Marjinal-pulmoner lökositler, diğer lökosit popülasyonlarına kıyasla benzersiz özellikler ve farklı immünolojik fonksiyonlar sergiler. Burada, sıçanlarda ve farelerde akciğerlerin zorla perfüzyonu ile bu pulmoner lökosit alt popülasyonunun seçici olarak toplanmasını tarif ediyoruz. Marjinizan pulmoner lökositler, kan yoluyla bulaşan ve akciğerle ilgili hastalıklara duyarlılığın belirlenmesinde kritik görünmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Marginating pulmoner lökosit seçici Hasat
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Marjinal-pulmoner (MP) lökositler, akciğer kılcal damarlarının iç endoteline yapışan lökositlerdir. MP-lökositlerin, diğer bağışıklık bölmelerinin lökositlerine kıyasla benzersiz bileşim ve özellikler sergilediği gösterilmiştir. Kanıtlar, doğal öldürücü hücrelerin daha yüksek sitotoksisitesini ve dolaşımdaki veya splenik immünositlere kıyasla MP-lökosit popülasyonunun belirgin bir pro- ve anti-inflamatuar profilini göstermektedir. Burada sunulan yöntem, farelerde veya sıçanlarda akciğerlerin zorla perfüzyonu ile MP-lökositlerin seçici olarak toplanmasını sağlar. Doku öğütme ve biyolojik bozunma gibi akciğer-lökositleri çıkarmak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, bu yöntem yalnızca parankimal, interstisyel ve bronko-alveolar hücrelerle kontamine olmamış akciğer kılcal damarlarından lökositler verir. Ek olarak, perfüzyon tekniği, doku işlemeye bağlı fizyolojik tepkilere neden olmadan MP-lökositlerin bütünlüğünü ve fizyolojik ortamını daha iyi korur. Bu benzersiz MP lökosit popülasyonu, dolaşımdaki tüm kötü huylu hücreler ve enfekte olmuş hücreler akciğer kılcal damarlarından geçerken, endotel hücreleri ve yerleşik lökositlerle fiziksel olarak etkileşime girerken alıkonulduğundan, anormal dolaşımdaki hücreleri tanımlamak ve bunlara tepki vermek için stratejik olarak konumlandırılmıştır. Bu nedenle, MP-lökositlerin seçici olarak toplanması ve çeşitli koşullar altında incelenmesi, özellikle dolaşımdaki anormal hücrelerin ve akciğerle ilgili hastalıkların kontrol edilmesi ile ilgili olarak biyolojik ve klinik önemlerini anlamamızı ilerletebilir.
Giriş
Akciğer kılcal (örneğin, marginating pulmoner (MP) lökositler) 1 diğer bağışıklık bölümlerinde (örneğin, kan dolaşımı, karaciğer, dalak, kemik iliği) gelen lökositlere kıyasla belirgin lökosit bileşim ve özel aktivitesi sergiledikleri gösterilmiştir ve 2- yapışan lökositlerin 4. Örneğin, dolaşım ve dalak NK hücreleri, hem de ayırt mesajcı RNA (mRNA) seviyeleri ve pro- ve anti-enflamatuar sitokinlerin artan salgılanmasında karşılaştırıldığında çeşitli tümör hücrelerine karşı MP-lökosit sergi yüksek doğal katil (NK) hücreler sitotoksisite. MP-lökosit dolaşan lökositlerin (% 50 vs sırasıyla% 30,) ile karşılaştırıldığında doğal / adaptif bağışıklığın daha yüksek bir oranına sahip olarak hücrelerin kompozisyonu da dolaşan lökositlerin ayırt edilir. Burada sunulan yöntemin amacı, MP-lökositlerin selektif hasat sağlamak, bu önemli ve eşsiz bağışıklık bölmesi (hücre popülasyonu) incelemek için, ve eluc için iseBu özel hücreler üzerinde çeşitli manipülasyonlar (örneğin, bağışıklık aktivasyon) etkisini idate.
