ortogonal aminoasil için seçilen yerinde ortaya TAG amber durdurma kodonu ile hedef genin -tRNA sentetaz dik tRNA üzerine UAA şarj etmek için. Her bir bileşen, uygun...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkili fotoğraf modülasyon elde etmek için, önemli ilk adımdır nerede hedef protein ışığa cevap UAA'yı dahil etmek karar vermektir. hedef proteinin yapısal ve işlevsel bilgiler aday sitelerin seçimi rehberlik çok yararlıdır. Aynı zamanda, hafif yönetmeliğin amacı en uygun hangi site belirleyecek. Aday siteleri seçtikten sonra, biz birincil nöronlar ve in vivo geçmeden önce İnsan Embriyonik Böbrek (HEK) kolay kültür ve manipülasyon için hücreler gibi memeli hücre hatlarında siteleri test etmek için tavsiye e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöron kültürü ve Ca-P transfeksiyonu hakkındaki yararlı tartışması için Dr. S. Szobota'ya teşekkür ederiz. LW, Salk İnovasyon Hibesi, California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (RN1-00577-1) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (1DP2OD004744) destek alır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kapak Camları, Daireler, 12 mm, Kalınlık 0.13-0.17 mmCarolina Biologicals633029
Corning BioCoat Poly-D-LysineCorning Discovery Labware354210
D-(+)-Glikoz çözeltisiSigma-AldrichG8769
İris Spatula KavisliGüzel Bilim Aracı10092-12
Diseksiyon Bıçağı - İnce Açılı UçGüzel Bilim Aracı10056-12
GlutaMAX-I TakviyesiYaşam Teknolojileri35050-061
MITO+ Serum GenişleticiBD Biosciences355006
Falcon 40 & m Hücre SüzgeciCorning Yaşam Bilimleri352340
BES ( N, N< / em>-Bis (2-hidroksietil) -2-aminoetansülfonik asit, N, N< / em>-Bis (2-hidroksietil) taurin)Sigma-AldrichB6420
LED IŞIK KAYNAĞI – Siyah LED 385Prizmatix Ltd.
Agaroz, Düşük Erime Noktası, Analitik SınıfPromegaV2111

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kir2 1 KanalFoto nd klenebilir PIRKHipokampal N ronlarn Utero ElektroporasyonKalsiyum Fosfat TransfeksiyonuI k Aktivasyonu

İlgili makaleler