Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

14.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53877

⸱

12 Mart 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

Özet

Zebra balığı (Danio rerio), omurgalıların gelişimini incelemek için güçlü bir model organizmadır. Zebra balığı embriyonik gelişiminin birçok yönü morfolojik düzeyde tanımlanmış olsa da, organizma geliştikçe meydana gelen hücresel değişikliklerin moleküler temeli hakkında çok az şey bilinmektedir. Mikroakışkanlar ve çoğullama teknolojilerindeki son gelişmelerle, artık tek hücrelerde gen ekspresyonunu karakterize etmek mümkündür. Bu, hücre alt tiplerini tanımlamak ve sınıflandırmak, hücre farklılaşması sırasında meydana gelen ara durumları karakterize etmek ve uyaranlara farklı hücresel tepkileri keşfetmek için belirli hücre popülasyonlarının tek tek hücreleri arasındaki heterojenliğin araştırılmasına izin verir. Bu çalışma, yüksek verimli çoğullama deneyleri için zebra balığı embriyolarından canlı, tek hücreleri izole etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu yöntem, floresan belirteçleri olan herhangi bir zebra balığı embriyonik hücre tipine hızlı bir şekilde uygulanabilir. Bu yöntemin bir uzantısı, tek hücrelerin transkriptomunu tam olarak karakterize etmek için yüksek verimli dizileme teknolojileri ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Prensip kanıtı olarak, kardiyak farklılaşma belirteçlerinin nispi bolluğu, nkx2.5 pozitif kardiyak progenitörlerden türetilen izole, tek hücrelerde değerlendirildi. Gen ekspresyonunun tek hücre düzeyinde ve tek bir zaman noktasında değerlendirilmesiyle, veriler kardiyak progenitörlerin farklılaşan döllerle bir arada bulunduğu bir modeli desteklemektedir. Burada açıklanan yöntem ve iş akışı, zebra balığı araştırma topluluğu için geniş ölçüde uygulanabilir olup, yalnızca etiketli bir transgenik balık misinası ve mikroakışkan teknolojilerine erişim gerektirir.

Giriş

hücre ve moleküler biyoloji en güncel çalışmalar nüfus ortalamasına dayanmaktadır. küçük popülasyonlar biyolojik süreçlerin ve hastalık sonucu önemli roller oynayabilir Bununla birlikte, önemli biyolojik olaylar bu geleneksel toplum tabanlı analizler maskelenmiş olabilir. Tek hücre düzeyinde heterojen popülasyonlar gen ifadesini anlama (ve vardır) ilgili biyolojik ve klinik Insights 1,2 yol açabilir. Embriyonik gelişim çalışmalarına ilgilendiren, daha büyük bir hücre popülasyonunda, progenitör hücreler, çoğunlukla az temsil edilmektedir zorlu sonuçta hücre kaderinin kararları 3 başlatmak gen ifadesinde ince değişiklikleri tespit etmek için yapım. Benzer şekilde, tek bir hücre tipi mikro-4 tepki olarak farklı ekspresyon profillerine sahip olabilir. Örneğin, (örneğin., Aort veya böbrek) aynı organ veya farklı organlarda yerleşik endotel hücreleri ortak Morp paylaşımı rağmen önemli heterojeniteye sergilerlerlitolojik ve fonksiyonel özellikleri 5. Buna ek olarak, aynı tümör doldurma kanser hücreleri, aynı zamanda, tek hücre düzeyinde 6 moleküler profiller ya da mutasyonlar farklı olabilir.