Bu eşsiz nüfusun önemini anlamak için, bağışıklık sisteminin hücre-aracılı bağışıklık (CMI) in vivo fonksiyonları ile tümör hücrelerini, mikrometastazlar ve rezidüel hastalığın dolaşan kontrol edebilirsiniz dikkat etmek önemlidir. Bu yetenek primer tümörü kontrol etmek için bağışıklık sisteminin emsal etmemesine rağmen belirgindir ve kanser hastaları ve hayvan modellerinde 5 in vivo kanıt yeterli destekleniyor. Önemli bir şekilde, bu bulgular, 6,7 (sitotoksisite deneyleri ile ölçülen) çoğu zaman, in vitro ve en otolog tümör hücreleri, insan ve hayvanların kan örneklerinde lökosit dolaşımı sitotoksisite dirençli olduğunu rapor ex vivo çalışmalar, tutarsız. Bu çelişki gibi afore gibi farklı lökosit popülasyonlarının, in vivo varlığı bağlanabilirbahsedilen MP lökosit popülasyonu ve aktive NK hücreleri 3 özel olarak alt popülasyonu. Gerçekten de, dolaşımdaki lökositlerin ve dalak dirençli olduğu bulunmuştur sinjenik tümör hücreleri (MADB106), MP-NK hücrelerinin 3,8 ile lize edilmesi gösterilmiştir. Bu nedenle, fischer344 (F344) farelerin akciğerlerinde metastaz sözde "NK dayanıklı 'MADB106 hücreler değil, döner ya da genel olarak erişim kolaylığı verilen incelenen olan dalak NK hücreleri, MP-NK hücreleri tarafından kontrol edilir.
Saflaştırılmış ve aktif MP-lökosit akciğer doku taşlama veya biyolojik bozulma 9 dayalı akciğerler, lökositlerin standart hasat yöntemleri ile erişilemez. Bizim yaklaşımımız doku işleme yaklaşımları ile karşılaştırıldığında iki önemli avantaja sahiptir. İlk olarak, perfüzyon yaklaşımı seçici diğer akciğer parankim, geçiş reklamı kaynaklanan hücreler ve bronş-alveol karş onları ayıran, MP-lökositleri hasadındepartmanlarında. İkincisi, daha iyi perfüzyon tekniği öğütme ve biyolojik işleme aksine bütünlük ve MP-lökositlerin fizyolojik ortam, korur hasar hücreleri, kendi morfolojisi değiştirebilir ve üretim ve bağışıklık aktivitesini modüle ve özellikle NK bastıran çeşitli faktörlerin salınımını neden olduğunu yaklaşımlar sitotoksisite 10.
Akciğerler kanser metastazı ve çeşitli bulaşıcı hastalıklar için önemli bir hedef organ vardır. Tüm dolaşan habis hücreleri ve enfekte olmuş hücrelerin deforme ve kapiller endotel hücreleri ve ikamet lökositlerin ile etkileşim için gereken akciğer kılcal damarlar yoluyla geçer. Bu koşullar altında, dolaşımdaki hücreleri kolayca yerleşik MP-lökositler tarafından hedeflenebilir. Bu nedenle bu bağışıklık bölmeye aktive lökositler var biyolojik avantajlı görünüyor ve farklı biyolojik, deneysel ve klinik ortamlarda bu eşsiz MP-nüfus incelemek için önemlidir. O sy dikkat layıkÇeşitli biyolojik cevap-değiştiricilerle stemic immün aktivasyonu (örneğin, poli-inozinik-polisitidilik asit (poli I: C) ya da tip-Cı CpG oligodeoksinükleotitler (CpG-Cı ODN)), dolaşımdaki lökositlerin 3 den MP-lökositler fazla aktif olduğu gösterilmiştir 8,11.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan denekleri Prosedürleri Tel-Aviv Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Sıçan Protokolü
- hazırlıklar
- 2 kelebek 21 G iğne düzenleyin. İsteğe bağlı olarak, iğnenin keskin kenar dosyalama 2 künt kenarlı kelebek 21 G iğne hazırlamak.
- yerçekimi (kuru) ayarında en az 30 dakika süreyle 121 ° C'de otoklav ile sterilize makas 2 çift, körelmiş kenarlı forseps, hemostat, diş doku forseps: cerrahi aletler sterilize edin.
- fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS), çözeltinin ml'si başına heparin 30 adet ekleyerek heparinize PBS (30 birim / ml) hazırlayın. Oda sıcaklığında kullanın. 35 ml hayvan başına ihtiyaç duyulan minimum hacimdir.
