Yöntem makalesi

Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm

DOI:

10.3791/53880

⸱

18 Mart 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, erişkin cilt fibroblastlarının insülin salgılayan hücrelere dönüştürülmesine izin veren yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik epigenetik dönüşüme dayanır, retroviral vektörlerin kullanımını veya stabil bir pluripotent durumun elde edilmesini içermez. Bu nedenle translasyonel tıp uygulamaları için oldukça umut vericidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rejeneratif tıp, dejenere olmuş veya hasar görmüş dokuları onarmak için hastalara verilen yeni, tamamen işlevsel hücreler gerektirir. Bu tür hücreler kolayca bulunamadığında, farklı tekniklere özgü avantajlar ve sınırlamalar ile birlikte yeniden programlama ve trans-farklılaşmayı içeren farklı yaklaşımlar kullanılarak elde edilebilirler. Burada, yetişkin bir olgun fibroblastın, keyfi olarak epigenetik dönüştürülmüş hücreler (EpiCC) olarak adlandırılan insülin salgılayan bir hücreye dönüştürülmesi için yeni bir strateji açıklanmaktadır. Yöntem, hücre kaderinin epigenetik regülasyonunu ve farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaların artan anlayışına dayanarak geliştirilmiştir. Özellikle, ilk adım, yetişkin hücreleri "son derece izin verilen" bir duruma getirmek için epigenetik bir değiştirici, yani 5-aza-sitidin kullanır. Daha sonra, hücreleri farklı bir soya doğru yeniden ele almak için bu kısa ve geri dönüşümlü epigenetik plastisite penceresinden yararlanır. Yaklaşım "epigenetik hücre dönüşümü" olarak adlandırılır. Verimli, kontrollü ve kararlı bir hücresel soylar arası geçiş elde etmenin basit ve sağlam bir yoludur. Protokol herhangi bir gen transfeksiyonunun kullanımını içermediğinden, viral vektörlerden arınmış olduğundan ve stabil bir pluripotent durum içermediğinden, translasyonel tıp uygulamaları için oldukça umut vericidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rejeneratif tıbbın temel bir amacı tamir veya hasarlı değiştirmek için kullanılabilecek yeni, fonksiyonel hücrelerin nesil, doku dejenere. başka bir hücre tipinden dönüştürerek, yeni olanları içine kolayca kullanılabilir yetişkin hücrelerinin yeniden şekillendiriyor, gerekli hücre popülasyonu erişimi bol ya da zor değil, özellikle bir özellikle çekici bir yaklaşımdır. Ancak, yetişkin hücreleri son derece stabildir. Onlar olgun terminali uzmanlık ulaştığında, bunlar stabil bunu 1 korumak onların seçeneklerinde kademeli kısıtlama yoluyla farklılaştırılmış devlet kazanmak ve.

Somatik hücre (iPS) bir pluripotency için yeniden programlama sağlayacak protokoller bir dizi geliştirilmiştir Son yıllarda, transkripsiyon bir dizi 2,3 faktörleri zorla sentezlenmesi yoluyla elde etti. Alternatif olarak, hücre dönüşüm 4 tek sokulması doğrudan nesilli transdiferansiasyon ile elde edilebilir ya da transkripsiyon bir arada 5-7 faktörleri. Bu strateji, bir de-farklılaştırılmış devlet aracılığıyla geçiş dahil ancak belirli transkripsiyon 8 faktörleri yüksek ifade gerektiriyor.

Son zamanlarda sitidin analog 5-azasitidin (5-aza-CR), iyi karakterize edilmiş DNA metiltransferaz inhibitörünün demetile özelliklerine yetişkin hücrelerinin Kısa süreli dayanan bir dönüşüm protokolü geliştirilmiştir. Demetilasyon adım hemen gerekli terminali fenotip elde etmek için izin veren bir özel farklılaşma protokolü 9-11 tarafından takip edilir. Bu yöntem, farklı soy hücreleri içine olgun farklılaşmış hücreleri dönüştürmek mümkün olup viral vektörlerin kullanımı ve bir egzojen transkripsiyon faktörleri transfeksiyon hem de önlemek için önemli bir avantaja sahiptir. istikrarlı bir pluripotent devletin satın alma ve istikrarsızlık hücre ile ilgili artmış duyarlılık da önlenir.

Burada sunulan tamamen işlevsel insülin salgılayan hücrelerin içine yetişkin insan deri fibroblast dönüşüm sağlayan detaylı bir protokol. Bununla birlikte, teknik, farklı hücre tipleri uygulanmış ve çeşitli farklılaşma yollarının doğru hücreleri ele alırken, olumlu sonuçlar üretti dikkati çekiyor. Ayrıca, epigenetik dönüşüm başarılı bir şekilde, insan, domuz cinsi 9-13 hem de köpek kullanılmıştır yaklaşım, geniş bir etkinlik ve dayanıklılık göstermektedir (Eser sunulmuştur).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Aşağıda tarif edilen tüm işlemler, steril koşullar laminer akış başlığı altında yapılmalıdır. kendi kullanım boyunca 37 ° C'de tüm kültür prosedürleri termostatik kontrollü aşamalarında yürütülmektedir ve hücreler korunur emin olun.