Modeli sistemlerinde, tek hücre transkriptomik başarılı yeni hücre popülasyonu tespit hücre farklılaşması sırasında meydana gelen ara durumları, özelliği ve 7,8,9 uyaranlara diferansiyel hücresel tepkileri ortaya çıkarmıştır. Bu tür anlayışlar, geleneksel toplum tabanlı çalışmalarda maskeli olurdu. Zebra balığı embriyolar kök, dede bir derece altında kullanılan kaynağıdır ve geliştirme sırasında tek hücre heterojenite ve hücresel kimliklerin moleküler düzenleme soruları keşfetmek için hücrelerin ayırt. Onların son derece basmakalıp, ex vivo geliştirme ve genetik manipülasyon kolaylığı onlara bu yaklaşımın 10,11 için mükemmel bir model sistem olun. Özellikle, tek hücre gen yorumlanması önemli bir sınırlamae ifade veri gelişimi sırasında yeni ara hücre devletlerin güvenilir kimlik doku koleksiyonu 9 çok dikkatli zamanlama gerektirir. Bu tutulan hücre arasındaki farklılıklar, yaşa bağlı hücre farklılaşması tarafından sunulan gen ekspresyonu, tek bir zaman noktasında bir doku içinde heterojen yerine heterojen temsil sağlamak için gereklidir. Fareler ile karşılaştırıldığında, zebra balığı embriyo gelişimi tam olarak embriyoların 12 çok sayıda senkronize edilebilir. Buna ek olarak, geniş bir kavrama boyutları ile, zebra balığı embriyolar kök ve projenitör hücre bol kaynağı olarak kullanılabilir.

Bu protokol, zebra balığı embriyoların hücreleri izole etmek ve QRT-PCR ile gen ekspresyon analizi için ticari olarak temin edilebilir, entegre Mikroakiskan devresi (IFC) çipi ve otoprep sistemi kullanılarak tek hücre yakalamak için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu protokol, bütün dahil olmak üzere herhangi bir yüksek verimli çoğullama deneyleri hızla devredilecek olabilirHücresel heterojenite 13 daha kapsamlı analiz sağlar transcriptome sıralama. Ayrıca, geleneksel gen sentezleme tahlilleri için çeşitli avantajlar sağlar. Tek hücre izolasyon protokolü alt uygulamalar dahildir tehlikeye hücrelerinin oranını azaltır FACS sonrasında yüksek canlılığı, elde edilir. Bir IFC kullanarak, yakalanan hücreler doğrudan yakalama oranlarını değerlendirmek ve morfolojik hücre sağlığını değerlendirmek için görülebilir. Buna ek olarak, bu protokol mikroakışkan hücre yakalama teknolojileri sadece etiketli transgenik balık hattı ve erişimi gerektiren, Zebra balığı araştırma topluluğuna geniş çapta uygulanabilir.

Prensip kanıtı olarak, kalp progenitörlerinden edilen tek hücreler izole edilmiş ve bir IFC çip ele geçirilir ve daha sonra kalp farklılaşma markerlerinin nispi bolluk QRT-PCR ile ölçülmüştür. tek hücre düzeyinde gen ekspresyon analizi kalp atalarıdır kendi differe bir arada gösteriyorntiating soyu. Kalp atalarıdır tek hücreli profil elde edilen anlayış, geleneksel toplum tabanlı analizlerde maskelenmiş olabilir omurgalı gelişimi sırasında kalp progenitör hücreleri arasında gen ekspresyonu heterojenlikten, ışık tutabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, embriyolar üretme yaşarlar, ergin zebrabalıkları kullanılmasını gerektirir. embriyolar doku toplama hasat edilir. Deney yapmak için uygun etik inceleme kurulları onay almak için esastır.

1. Sahnelenen Embriyolar elde

  1. Deneyden bir gün önce, üreme için sağlıklı, yetişkin zebrafish hazırlamak. bir erkek ve bir üretim tankı açık bir bölücünün karşılıklı yanları üzerinde bir dişi yerleştirin.
  2. alt uygulama için yeterli embriyo üretimi için gerektiği kadar üreme tankları için 1.1 tekrarlayın. ilgi hücre tipinde floresan proteinleri ifade vahşi tip balık ve transgenik balıklar hem embriyolar elde edin.
    NOT: Adımlar 2-8'de downstream uygulamalar için gerekli embriyo sayısı ilgi bir zaman noktasında ilgi hücrelerin göreceli bolluk bağlıdır. Bu hücre türüne göre değişebilir rağmen, 200 embriyolar 2,000-5,000 sıralı hücreler üretmek zaman cilgi arşın 24 hpf (saat sonra döllenme) de
  3. Ertesi sabah, taze bir üreme tankına balık aktararak breading tankındaki suyu değiştirmek ve bölücü çıkarın. üreme teşvik etmek için bir açı tankı yatırın.
  4. sahnelenen embriyolar toplayın.
    1. Her 15 dk, taze üreme tankına yetişkinleri aktarılması ve çay süzgecinden geride yumurta geçerek embriyolar toplamak.
      NOT: karşılaştırılabilir yoğunlukları ve sıcaklıklarda muhafaza zaman Zebra balığı embriyolar eş zamanlı olarak gelişir.
    2. (1 L çift distile su içinde 0.21 g / L Anında okyanus tuzları) Yumurta Su ile yumurta durulayın ve bir petri transfer. hava sirkülasyonu ile 28.5 ° C'de nemli inkübatör petri aktarın.
  5. İki saat son toplanmasına, sıralama 10 cm petri kutularının içine çok hücreli embriyo döllenmiş ve çanak başına 50 embriyolar yoğunluğunu azaltır. Tek, 15 seçin embriyolaralt uygulama için toplama dakika zaman penceresi. 28.5 ° C embriyolar inkübe edin.
    NOT: Örneğin, 08:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 ve 10:15 AM embriyolar toplamak. döllenmiş embriyo en fazla sayıda 9:00 toplanan pençelerinden ise zaman noktalarındaki karşılaştırıldığında, daha sonra aşağı uygulamalar için sadece bu embriyolar kullanın.