- Hava kabarcıklarını önlemek için peristaltik pompa hatları ve kelebek iğne içine heparinize PBS akışı.
- MP-lökosit Akciğerler ve Toplama perfüzyon
- % 8 izofluran aşırı dozda ile hayvan Euthanize. izleme solunum durması ile ötenazi onaylayın.
- Solunumun durması üzerine, derhal steril makas ve diş doku forseps kullanılarak periton ve göğüs boşlukları açın. kılıç şeklinde sürecine karın kadar birlikte orta hat karın kesisi gerçekleştirin.
- herhangi bir iç organ ya da büyük kan damarları delmeden, dikkatli her iki tarafta göğüs kafesini kesme, forseps kullanarak sternum kaldırın. sternum üzerinde bir hemostat kelepçe ve rostrally kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için göğüs kafesi katlayın.
- kalbin sağ ventrikül içine, bir kelebek iğne yerleştirin ve yaklaşık bir dakika içinde (~ 250 g hayvan 6 ml) bir şırınga içine kan maksimal hacim toplar.
- Karaciğer (Tartışma) geriye doğru perfüzyon önlemek için hemostatla vena kava Kelepçe.
- p çıkış borusu ile kan içeren şırınga değiştirirken sağ ventrikül içinde kelebek iğne tutuneristaltic pompa.
- interventriküler septum nüfuz kaçınarak sol ventrikül içine, bir 5 mi hasat şırıngaya bağlanan ikinci bir kelebek iğne yerleştirin.
- yaklaşık olarak 5 mL / dakikalık bir hızda bir peristaltik pompa açın ve yavaşça şırıngaya kan ile kirlenmiş olan perfüzat ilk mililitre toplar. perfüzat kırmızı renk soluk karanlıktan açılana kadar devam edin. (Kan bulaşmış perfuste atın).
- peristaltik pompa kesilmesi olmadan, hızlı bir şekilde 20 mi hasat şırınga ile 5 mi hasat şırınga yerine ve perfüzyon daha yüksek bir hızda (kadar 7 ml / dakika) kullanılarak, akciğer perfüzat 20 ml toplar. Vakum oluşumunu kaçınarak sürekli toplama enjektöre perfüzyon akışını izlemek.
- peristaltik pompa akışını kesmeye.
- lökositler Ekstraksiyon
- 400 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj perfüzat.
- sıvıyı aspire.
- 10 dakika boyunca 400 x g'de 10 ml PBS veya orta, santrifüj ekleyin ve sıvıyı aspire. İki kez bu adımı yineleyin. PBS veya ortam kullanılması numunesinin sonucu kullanımına bağlıdır.
- 10 dakika boyunca 400 x g'de 20 ml PBS veya orta, santrifüj ekleyin ve sıvıyı aspire.
- Örnek kullanım (FACS PCR, vb) göre istenen konsantrasyona hücreleri sulandırın.
2. Fare Protokolü
- hazırlıklar
- 2 kelebek 25 G iğne düzenleyin. İsteğe bağlı olarak, iğnenin keskin kenar dosyalama 2 künt kenarlı kelebek 25 G iğne hazırlamak.
- yerçekimi (kuru) ayarında en az 30 dakika süreyle 121 ° C'de otoklav ile sterilize makas 2 çift, körelmiş kenarlı forseps, hemostat, diş doku forseps: cerrahi aletler sterilize edin.
- 1x PBS çözeltisi ml'si başına heparin 30 adet ekleyerek heparinize PBS (30 birim / ml) hazırlayın. Oda sıcaklığında kullanın. 25 ml hayvan başına ihtiyaç duyulan minimum hacimdir.
- streHava kabarcıklarını önlemek için peristaltik pompa hatları ve kelebek iğne içine PBS heparinize ediyorum.
- MP-lökosit Akciğerler ve Toplama perfüzyon
- % 8 izofluran aşırı dozda ile hayvan Euthanize. izleme solunum durması ile ötenazi onaylayın.
- Solunumun durması üzerine, derhal steril makas ve diş doku forseps kullanılarak periton ve göğüs boşlukları açın. kılıç şeklinde sürecine karın kadar birlikte orta hat karın kesisi gerçekleştirin.
