Method Article

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma İn Vitro

DOI:

10.3791/53823

⸱

March 19th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Transfusion Research Center, Belgium Red Cross-Flanders, 2Blood Service, Belgium Red Cross-Flanders, 3Department of Public Health and Primary Care, Catholic University of Leuven, 4Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Ghent

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombosit transfüzyonu ve hemostazı, kan bankacılığı trombositlerinin işlevini araştırmak için kan sulandırma ve mikroakışkan akış odaları kullanılarak modellendi. Veriler, trombosit depolama lezyonunun in vitro olarak hemostaz üzerindeki sonuçlarını göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfüzyon için hazırlanan kan trombositleri, depolama sırasında yavaş yavaş hemostatik fonksiyonlarını kaybeder. Trombosit fonksiyonu, çeşitli (dolaylı) in vitro deneyler kullanılarak araştırılabilir, ancak bunların hiçbiri mikroakışkan akış odaları kadar kapsamlı değildir. Bu protokolde, trombosit transfüzyonunu simüle etmek için trombositopenik taze kanın depolanmış kan bankası trombositleri ile sulandırılması kullanılır. Daha sonra, sulandırılmış numune, açıkta kalan subendotelyal matriks proteinleri üzerindeki hemostazı taklit eden mikroakışkan akış odalarına perfüze edilir. Kan bağışı, taşınması, bileşen ayrımı, depolama ve patojen inaktivasyonunun etkileri eşleştirilmiş deneysel tasarımlarda ölçülebilir. Bu, kan bileşeni hazırlamadaki her manipülasyonun hemostaz üzerindeki etkisinin güvenilir bir şekilde karşılaştırılmasını sağlar. Sonuçlarımız, sıcaklık döngüsünün, kayma hızlarının, trombosit konsantrasyonunun ve saklama süresinin trombosit fonksiyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. Sonuç olarak, bu protokol kan bankası trombositlerinin işlevini analiz eder ve bu sonuçta flebotomi, taşıma, bileşen hazırlama, depolama ve transfüzyon dahil olmak üzere işleme zincirinin optimizasyonuna yardımcı olur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemostaz kısıtlı zamanmekansal bağlamda 1 hücreleri, proteinler, iyonlar ve dokuların kombine ve düzenlenmiş aktivite gerektirir. Kontrolsüz etkinliği kan pıhtılaşması ile ilgili bozuklukların bir spektrum içinde kanama ve tromboz ve morbidite ve mortaliteye neden olabilir. Bir mikroakışkan akış odası deneyi in vitro hemostazisi taklit zorlu bir tekniktir. Bu yaklaşım, kan trombositlerin için öncü bir role sahip hemostaz katılan süreçlerin karmaşık etkileşimin soruşturma sağlar.

vasküler hasar ardından, trombositler, kan kaybını önlemek için maruz subendotelyal matris (gliko) proteinlere yapışır. Yapışma ardından, trombositler aktive ve yanıt olarak agrega matik ve nihayet bir trombosit ağının oluşumu, fibrin tarafından stabilize ve bir firmaya neden neden parakrin sinyal için, trombüs 2 sızdırmazlık yara. Diğer çoğu trombosit fonksiyon testleri, deney aksineAkış odaları ile ments dikkate kan akımının fiziksel parametre ve bu nedenle katılımcı hücreler ve biyomoleküllerin 3,4 tarihinde reolojinin etkisini alır.

Akış odası deneyleri yapışkan matrisi, reoloji ve akış profilleri, hücresel kompozisyon, toksinler veya ilaç, iyonik kuvvet ve daha birçok varlığı da dahil olmak üzere süreçler hemostatik (alt) etkileyen önemli parametreler değiştirilerek hemostaz ve tromboz dönüm noktası anlayışlar yarattı. Son yirmi yılda, büyük örneklem hacimleri (10-100 ml) gerektiren düşük verim akım odası deneyleri mikroakışkan odaları genellikle küçük paralel plaka odadan oluşan ve kontrollü duvar kesme koşullarında 5 de tam kan perfüze için modern teknolojiyi dahil etmek gelişmiştir. donanım kurulum basitleştirilmiş ve daha az (kan) hacmi gereklidir çoğunlukla nedeniyle Microscaling önemli ölçüde deneme daha erişilebilir ve Versati render tahlil verimi arttıle. Örneğin, küçük laboratuar hayvanlarından kan Böylece hayvanlar kurban gerek kalmadan kullanılabilir. Genetiği değiştirilmiş farelerin kan örnekleri böylece hemostaz teşvik veya inhibe anahtar moleküller belirlenmesinde ve yeni temel anlayışlar 6 yardımcı olmaktadır.