2. Tek Hücre Ayrışma için Kurma

  1. önce ilgi (18 hpf) zaman noktasına yaklaşık 30 dakika ince forseps ile el koryon embriyolar kaldırmak.
  2. Toplamak ve her durum için aşağıdaki etiket: İki 2 ml mikrosantrifüj tüpler, bir 40 mikron hücre süzgeç, bir 35 mm hücre kültürü çanak ve 35 mikron hücre süzgecinden ile tepesinde iki FACS tüpleri.
  3. Buz üzerinde aşağıdaki reaktifler Chill: Yumurta Su 1L çift distile su 0.21 g / L Anında Okyanus tuzları içeren; 55 mM NaCI, 1.8 mM KCI, 1.25 mM NaHCO 3 ihtiva eden tampon De-yolking; ve FACS Tampon Leibovitz L-15,% 5 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş ortam ihtiva etmektedir.
  4. RT Hücre Ayrılma Reaktif 1 numune başına 1 ml getirin. buz üzerinde örnek başına çözülme 1 ml Hücre Ayrılma Reaktif 2. Kullanmadan önce hemen oda sıcaklığına kadar getirin.

3. Tek Hücre Ayrılma

  1. Geniş delikli cam pipet kullanılarak, yumurta suyun minimum bir hacmi içinde 2 ml mikro santrifüj tüpüne 100-300 embriyolar aktarılır.
  2. 20 dakika boyunca buz içinde tüp 1 ml buz gibi soğuk yumurta su ile su değiştirilmesi ve daldırarak embriyolar öldürülür.
    DİKKAT! (Ikincil ötanazi gibi hücre ayrışma ardından buz üzerinde ürpertici) bu ötenazi yöntemi için uygun kurumsal hayvan bakım gözetim komitesinden onay almak için çok önemlidir. Standart ötanazi tipik embriyolar da canlı hücreleri elde etmek için uygun değildir ki, soğutulmuş sonra ağartılmalarına nispeten 3 gün sonra gübreleme
  3. 1 ml buz gibi soğuk Yumurta suyla embriyolar iki kez yıkayın. yıkamak, Yumurta Suyu ve Yumurta Su eklemek için bir P1000 kaldırmak için geniş bir delik cam pipet kullanın.
  4. P1000 ucu ile 8-12 kez 1 ml Deyolking Tampon ile embriyo su değiştirilmesi ve öğütülerek sarısı çıkarın veya sarısı çözülür ve kadar embriyoların sadece organları görebilir.
  5. 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile doku toplanır. yavaşça doku pelet bozmadan süpernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. 1'in ml Yumurta Su yeniden askıya.
  6. Tekrarlayın üç yıkar toplam adım 3.5, ancak son yıkamada, 1 ml RT Hücre Ayrılma Reaktif 1 yeniden askıya.
  7. yatay olarak yerleştirilmiş borular ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücre ayrışma Reaktif 1 inkübe edin. Her 2-3 dk hafifçe topaklanma önlemek için P1000 pipet ile çiğnemek.
    NOT: ezerek toz haline getirme adımları sırasında hafifçe örnekleri taşıyınız. Bazen tek bir büyük yığın embriyo organları bir arapsaçı gelen tüp içinde oluşacaktır. Bu iradeNazik toz haline getirilerek destekli ek sindirim ile dağıtmak. VORTEKS DO NOT.
  8. 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile doku toplanır. 1 ml Hücre Ayrılma Reaktif 2 supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
