Method Article

Fonksiyonel tamamlama Analizi (FCA): Tasarım ve Biyokimyasal Yolların Öğretim Ek için Uygulanan A Laboratory Egzersiz

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

biyokimyasal yollarla ilgili enzimatik faaliyetlerin doğrulama fonksiyonel tamamlama analizi (FCA) kullanılarak aydınlatılmıştır edilebilir. amino asitler, bakteriyel katı cevabı ve bakteriyel peptidoglikan biyosentezinin metabolizmasında rol oynayan enzimlerin enzimatik aktivitesi gösteren FCA deneyi Bu yazıda tarif edilmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonksiyonel tamamlama deneyi (FCA), yaygın olarak genler / enzimlerin fonksiyonu / rolünü açıklamak için kullanılan bir in vivo deneydir. Bu teknik biyokimya, genetik ve diğer birçok bilim dallarında çok yaygındır. tekniğin kapsamlı bir bakış peptidoglikan ve bakteriyel sıkı yanıt Bu yazıda bildirilen asitleri, amino ilgili biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için. Lisin (D, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL) ve tirosin ve fenilalanin metabolizmasına katılan tirosin aminotransferaz (tyrB) metabolizmasında rol oynayan modeli bitki organizma Arabidopsis thaliana iki cDNA'lar vurgulanır. Buna ek olarak, bakteriyel peptidoglikan anabolik yolu ortada yer alan bir bakteri Verrucomicrobium spinosum gelen UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz (MURE) geninin analizi ile vurgulanırpeptidoglikan -linking. Bakteriyel sıkı yanıt da. Rsh (r ela / s Pot h omolog) bakteri Novosphingobium sp bir hiper-sümüksü fenotip sorumlu çift işlevli gen analizi ile bildirilen FCA dört örnekleri sunulmaktadır. Video yani lisin, peptidoglikan ve sıkı tepki, üçü üzerinde durulacak.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir genin işlev (ler) açıklık / rol (ler) bağlamında fonksiyonel tamamlama homolog doğal tipte durumuna gözlemlenebilir fenotip ile belirli bir mutant geri belirli bir homolog ya da ortolog genin yeteneği olarak tanımlanır veya orthologous gen mutant arka plana cis veya trans tanıtıldı. Bu teknik yaygın izole ve işlev (ler) birçok genin / rolü (ler) tanımlamak için kullanılır olmuştur. Bir özel örnek olarak S. URA3 kullanılarak Candida albicans arasından orotidin-5-fosfat dekarboksilaz izolasyon ve tanımlanmasıdır S. cerevisiae ve E. pyrF mutant E. coli. 1 Yazarlar amino asitl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Yazarlar ilgilenen bireyler için öğretim amaçlı fonksiyonel tamamlama analizi birleşmesini kolaylaştırmak için bakteri suşları ve rekombinant plazmidler sağlamak için hazırız. Fonksiyonel tamamlama deneyleri kolaylaştırmak için kullanılmıştır plasmidler Tablo 1 'de listelenmiştir.

Fonksiyonel tamamlama için Plazmidler 1. İnşaat

  1. Fonksiyonel olarak tamamlanması diaminopimelat Aminotransferaz (dapL) klonlanması.
    1. V arasında dapL açık okuma çerçevesi (ORF) büyütmek A. spinosum ve cDNA'ların thaliana ve C PCR ile reinhardtiiye.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli fonksiyonel tamamlama analizlerde kullanılan bakteriyel suşlar, Tablo 2'de sıralanmıştır.

Fonksiyonel tamamlama analizi: L, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL)

E. E. coli çift mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) Dape geninde bir mutasyon ve DAPD geninin tam silme (Şekil 1) barındırır. Bu nedenl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rochester Teknoloji Enstitüsü'nde Biyoteknoloji ve Moleküler Bioscience müfredat ayrılmaz bir parçası olan derslerin çoğu dersin ders kısmına ek olarak laboratuvar bileşeni var. akademik yıl 2014-2015 için müfredat yaklaşık% 60'ını temsil eden bir laboratuvar bileşeni içeren 29 olan 48 ders, toplam içerir. İlkeleri ve Uygulamaları (BPP), bir laboratuvar bazlı ders: Böyle bir ders Bitki Biyokimya ve Patoloji (FPBP), bir harmanlanmış ders / laboratuvar ders ve Biyoseparasyonlara temelleri olduğunu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AOH ve MAS Bilim Koleji ve destek için Rochester Teknoloji Enstitüsü'nde Yaşam Bilimleri Thomas H. Gosnell Okulu kabul eder. Bu çalışma Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilim Vakfı (NSF) AOH MCB-1120541 için ödül tarafından kısmen desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli mutantlarHudson/Savka laboratuvarı veya CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElektroporatörBiorad-USA1652100
Elektroporasyon KüvetleriBiorad-USA1652082
Sıcaklık kontrollü inkübatörJenerik Mikrosantrifüj Jenerik
Luria AgarThermofisher Bilimsel22700025
Luria Et SuyuThermofisher Scientific12795084
M9 OrtaSigma-Aldrich63011
Patates Dekstroz OrtaFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamisinSigma-AldrichK1377
DiaminopimelatSigma-Aldrich92591
TiminSigma-AldrichT0376
KloramfenikolSigma-AldrichC0378
TirozinSigma-AldrichT3754
FenilalaninSigma-AldrichP2126
AspartatSigma-AldrichA9256
ValinSigma-AldrichV0500
LösinSigma-AldrichL8000
İzolösinSigma-AldrichI2752
UrasilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinozSigma-AldrichA3256
TetrasilinSigma-Aldrich87128
Taq DNA polimerazThermofisher Scientific10342-020
Platin pfx DNA polimerazThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligazThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alfaThermofisher Bilimsel18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vektörThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VektörThermofisher ScientificK2030-01

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Functional ComplementationEnzyme Activity AssayGene Function AnalysisElectroporation TransformationBacterial Mutant SelectionIn Vivo ConditionsAmino Acid MetabolismPeptidoglycan SynthesisStringent Response PathwayArabidopsis Thaliana

Related Articles