Özel araştırma laboratuarları çoğu hala yazılım tarafından blueprinted edilebilir Baskılı kalıplara polimerize polidimetilsiloksan (PDMS) 7 den, örneğin özel yapılmış akış odaları kullanın. Ortaya çıkan odası, ucuz tek kullanımlık ve kolayca post hoc analizi için demonte edilebilir. Ayrıca, temelde gemiler de dahil olmak üzere bifurkasyonlarında veya keskin dönüşler herhangi bir tasarım komutu üzerine inşa edilebilir. Bu avantaj da standardizasyon zaten akış odası deneyleri ile birincil sorun bu yana olumsuz ve PDMS özel odalar bu destekli değil yaptı. Bu belirli bir sorunun üstüne kaplama (şartlar), floresan probları, antikoagülan, geçici üzerindenumune alma ve analiz arasındaki kısa süreli olarak ve zaman tüm kötü 8 standardize edilmiştir. Bu değişkenlerin Standardizasyon zorlu ama yine de laboratuarlar arasında sonuçların karşılaştırılmasına olanak gerekmektedir. Bu konu Biorheology 9,10 Bilimsel ve Standardizasyon alt komite Tromboz ve hemostaz üzerine International Society önemli bir konudur.

Trombosit konsantreleri (PC) trombositopeni ve / veya kanamaya neden çeşitli hastalıklardan mustarip hastalarda transfüzyon. Ama PC trombositler özellikle depolama süresinin 11 işlevinde, duyarsız bilinen bir bozulma süreci yaşlanma ve yaygın olarak trombosit saklama lezyon olarak anılacaktır bağlantılı. Bazen bu tür plateletler kez 12 transfüzyon dolaşımda geri iddia edilmektedir, ancak bunun için kanıt azdır. Ayrıca, bir PC oluşturan trombosit işlevselliği rutin test değil çünkü bu tür tahliller arasındaki ilişkiterapötik ya da profilaktik etkisi açık 13'tür. Mikroakışkan akış odaları toplama ve ihracı arasındaki manipülasyonlar zincirini optimize etmek için PC trombosit fonksiyonlarını araştırmak için bir araç sunuyoruz. Biz daha önce 14,15 yayınlanmış ve burada tarif edildiği gibi PC doğrudan (eşli) karşılaştırmalar için güçlü bir araştırma aracıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan numuneler üzerinde araştırmalar için kurumsal etik kuralları takip ve bilgilendirilmiş onam ilgili tüm vericilerden elde edildi. Burada tarif edilen deneyler için onay Antwerp Üniversitesi Hastanesi kurumsal inceleme kurulu elde edilmiştir.

Not: belirtilmediği sürece Sıcaklık göstergeleri, her zaman oda sıcaklığı vardır.