  9. Oda sıcaklığında 5-15 dakika boyunca inkübe edin. yatay tüpleri yerleştirin. Her 2-3 dk hafifçe topaklanma önlemek için çiğnemek. Her 5 dk, sindirim ilerlemesini değerlendirmek.
    1. , Sindirim ilerlemesini değerlendirmek hücre kültürü çanak üzerine bir damlacık olarak 18 ul FACS Tampon ve pipet içine 2 ul süpernatant sulandırmak için.
    2. numune üzerinde bir lamel yerleştirin ve 10X ve 20X büyütmede bir doku kültürü mikroskop altında gözlemlemek.
      NOT: Hazırlık tek hücreler, küçük kümeler, büyük kümeler, ve zaman zaman çoğunlukla-sağlam embriyo vücudun bir karışımı olarak görünmelidir.
    3. Görme tek hücreleri ve küçük kümeler olan hazırlık oranını değerlendirmek.
      NOT: Aşırı sindirim canlılığını azaltır; altında sindirim tek hücre verimi azaltacaktır.
  10. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücre hazırlama toplayın. Süpernatantı atın ve soğuk FACS Tampon 1 ml yeniden askıya.
  11. FACS Tampon ile 40 mikron hücre süzgeç ıslatın. 35 mm hücre kültürü çanak üzerine 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin. tampon sıralama 1 ml FACS hücre süzgeci bir kez yıkayın.
  12. 2 ml mikrosantrifüj tüp akış yoluyla aktarın. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler toplamak ve 100 ul FACS tampon içinde yeniden askıya.
  13. Bir hemasitometre kullanarak hücre verimi güvenin. Dahası seçim FACS makine için önerilen ml veya optimum konsantrasyon başına 5x10 6 hücre örnekleri sulandırmak. hemasitometre hücre verimi sayma yaparken isteğe bağlı, tripan mavisi ile counterstain ölü hücreler FACS sıralama öncesinde hücre hazırlık canlılığı teyit etmek.
    NOT: Çok sıralamak için zaman aşırı miktarda alacak seyreltilmiş Hazırlıklar. çok c vardır Hazırlıklaroncentrated multimerler içine gelme eğilimindedir ve saf nüfus sıralamak için optimal bulunmaktadır.
  14. Rezerv her numunenin% 10-20 olarak boyanmamış denetimlerini kullanmak için. ekleyerek diğer örnekler, leke ölü hücreler bir floresan ölü / canlı (L / D) ayrım Her numune içine boya. yıkama ETMEYİN.
    Not: nükleik asitler, L / D boyası olarak kullanılabilir tehlikeye hücre zarları ve lekeleri hücreleri nüfuz herhangi bir flüoresan boya, florasan spektrumu ilgi seçimi ve fluorofor markalama hücrelerinin FACS makine ile uyumlu olması koşuluyla.
    1. bazı hücreler FACS saflaştırma transit ölecek ve sıralı nüfus dışında tutulmalıdır olarak boya ekledikten sonra hazırlık yıkamayın.
  15. 20 ul FACS tamponu ile FACS tüp şapkalı 35 mikron hücre süzgeç ıslatın. süzgeç hücreleri ekleyin ve yerçekimi tarafından toplanır. Buz üzerinde muhafaza edin.