1. Cilt fibroblast İzolasyonu

  1. Kültür kabı kaplama solüsyonu hazırlamak
    1. su (nihai konsantrasyon% 0.1), 100 ml domuz jelatin 0.1 g. otoklav ile çözüm sterilize edin.
    2. 35 mm Petri tabaklarda steril% 0.1 domuz jelatin 1.5 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında onları korumak, kaplamak için 2 saat bekleyin.
      Not: İnsan deri biyopsileri ön kol ön yüzünde bir avasküler bölgesine lokal anestezi altında eksizyon ile toplanmış ve kullanımdan önce + 4 ° C'de% 2 antibiyotik antimikotik çözelti takviye edilmiş Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde depolanır.
  2. Yeni PBS ile yıkayın biyopsileri% 2 antibi ile takviyeotik antimikotik çözüm.
  3. Bir yerde bir 100 mm Petri kabındaki biyopsileri ve steril neşter ile yaklaşık 2 mm 3 parça halinde kesilmiş.
  4. fragmanları kaplama hemen önce kaplama çözeltisi aşırı çıkarın.
  5. önceden kaplanmış 35 mm Petri kabı içine 5-6 deri parçaları yerleştirin.
  6. fibroblast kültür ortamı hazırlayın:% 77 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), yüksek glukoz,% 20 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-Glutamin çözeltisi ve% 2 antibiyotik antimikotik çözelti.
  7. % 5 CO2 içinde 37 ° C de, her parçanın (fragman genellikle her 100 ul) ve kültür onları fibroblast ortamının bir damlacık ekleyin.
  8. 24 saat sonra,% 5 CO2 içinde 37 ° C sıcaklıkta nemli tutmak için parçaları üzerinde fibroblast kültür ortamında 500 ul ekle.
  9. en az bir kez pipet her 48 saat ile orta değiştirin.
  10. İnkübasyon 6 gün sonra, dikkatlice doku parçaları kaldırmak ve atın.
    Not: 6 gün sonra, fibroblasts doku parçaları dışında büyümek ve bir hücre tek tabaka oluşturacak şekilde başlarsınız.
  11. , Orta Yenile fibroblast kültür ortamının 2 ml ilave edilir ve CO2 inkübatör% 5, 37 ° C 'de, hücre tek tabakalı kültürü, devam etmektedir.

2. fibroblast Kültür

  1. 37 ° C 'de kültür fibroblastlar% 5 CO2 içinde 80% konfluansa kadar
  2. doku kültürü yemekleri Pasajlanması, aspirat fibroblast kültürü ortamı için. PBS 4 ml hücreleri üç kez yıkayın% 1 antibiyotik antimikotik çözelti ile takviye edilmiştir.
  3. Tripsin-EDTA solüsyonu (0.5 g / L domuz tripsin ve 0.2 g / L EDTA) ince bir tabaka (kültür ortamı hacminin% 10'u) ekleyin ve hücre tekli-tabakası doku altından ayırmak başlayana kadar 37 ° C'de inkübe kültür çanak ve hücreler ayırmak.
  4. tripsin eylemi etkisiz hale getirmek fibroblast kültürü ortamında 9 parça ile hücre süspansiyonu seyreltilir. Santrifüj gerekli değildir.
  5. Yeni kültür yemekleri Levha hücreleri (ilejelatin üzerinden) ve Kültür,% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de dayanıklılığı. Büyüme hızına bağlı olarak, 4: 2 ve 1: 1 arasında geçiş oranı tutun.
  6. Hücreler (haftada genellikle iki kez)% 80 civarında izdiham, geçit onlara ulaşır.

Epigenetik Dönüşüm 3. fibroblast Kaplama

  1. Hücre kültür tabaklarına 0.26 ml /% 0.1 domuz jelatin cm2 (1.1 de tarif edildiği gibi hazırlandı) ekleyin. kaplamak için 2 saat bekleyin.
  2. fibroblastlar kaplama öncesinde kaplama çözümü fazlalığı 10-30 dk çıkarın.
  3. kültür kaplarından fibroblast kültürü ortamı çıkarın. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın% 1 antibiyotik antimikotik çözüm ile desteklenmiş.
  4. Tripsin-EDTA solüsyonu (0.5 g / L domuz tripsin ve 0.2 g / L EDTA) ince bir tabaka (kültür ortamı hacminin% 10'u) ekleyin ve hücre tekli-tabakası doku altından ayırmak başlayana kadar 37 ° C'de inkübe kültür çanak ve hücreler ayırmak.
  5. fibrobl 9 parça hücre süspansiyonu seyreltilirAST kültür ortamı tripsin işlemi nötralize etmek.
  6. Oda sıcaklığında, bir mikroskop altında bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın. / Cm2 7.8 x 10 4 fibroblastlann bir hücre konsantrasyonu elde etmek üzere, hücreler tekrar süspansiyon fibroblast kültür ortamı gerekli hacmi hesaplanır. Bu, kullanılan odanın belirli türüne bağlı olacaktır.
    Hücreler / ul = küçük ızgara x 90 (çarpım faktörü) x seyreltme başına hücre ortalama sayısı
  7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 g'de santrifüje hücre süspansiyonu. fibroblast kültürü ortamı önceden hesaplanmış hacmi ile supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak.
  8. % 0.1 jelatin önceden kaplanmış tabaklar ve% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 24 saat süre ile kültür bunları plakası hücreleri.