1. Hazırlık Akış Odası Kurulumu

  1. Hazırlama Lanes, Boru ve iğneler
    1. Vorteks kuvvetli bir şekilde kollajen süspansiyonu ve 50 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar sağlayıcı tarafından sağlanan izotonik glikoz çözeltisinde 1/20 seyreltin.
      Not: Biz esas olarak tip I fibriller oluşur, at tendon kollajen kullanın. At kollajen tip I sık sık "Horm" kolajen olarak adlandırılır ve tarihsel yanı sıra biyolojik nedenlerle hem tahlil 9 bu tür altın standardı mesafesindedir. İnsan tip III kollajen de kullanılabilir, ancak inci edilebilire daha az kat fibrillerinde ve trombosit cevabı kadar güçlü değildir. Diğer kaplama yüzeyleri de, örneğin von Willebrand Faktörü (vWF), fibrinojen, fibronektin, laminin, vitronektin, trombospondin-1 ya da bu 16 kombinasyonları için, kullanılabilir.
    2. sağlayıcının kaptan yeni bir atılabilir Bioçip alın. Burada kullanılan bioçipler boyutları mm 3 0.4 W x 0.1 H x 20L vardır.
    3. Pipetleyin çıkış olarak çip ve işaretinin bir ucunda mikroakışkan Biochip kulvar (lar) 0.8 ul. şerit 1.1.1 hazırlanan kaplama çözeltisi içeren kollajen ile 5 / 6th dolu olduğundan emin olun. hiç hava kabarcığı olmadığından emin olun.
      Not: Kanallar kısmen (tartışma) kanalı girişinde kollajen liflerinin birikmesini önlemek için kaplanır.
    4. nemlendirilmiş ve kapalı bir kap içinde 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    5. / H) inek serumu albumin (w bloke edici tampon (% 1.0 pipetleme kaplanmış kanallarını blokediğer ucu ile gösterirken, d,% 0.1 (a / h) glukoz, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponlu tuzlu su (hacim / hacim) NaCl, pH 7.4% 0.9 (HBA) 'de giriş olarak. şerit tamamen hava kabarcıkları kaçınarak engelleme tamponu ile dolu olduğundan emin olun.
    6. eşit uzunlukta (12 cm) hortumu kesilir. kulvar başına birini kullanın ve bir iğne ile her tüp bağlayın. Örneğin, iki nüsha halinde çalışan iki koşulları karşılaştıran bir deney, dört boru uzanıyor ve dört pim hazırlanacak gerektirecektir.
    7. bir şırınga ve bir 26 G iğne ya da eşlik eden bağlayıcıları kullanılarak saf su ile boru durulayın.
    8. bloklama tamponu ile boru doyurabilecek. 1 saat arasında, en az bir kapalı ve nemli bir kap içinde depolayın.
  2. Pompa ve Manifold hazırlama
    1. hava kabarcıklarını çıkarmak, pompayı durulayın ve damıtılmış su ile manifoldu.
    2. çıkışında sabit 10 ul ucunu kullanarak biyoçip şeritli (ler) engelleme tampon aspire. yüzeyini temizleyinhassas silip toz ve denatüre alkol ile Biochip baskılar ve tozunu alın.
    3. otomatik mikroskop sahnede Bioçip sabitleyin. Birden fazla şeritli bir seferde aynı anda kullanılırsa, biyoçip çıkışına sekiz şerit manifoldu ayırıcı bağlanır.
      Not: Sekiz şeritli manifoldu ayırıcı donanım parçasıdır (Şekil S1) pompa ve Biochip bağlı. Bu Bioçip veya operatör tanımlı eden yazılım olabilir şerit kombinasyonuna tüm (sekiz) şerit çalışmasını sağlar.
    4. biochipin girişinde bunları düzeltmek için tüp işaretçilerine kullanın. HBS ile doldurulmuş 1.5 ml konik biçiminde bir test tüpü içinde (PIN olmadan) hortumun diğer ucu yerleştirin. kalan tampon engelleme ve kötü kolajen yapışmış kaldırmak amacıyla, tüm boru ve 1 ml HBS pompa kullanılarak onların bağlı şerit durulayın.