4. FACS Zenginleştirme

  1. için tek zenginleştirmek için FACS kullanınFloresan markörü eksprese eden canlı hücreler.
    1. yan dağılım genlikli (SSC-A) vs ileri dağılım (FSC-A) genlik bir dağılım arsa üzerinde enkaz hücreleri ayırt etmek için bir kapı olarak ayarlayın, hem doğrusal ölçeklendirme ile.
      Dikkat balığı hücreler tipik olarak bir fare veya insan hücrelerine göre daha küçüktür. Bu hücreler ve döküntüler, arasındaki düşük bir bazal ayırma yansıtılır.
    2. 4.1.1 set kapısından, tek hücre için zenginleştirmek ve ileri saçılım yüksekliği (FSC-H) ve düşük yan dağılım yüksekliği (SSC-H) bir dağılım grafiğini kullanarak multimerlerini, doğrusal ölçekleme hem dışlamak için bir kapı olarak ayarlayın.
      NOT: orantısız yüksek FSC-H ve düşük SSC-H hücreler muhtemel multimerleri ve sıralama dışındadır.
    3. tek renk kontrollerini kullanarak 4.1.2 gate seti, doğrusal ölçekleme ve kanal genliği ile FSA-A'nın bir dağılım grafiği kullanan tek canlı hücreleri dahil bir kapı set günlük ölçeklendirme ile L / D leke tespit etmek için kullanılır. L / D negatif hücreleri içerir.
    4. itibarenkapı, tek renk kontrollerini kullanarak, 4.1.3'de belirlenen günlük ölçekleme ile floresan protein hücre işaretleyici tespit etmek için kullanılan kanalın lineer ölçeklendirme ve genlik ile FSA-A'nın bir dağılım grafiği kullanılarak pozitif floresan ile tek canlı hücreleri dahil bir kapı set . Pozitif hücreler yer alır.
    5. Gerekirse L / D leke ve floresan protein spektrumları arasındaki girişim için hesap, herhangi bir tazminat kontrolleri ayarlayın.
  2. Adım 4.1 ayarlanan kapılarının her giren hücrelere ayarlayın sıralama mantığı.
    1. çift ​​etiketli hücreleri kullanarak, hücre sıralama için yolluk doğrulayın.
      NOT: Hücreler yerine enkaz, tek hücreler yerine multimer, L / D negatif ve floresan pozitif hücreler olacaktır sıralama için hücreler.
  3. Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüp içinde soğuk FACS Tampon 5 ul içine ilgi nüfus kriteri 2000-4000 hücreleri. hücre için mümkün olan en düşük basınçlar kullanmak, sıralama sırasında hücreler üzerinde kesme ve zorlanma en aza indirmek içinsıralayıcı.
    NOT: FACS Tampon 5 ul damlacık FACS makinesinden çıkan hücreler için bir yastık görevi görür. şirketinden FACS tamponuna 2000-4000 hücrelerin toplanması öncesinde IFC fiş üzerine yüklemeden santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücreler pelet birbirine bağlı olmadığını santrifüj multimerlerinin oluşumuna yol açabilir, bu strateji, tavsiye edilir.
  4. sonrası sıralama canlılığı analizi değerlendirin.
    1. L / D leke 1000 seyreltme: Transferi 1 ul tampon ve 1 sıralama 100 ul FACS ile taze bir FACS tüp hücreleri sıralanır. Adım 4.1 yolluk stratejisi ile FACS sıralayıcı aracılığıyla hücrelere geçerler. L oranını kullanın / negatiften pozitife D sıralı hücrelerin canlılığı tahmin etmek.

Mikroakiskan Chip üzerine 5. Yük Hücreleri

  1. hemasitometre kullanarak, konsantrasyon ve sıralanmış hücrelerinin boyutunu hem de ölçün.
    1. en az 10 ul sıralı hücreleri sulandırmak. 5 u bir kısım seyreltin, 5 ul tripan mavisi ile L hücreleri. hemasitometre üzerine yerleştirin ve lamel uygulayın.
    2. hemasitometre 4 x 4 ızgaraları tüm hücrelerin parlak bir alan görüntüleri toplamak. Canlı hücrelerinin sayısını ve canlı hücre / ml hesaplar. Canlı hücreler tripan mavisi kadar yapmayız.
      Not: Tüm canlı hücre çapını ölçmek için herhangi bir standart Image Analysis yazılımının kullanılması. hücre boyutu, ortalama ve standart sapma hesaplayın ve ilgi hücre boyut aralığı için uygun olan bir IFC plaka seçin. Hücre boyutu aralığı bir IFC plaka hücre boyut aralığı straddles ise ilgi hücreleri tam kapsamlı yakalamak için birden fazla tabak kullanın.
  2. üreticinin talimatlarına göre IFC plakaya Yük hücrelerinin (Malzeme).
    1. 1x10 6 hücre / ml hücreleri sulandırmak ve üreticinin talimatlarına göre yüzdürme optimizasyon yapmak.
      NOT: Yüzdürme optimizasyon hücreleri dibine çöker, ne de yükleme wel üstüne şamandıra ne sağlarIFC çip üzerine optimum yükleme l. hücrelere tampon oranı hücre tipine göre değişir, ancak genellikle 6 aralıkları olabilir: 4-7: Hücrelerin 3: tampon.
    2. astar-IFC plakasına hücreleri ekleyin. Yük uyumlu Fluidics makinenin içine plaka ve Mikroakiskan devre boyunca ve yakalama şerit içine hücreleri itmek için bir hücre yükleme komut dosyasını çalıştırın.
  3. Hücreler IFC plaka üzerinde yakalama sitelerinde açılmış olduğunu doğrulamaktadır.
    1. Fluidics makineden IFC plakasını sökün. bir tabak adaptörü ile donatılmış bir mikroskop IFC plakasını monte edin.
    2. 10X büyütmede her yakalama site için parlak bir alan ve floresan anlık toplayın.
      NOT: aydınlık yakalama süreleri lamba yoğunluğuna bağlı olarak, 10-50 ms arasında değişebilir. Floresan yakalama süreleri fluorofor parlaklığına bağlı olarak, 250-750 ms arasında değişebilir. fotohasar önlemek için hücrelerin ışığa maruz kalmaması.