- herhangi bir iç organ ya da büyük kan damarları delmeden, dikkatli her iki tarafta göğüs kafesini kesme, forseps kullanarak sternum kaldırın. sternum üzerinde bir hemostat kelepçe ve rostrally kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için göğüs kafesi katlayın.
- Karaciğer (Tartışma) geriye doğru perfüzyon önlemek için hemostatla vena kava Kelepçe.
- Sağ ven içine peristaltik pompa çıkış borusuna bağlı bir kelebek iğne yerleştirinKalbin tricle ve kalp, septum ve avoidingpenetration sol ventrikül içine, bir 2 mi hasat şırıngaya bağlanan ikinci bir kelebek iğne.
- yaklaşık 2 ml / dk hızına pompa açın ve perfüzyon (kan bulaşmış perfuste atın) kırmızı soluk karanlıktan dönene kadar hasat şırıngaya kan kirlenmiş perfüzat ilk mililitre toplamak.
- peristaltik pompa kesilmesi olmadan, hızlı bir şekilde 10 mi hasat şırınga ile 2 mi hasat şırınga yerine ve perfüzyon daha yüksek bir hızda (en fazla 4 ml / dakika) kullanılarak, akciğer perfüzat 10 ml toplar. Vakum oluşumunu kaçınarak sürekli toplama enjektöre perfüzyon akışını izlemek.
- peristaltik pompa akışını kesmeye.
- lökositler Ekstraksiyon
- 400 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj perfüzat.
- sıvıyı aspire.
- 400 10 ml PBS veya orta, santrifüj ekle10 dakika xg ve sıvıyı aspire. Bu adımı üç kez tekrarlayın. PBS veya ortam kullanılması numunesinin sonucu kullanımına bağlıdır.
- 10 dakika boyunca 400 x g'de 10 ml PBS veya orta, santrifüj ekleyin ve sıvıyı aspire.
- Örnek kullanım (FACS PCR, vb) göre istenen konsantrasyona hücreleri sulandırın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MP-bölmesi sergi, farklı bir lökosit alt kümesi kompozisyon lökosit dolaşan karşılaştırıldı. flow sitometri analizi kullanarak, lökosit subpopülasyonunun tespit ve hem dolaşan ve MP lökositlerin kompozisyonu karakterize etmek için ölçüldü. Granülosit ve lenfositler ileri ve yan scatter göre tespit edilmiştir. Lenfositler içinde NKRP-1 parlak hücrelerin NK hücreleri, monositler gibi T hücreleri gibi, CD3 +, H1 + ve CD4 + / CD8 +<...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan yöntem seçici hasat sağlayan ve MP-lökositlerin eşsiz nüfusun eğitim. Döner ya da dalak lökositleri karşılaştırıldığında, MP popülasyonu bir lökosit alt gruplarının farklı bileşim, yüksek aktivasyon düzeyleri, muhtelif sitokinlerin yüksek bırakma ve yanlısı ve anti-enflamatuar sitokinlerin 2,3 daha yüksek mRNA seviyeleri ile karakterize edilir. Özellikle, MP-NK hücreleri, çeşitli hedef hücrelere 3,4 karşı dolaşım NK hücreleri daha sitotoksiktir ve interferon-y yüksek seviyelerde eksp...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar ve bu çalışma NIH / NCI hibe # (SBE kadar) R01CA172138 tarafından desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Autoclud Peristaltik pompa | |||
| Kelebek iğne | OMG | 26G | |
| Kelebek iğne | OMG | 21G*3/4 " | |
| Şırınga | Pic çözeltisi | 1 ml | |
| Şırınga | Pic çözeltisi | 2.5 ml | |
| Şırınga | Pic çözeltisi | 5 ml | |
| Şırınga | Pic solüsyonu | 10 ml | |
| Şırınga | Pic solüsyonu | 25 ml | |
| Künt kenarlı forseps | |||
| Makas | |||
| kanama durdurucu | |||
| Doku forseps | |||
| Heparin sodyum domuz mukozası (koruyucu içermez) | Sigma Aldrich |
Kaynaklar
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O'Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