Kan Örneklerinin 2. Hazırlık

  1. Toplama ve ayırmaSağlıklı bir gönüllüden taze tam kan. 17
    1. Bir pıhtılaşma önleyici olarak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden bir tahliye borusu kan ilk mililitre toplamak ve özel olarak otomatik bir hematoloji analiz cihazı ile tam kan sayımı (CBC), bu örnek kullanın.
    2. tahliye tüpler kullanılarak uygun bir antikoagülan kan hacmi toplayın. oluşumunu fibrin çalışma protokolüne ve sodyum sitrat parçası değilken akış odası deneyleri için standart antikoagülan heparin ya da hirudindir vardır.
      Not: Heparin açıklanan tüm deneyler için bir antikoagulan olarak kullanılmıştır.
      Not: kan miktarı yapılacak deneyler sayısına bağlıdır. Yaklaşık 3 şerit 1 borusu (7 mi).
    3. Bir rotator bekleyen kan sulandırma üzerinde tüpler yerleştirin.
      Not: Tahlil Flebotomi 3 saat içinde tamamlanmalıdır.
    4. Trombosit bakımından zengin plazma 250 g'da 15 dakika boyunca santrifüj (PRP). gevşekçe paketlenmiş pelet olumsuz yönde etkilenmemesi için santrifüj mola kullanmayın.
      1. Birden fazla tüp toplandı zaman, tek bir konik santrifüj tüpü içinde kan havuzu.
        Not: Santrifüj PRP verim ve ayırıcı hücre "kontaminasyon" bağlı, daha yavaş ya da daha az uzun yapılabilir tercih.
    5. Çıkarın ve birkaç trombositler ile dolu kırmızı kan hücrelerinin veren PRP ve buffy coat atın.
      Bizim elimizde ortalama ul başına 13 ± 5 x 10 3 paketlenmiş kırmızı hücre fraksiyonunda trombosit sayısı ise (ortalama ± SD, n = 12): Not.
  2. kan Sulandırma
    1. 5 dakika ve 4 ml başına 20 saniye süreyle, 37 ° C'de çözülme kan grubu AB (Rhesus D negatif), plazma.
    2. otomatik bir hematoloji analiz cihazı kullanılarak 2.1.5 hazırlanan paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin hematokriti belirler.
    3. Kan bankasında trombosit konsantrasyonunu belirlemek trombosit konsantresi tha hazırlanmışT, yukarıda kırmızı hücre fraksiyonu tekrar oluşturmak için kullanılır.
    4. 1 ml'lik bir örnek% 40 hematokrit ve 250 x 10³ trombosit / ul verecektir eritrosit, trombosit konsantresi hacmini hesaplar.
      Not: Hücrelerin Diğer hedef titreleri çalışma protokolüne bağlı olarak, keyfi olarak ayarlanabilir.
    5. Transfer kırpılmış bir pipet ucu kullanılarak ve 1 ml lik bir numune hacmi elde edilene kadar trombosit konsantresi ilave taze tüpe kırmızı kan hücreleri ve plazma paketlendi.
      Not: Plazma trombüs oluşumu oranı üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu değişkenler okudu bağlı olarak, plazma fraksiyonu tüm sulandırılmış örneklerde eşit olmalıdır. Örneğin, sonuç etkileyebilir farklı donörden veya farklı antikoagülan alınan donma-çözülme ya da plazma tekrarladı.
    6. yavaşça ters çevirerek yeniden kan karıştırın ve bir CBC gerçekleştirin.
    7. trombosit fraksiyonun hacmi ikame edildiği bir "boş" kontrol numunesi hazırlanması% 0.9 su (kütle / hacim) sodyum klorür, aynı hacimde bir CBC kullanılarak yeniden kan endojen trombosit konsantrasyonu (yani, kan bankası trombositler) belirlemek gerekmektedir.
  3. etiketleme
    1. Pipet 1 mi 1 ul 5 mM Calcein AM (5 uM nihai konsantrasyon) ihtiva eden bir test tüpüne kan yeniden.
      Not: Diğer hücre boyalar 14 kullanılabilir.
    2. ters çevirerek yavaşça karıştırın.
    3. kullanımdan önce, 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir.