6. cDNA Sentezi

  1. I'e göre yerinde hücre parçalama gerçekleştirinFC plaka üreticinin talimatlarına.
    1. IFC plaka üzerinde kuyu lizis tamponları ekleyin. üreticinin talimatlarına göre uyumlu fluidik makine ve çalışma hücre parçalama komut üzerine yük plakası.
  2. IFC plakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkripsiyon gerçekleştirin.
    1. IFC plakasına ters transkripsiyon ayraçlar eklenir. Uyumlu Fluidics makine üzerine yük plakası. Ters transkripsiyon komut dosyasını çalıştırın. Örnek döngü koşulları: 5 dakika 85 ° C'de daha sonra da 1 döngü, 10 dakika boyunca 25 ° C 'de 1 döngü, 1 saat süre ile 42 ° C' de 1 döngü.
  3. IFC plakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak gene özel problar ile ön amplifikasyon gerçekleştirin.
    Not: düşük kopya numaraları ile daha kesin nedeniyle, ara katkı boyalar ile kullanım için optimize florojenik etiketli problar yerine probları kullanımı.
    1. Havuz astar ve son 180 nM her sulandırmak. IFC plakasına toplanmış primerler ekleyin. Uyumlu fluidi üzerine yük plakasıcs makinesi. Run amplifikasyon komut dosyası.
  4. Aşağıdaki çevrim koşulları ön amplifikasyon yapın: 1 döngü, 95 ° C'de 10 dakika, daha sonra da 18 döngü, 4 dakika 60 ° C'de, daha sonra 15 saniye boyunca 95 ° C 'de tavlama ve uzatma, denatüre edici ile. Mağaza hasat kadar 4 ° C 'de cDNA önceden büyütülmüş. kullanılıncaya kadar -20 ° C'de üreticinin talimatlarına ve saklamak için uygun mikroakışkan plakadan Hasat cDNA.

Tek Hedef QRT-PCR Tek Hücreleri 7. Select cDNA

  1. üreticinin talimatlarına uygun olarak 25 ul dilüsyon reaktif cDNA seyreltilir.
    NOT: Yaklaşık son verim hücre başına ön amplifiye cDNA 28 ul. QRT-PCR bir hedef içermeyen bir kontrol olarak kullanılmak üzere bir seyreltici bir kısım ayırın.
    1. parlak bir alan ve adım 5.3.2 kaydedilen floresan görüntülere değinen her yakalama sitesine puan. El ile saymak ve hücre sayısını kaydedin. Değerlendirmek ve her hücre grip olup olmadığını kayıtFlüoresan.
      NOT: Her birey sitesi içerebilir 0,> 1 hücre birden çok hücre ve / veya tanımlanamayan enkaz ihtiva yakalama siteleri içeren 1 veya> 1 hücre. görüntüler yeterli kalitede ise, bir piksel değeri de floresan sinyal yoğunluğu ölçmek için atanabilir.
  2. Mah-PCR analizi için seçin örnekleri.
    1. Pozitif floresan ile tam 1 hücreyi ihtiva adım 7.2 tanımlanan yakalama sitelerinden cDNA örnekleri seçin. Her bir numuneden cDNA havuzunu 1 ul alikotları.
      NOT: Bu ilgi genler seçilen hücrelerin herhangi ifade olup olmadığını belirlemek için kullanılan "Havuz" pozitif kontrol edilmesidir.
    2. Bir negatif kontrol olarak tam olarak 0 hücreleri içeren en az bir yakalama sitesinden cDNA seçin. no-şablon kontrolü gibi adım 7.1.2 den seyreltici kullanın.
  3. Mah-PCR testi çalıştırın.
    1. Aşama 6.4.1 ön-yükseltme için kullanılan tek probları kullanın. triplicat tüm örnekleri yükleyine. 1 döngü, 50 ° C 2 dakika, 1 döngü, 10 dakika için 1, 60 ° C'de, sonra 95 ° C 15 saniye tavlama ve uzatma denatüre edici ile 40 döngü 95 ° C: 384 plaka üzerinde 10 ul reaksiyon için döngü koşulları min.

8. Veri Analizi

  1. Standart jel elektroforezi ile Mah-PCR ürünleri doğrulayın. Ürünü onaylamak beklenen molekül ağırlığında tek bir bant olduğunu (her sonda için değişir).
    NOT: Bir sonda uygunsuz boyutta birden çok bantları veya tek bir bant üretirse, o zaman özgünlüğü sorgulanabilir ve bu analizden geni dışlar.
  2. Herhangi bir anormallik 14 tüm amplifikasyon eğrileri ve hesabı inceleyin. Her bir numune / gen kombinasyonu 15 için ortalama BT değerini hesaplayın.
    NOT: Pozitif kontroller CT değerleri tipik 10-30 arasında değişmektedir. Negatif kontroller CT değerleri tipik 35-40 (hiçbir amplifikasyon) arasında değişir. BT değerleri 30-35 derece düşük ifadesi olarak kabul edilirve dikkatli 14 ile yorumlanmalıdır.
  3. Rapor verileri
    1. Numuneler CT = 10-30 düşersen, veriler de bir kontrol numunesine transkript bolluk katlık değişim olarak bildirilebilir.
      Not: (- ΔΔCT) katlı değişim 2 ^ eşittir ACt ev bakıcısı geni ile ilgili numunenin ortalaması CT çıkarılarak bir ev bakıcısı geni ile ilişkili ve ΔΔCT numunesi ve bir pozitif kontrol 15 ile ACt farklılıklar olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Prensip kanıtı olarak, gen ifadesi kalp gelişimi sırasında farklılaşma dinamikleri keşfetmeye değerlendirildi. zebrabalıkları kardiyak ataları Bunların, doğrusal kalp tüpü oluşturmak için sigorta ön yan levha mezoderm yer değiştiren hücrelerin mezodermal nüfusu ortaya çıkar. Füzyon öncesinde, kalp ataları kalp atalarıdır 16,17 erken belirli belirteç olduğu düşünülmektedir transkripsiyon faktörü Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), ifade başlar. Burada, daha önce tarif edilen BAC ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada tarif edilen yöntem, bir kardiyak genlerin bir alt ekspresyonunu değerlendirmek için mikro-akışkan destekli tek hücre yakalama sisteminde kullanım için zebra balığı embriyolardan kalp progenitör hücrelerin bir popülasyonu ettirecek hücre tipi özel bir promoterin kontrolü altında bir floresan protein ifade kullanır hücreler. FACS lazer eksitasyon ve emisyon özellikleri tercih fluorofor (ler) ile uyumlu olduğu sürece, bu yöntem, herhangi bir flüoresan raportör hattı için kullanılabilir. Birçok zebrabalıkları muhabi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Balık stoğu için Dr. C. Geoffrey Burns'e teşekkür ederiz. Yazarlar, bu projeyi mümkün kılan kaynaklar için UNC Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi'ne, UNC-CGIBD AAC çekirdeğine ve hayvan bakımı için ZAC tesisine minnettardır. L.S., NIH T32 hibe HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda) tarafından desteklenmektedir. NF, NSF Lisansüstü Araştırma Bursu NSF-DGE-1144081 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma NIH P30DK034987 hibesi (UNC Advanced Analytics Core'a), Amerikan Kalp Derneği Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi 13SDG17060010 ve Ellison Tıp Vakfı Yeni Burs Hibesi AG-NS-1064-13 (Dr. Qian'a) ve NIH R00 HL109079 hibesi (Dr. Liu'ya) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Supplies
Dumont #5 forsepsGüzel Bilim Araçları11254-20Embriyolardan koryonu çıkarmak için