3. Perfüzyon Testi

  1. şerit dibinde yapıştırılır kollajen lifleri üzerinde nesnel odaklanın. İdeal olarak, bu odaklanma stratejisi için faz-kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) ayarlarını kullanın. dijital seçilen Z-pozisyonları düzeltmek için deneme yazılımı 'seçilen çini bölgeler için ayarlayın akım Z' seçeneğini seçin.
  2. m deney yazılımı şeritli (xy) ilgi (ROI) bir bölge seçinDeney sırasında kaydedilir icroscope.
    Not: ROI keyfi bir perfüzyon şeritte içinde seçilen herhangi bir yüzey alanı olabilir. Nedenle bu göreceli olarak küçük olsa da, bu bölgede değişken akış profilinin yan etkilerden kaçınmak için yakın bir şeritli giriş ve çıkışına trombüs oluşumunu analiz için tavsiye edilir. YG yüzey alanı trombositlerin önemli sayıda içeren ya da sinyal tesviye izin trombüs gerekir. Bu protokolde YG 2 cm uzunluğundaki Lane ortasında 0.62 mm 2'de elde edilen üç eşit yan tarafında bir görüntü dijital olarak dikilmiş toplamıdır.
  3. yavaşça tersini örnekleri karıştırın ve otomatik sahnede Biochip bu sonraki yerleştirin.
  4. sulandırılmış kan örnekleri içeren test tüplerinde Biochip girişi ile bağlantılı olan boru yerleştirin.
  5. Test tüplerine bağlı olan kanallar için (istediğiniz gibi ya da diğer kesme stresleri) 50 din / cm2 pompayı başlatınpompa yazılımı kullanılarak yeniden kan örnekleri ihtiva etmektedir.
    Not: Diğer kayma gerilmeleri kullanılabilir.
  6. Tutanak görüntüleri mikroskop edinimi ve deney yazılımı kullanarak gerçek zamanlı olarak 5 dakika boyunca her 15 sn.
    Not: Diğer zaman serisi deneysel set-up bağlı kullanılabilir.
    Not: Genellikle 100X büyütme (10X objektif ve 10X lens) kullanır, ancak daha yüksek (veya daha düşük) büyütme kolayca bir alternatif olarak kullanılabilir.

4. Yıkama Out

  1. sodyum hipoklorit (çamaşır suyu)% 0.5, ardından her tüp çıkışına bağlı ve damıtılmış su kullanılarak çok kanallı manifoldu veya pompaya bağlı yıkayın (h / h) ve su son olarak 0.1 M NaOH. tehlikeli atık olarak biyoçip girişine tutturulmuş boru atın.

5. Veri Analizi

  1. görüntü analiz yazılımı ile trombüs büyüme kinetikleri belirleyin. aşağıdaki komutlar ZEN2012 özgüdür.
    1. Trombositlerin yüzey kapsama belirlemek için eklenti Görüntü Analizi açın.
    2. Olumlu bir sinyal ile ilişkilidir piksel yoğunluğunu belirlemek için İnteraktif sekmesini Analiz, yani bir yapışık trombosit ya da yapışan trombositler floresan eşiğini ayarlayın.
    3. Otomatik olarak seçilen eşik arasında bir sinyal ile pikselleri ihtiva eden "nesnelerin" nin (mikron 2) ayrı yüzey alanlarını içerecek bir elektronik tablo oluşturmak için Tablolar oluşturma kullanın. Bu, her bir zaman noktası için gerçekleştirilir.
      Not: floresan eşikleri seçti edildikten sonra, analiz yazılımı otomatik olarak kriterleri yerine görünüm alanına 'nesneleri' olarak algılar. Bu nesneler trombüsler, küçük trombosit agrega veya tek trombositler ve piksel sayısını kapsamaktadır. Her nesne ayrı ayrı e-tabloda listelenir.
    4. xml formatında bu elektronik tabloları kaydedin ve bir elektronik tablo programı bunları açıksonraki hesaplamalar için.
    5. Toplamı ile seçilen nesnelerin toplam yüzey alanları ve ölçüm alanına (mikron 2) toplam alanın tarafından sonucu bölün. Bu göreceli yüzey kaplama (%) verecektir. Her zaman noktası için bunu.
    6. Perfüzyon, zamanın bir fonksiyonu olarak, bu yüzey Kapsamlı Konu ve söz konusu durumun trombüs büyümesi kinetiğini sonuçta, doğrusal regresyon ile eğimi hesaplanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiz içi varyasyon göstermek için, üç aynı yeniden tam kan numuneleri kollajen kaplı yüzeylerin (Şekil 1) üzerinde eşzamanlı olarak perfüze edildi. Bu% 8.7 bir farklılaşma katsayısı ile sonuçlanmıştır. Bu istatistik ile ilgili örnekler arasında kıyas izin kabul edilebilir içi tahlil ve laboratuvarda varyasyon göstermektedir.