Mikrosantrifüj tüpü 2 mlGeneMateC-3261-1
40 um hücre süzgeciBiobasicSP104151
35 mm kültür kabıFalcon351008
35 um hücre süzgeci ile tepesinde FACS tüpleriFalcon352235
P1000 ve uçlarRainin17005089
P20 ve uçlarRainin17005091
IFC çip üreticisinin protokolüFluidigm100-6117Sürüm 100-6117 E1, temsili deneyde
kullanıldı Geniş delikli pastüer cam pippetteVWR14673-010 embriyoların aktarılması
Yetişkin vahşi tip zebra balığıN/AAB hattı kullandık
Yetişkin transgenik zebra balığıN/ATg(nkx2.5:ZsYellow)
Name<strong>Company>Katalog NumarasıYorumlar
Hücre ayrışması için reaktifler
Çift damıtılmış suN/A
Anında Okyanus Deniz TuzuAnında OkyanusSS15-10
NaClFisherScientificS271-3suda stok yapar ve yumurta sarısı giderme tamponu için kullanır
KClSigma AldrichP5405suda stok yapar ve yumurta sarısı giderme tamponu
NaHCO3Sigma için kullanır AldrichS6014suda stok yapar ve yumurta sarısını gidermek için kullanır
Leibovitz'in L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511Isı inaktive eder; herhangi bir FBS markası iyi olmalıdır
Hücre Ayrışması Reaktifi 1 -TrypLELife Technologies12605-010Oda sıcaklığında saklayın.
Hücre Ayrışma Reaktifi 2 - FACSmaxGenlantisT200100-20 Mağazası; buz üzerinde çözdürün; kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin
pronaz (isteğe bağlı)SigmaP5147
L/D Boya - Sytox BlueLife TechnologiesS34857Akış sitometrisi için uygun herhangi bir canlı/ölü leke işe yarayacaktır
Trypan BlueGibco15250-061
Name Company<strong>Katalog NumarasıComments
IFC plaka kullanımı ve qRT-PCR için reaktifler
Gen-spesifik problar Problardeneye göre değişecektir
TaqMan Probu ef1aYaşam TeknolojileriDr03432748_m1
TaqMan Probu gata4Yaşam TeknolojileriDr03443262_g1
TaqMan Probu nk2-5Yaşam TeknolojileriDr03074126_m1
TaqMan Probu myl7Yaşam TeknolojileriDr03105700_m1
TaqMan Probu vmhcYaşam TeknolojileriDr03431136_m1
TaqMan Probu isl1Yaşam TeknolojileriDr03425734_m1
TaqMan Gen Ekspresyonu Master MixLife Teknolojileri4369016
IFC üreticisinin protokolünde
C1 Reaktif KitiFluidigm100-5319Hücreleri IFC plakasına yüklemek için reaktifler
Ambion Tek Hücreden CTTMLife Teknolojileri4458237Ters transkripsiyon ve ön amplifikasyon adımları için reaktifler
PreAmp (5-10 um)
< güçlü > Adı< / güçlü > <güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
C1 AutoPrep makinesiFluidigm100-5477IFC plaka kullanımı için
Hemositometre Sigma AldrichZ359629Hücreleri saymak ve hücre boyutunu değerlendirmek için
Diseksiyon mikroskobuEmbriyoları koryondan çıkarmak için
Doku kültürü mikroskobuTek hücre sindirimini değerlendirmek için
FACS makinesiİlgilenilen hücreleri izole etmek için
stronglistelenen reaktifler için Moleküler Biyoloji Kaliteli Su Corning 46-000CM C1 IFC Fluidigm 100-5757 küçük hücreler için IFC plakası < güçlü > Ekipman< / güçlü>

Kaynaklar

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644(2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102(2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek H cre zolasyonuMikroak kan ipFACS S ralamaH cre DisosyasyonuGen Ekspresyon AnaliziFloresan Mark rlerTrypan Blue Ekskl zyonuEntegre Ak kan DevresiQRT PCR
İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.