Burada tarif ticari akış odasının giriş ölçüm gözüne dik olan ve bu da o noktada lam...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroakışkan akış odası deneyleri kan akan trombosit fonksiyonlarını araştırmak için mükemmel bir araçtır ve deneysel bağlamlarda farklı in vitro hemostaz değerlendirmek için kullanılır. Fakir laboratuvarlar arası standardizasyonun 9 rağmen bizim laboratuvar içinde deneysel varyasyon kabul edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu güvenilir, belirli bir çalışma içinde (eşli) örnekleri karşılaştırmak için izin verir. Bu kan bankası koşullarında 11 trombosit depolama zararlı sonucudur trombosit...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların teşekkür hakkı yok.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EDTA  ile BD vakum tüpü;Becton, Dickinson ve Şirketi368856
Heparinli BD vakum tüpüBecton, Dickinson ve Şirketi368480
Sodyum Sitrat ile BD vakum tüpüBecton, Dickinson ve Şirketi366575
Hirudin Kan tüpüRoche6675751 001
BD elektrikli süpürge EclipseBecton, Dickinson ve Şirketi368650Önceden takılmış tutuculu kan alma iğnesi
Pipet uçları 100-1.000Greiner bio-one740290
Pipet uçları 2-200Greiner bio-one739280
Pipet uçları 1-10EppendorfA08928
Tüp 5 mlSimport11691380
Konik tüp 15 mlGreiner bio-one1888271
Konik tüp 50 mlGreiner bio-one227261
10 ml ŞırıngaBD309604
Hassas mendillerKimtech5511
Vena8 Fluoro+ BiochipsCellix188V8CF-400-100-02P10Figure S1 A'da 'Biochip' olarak adlandırılmıştırVena8
Boru CellixTUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100FFigure S1 B'de 'Tek kullanımlık boru' olarak
İğneleriCellixSS-P-B1IC-B1OC-PACK200 Şekil S1 olarak adlandırılmıştır B 'Pin' olarak adlandırılmıştırBiyoçiplerin
tek giriş kabloları için konektörlerCellixCONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connectCellixMF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSISFigure S1 B'de 'Yeniden kullanılabilir boru' ve 'Splitter' olarak
adlandırılmıştır Nemlendirilmiş kutuCellixHUMID-BOX
Yazılımı mikroakışkan pompaCellixN/AVenaflux Testi
Horm KollajenTakeda/Nycomed1130630Doğal at tendonu kollajeni (tip I)
Kollajeni seyreltmek için izotonik glikoz çözeltisi takviye edilir
Ev hazırlığında HEPES tamponlu salin (HBS)hazırlığında10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tamponlu salin (% 0.9 (a / h) NaCl, pH 7.4)
hazırlığındabloke edici tamponev hazırlığında'de %1.0 (a/h) sığır serum albümini ve% 0.1 (a / h) glikoz
Moleküler problarC1430
Çamaşır suyu 10% evde evde hazırlık
0.1 M NaOHevde hazırlıkhazırlık
Denatüre alkolFiersT0011.5
Mirus Evo NanopumpCellix188-MIRUS-PUMP-EVOMultiflow8 ile. Figure S1 A'da 'Pompa' ve 'Manifold' olarak adlandırılan
MikroskopZeissAxio Observer Z1colibri-LED ve yüksek çözünürlüklü CCD kamera
Yazılım mikroskobuZeissN/AZEN 2012
Hematoloji analizörüSysmexN/A
SantrifüjEppendorf521-0095
Trombosit inkübatörüHelmerPF-48i
İnkübasyon su banyosuGFL1013
Pipet MarkasıA03429
Tüp RuloRatekBTR5-12V
Steril yerleştirme cihazıTerumo BCTTSCD
Boru MühürleyenTerumo BCTAC-155
VorteksVWR58816-121
adlandırılmıştırVena8 ev Ev HBS Calcein evde , ile donatılmıştır; Masa Üstü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
  2. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
  3. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
  4. Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
  5. Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
  6. Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
  7. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
  8. Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
  9. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
  10. Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
  11. Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
  12. Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
  13. Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
  14. Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
  15. Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
  16. de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257(2014).
  17. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  18. Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
  19. Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
  20. Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680(2013).
  21. Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
  22. Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
  23. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
  24. Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
  25. Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
  26. Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
  27. Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
  28. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
  29. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
  30. Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic Flow ChambersPlatelet TransfusionHemostasis ModelingReconstituted BloodCollagen BindingThrombus Growth KineticsShear Rate AnalysisBlood Component PreparationPlatelet Concentrate QualityFlow Chamber Experiment

Related Articles