De-metile Ajan 5-aza-CR Kullanılması 4. Artış Hücre Plastisitesi

  1. gün 0
    1. DMEM yüksek glükoz medi 10 ml 5-aza-CR 2.44 mg çözülmesiyle 5-aza-CR stok çözelti hazırlayınum. filtrasyon ile sterilize edin. kullanımdan hemen önce 5-aza-CR stok hazırlayın.
    2. fibroblast kültür ortamında (nihai konsantrasyon 1 uM), 1 ml 5-aza-CR stok çözeltisi 1 ul seyreltilir.
    3. Hücre esneklik, hücre kaplama (alt pozisyon 3.8) 24 saat sonra artırmak için, tohumlanmıştır fibroblastlardan kültür ortamı çıkarın ve CO2 inkübatör% 5, 37 ° C de 18 saat 1 uM 5-aza-CR stok çözeltisi ve kültürü ilave edin.
  2. 1.gün
    1. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, taze insan pluripotent (HP) orta hazırlayın.
    2. 1 uM 5-aza-CR inkübasyondan sonra, 5-aza-CR uzaklıkta durulanır sağlamak için üç kez PBS ile Ortamı çıkarın ve hücreleri yıkayın.
    3. Inkübe 5-aza-CR,% 5 CO2 içinde 37 ° C de 3 saat (geri kazanım dönemi) için HP ortam ile muamele edilmiş fibroblastlar.
    4. iyileşme süresinden sonra, orta kaldırmak üç kez PBS ile yıkayın.
    5. 5-aza-CR tedavisinin etkinliğini izlemek için, bu adım f kontrolveya morfolojik değişikliklerin varlığı (Sonuçlar bölümünde ayrıntılı). Hücreler fibroblast tipik uzatılmış morfoloji kaybeder ve genişlemiş çekirdekleri ile, boyut olarak daha küçük olma yuvarlak veya oval bir şekil kazanır.
    6. Pankreas farklılaşma ile devam edin.

5. Pankreas Farklılaşma Protokolü

  1. gün 1-6
    1. Tablo 2'de tarif edildiği gibi pankreatik bazal ortam hazırlar.
    2. Bir stok solüsyonu aktivin hazırlayın: steril su 166.6 ul bir rekombinant insan proteini aktivin 5 ug çözülür.
    3. Kültür 5-aza-CR,% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 6 gün boyunca (5.1.2 bakınız) 1 ul / ml aktivin bir stok çözelti ile desteklenmiş, 0.26 mL / cm Pankreas bazal maddesi 2 fibroblastlar işlemden geçirildi. orta gazetesine değiştirin.
  2. gün 7-8
    1. retinoik ACI 50 mg dimetil sülfoksit (DMSO) 16.6 ml ekleyerek retinoik asit stok çözelti hazırlayınd.
    2. Pankreas Bazal Ortamda 0.26 ml / cm2 Kültür hücreleri 1 ul / ml 37 ° C de bir stok çözelti (5.1.2) ve 2 gün süre ile 1 ul / ml retinoik asit stok çözeltisi (5.2.1 bakınız) aktivin Cı ile desteklenmiş % 5 CO 2. orta gazetesine değiştirin.
  3. gün 9-36
    1. Pankreas Bazal Ortamda 0.26 ml / cm2 Kültür hücreleri (h / h), insülin transferin-selenyum (ITS),% 2 (v / v) ile B27 ve% 0.1 (h / h) Rekombinan insan FGF bazik% 1 ile desteklenen % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de (bFGF) stok çözeltisi (Tablo 1 e bakınız). İlk 15 gün boyunca günde orta değiştirin.
    2. günden sonra 16, kültür çanak alt ayırmak olabilir agrega hücreleri oluşturan bu yana, bir mikroskop altında, her gün orta yenileyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

deri biyopsisi primer kültürün oluşturulması
Deri biyopsileri, küçük parçalar halinde kesilmiş ve jelatin önceden kaplanmış tabaklar içine yerleştirilmiştir. 6 gün sonra, fibroblastlar doku parçaları dışında büyümeye başladı ve bir hücre tek tabaka (Şekil 1A) kurdu. Hücreler tipik ince uzun bir şekle gösterdi ve beklendiği gibi, fibroblast spesifik bir işaretleyici vimentin (um, Şekil 1B) için tek tip bir bağışıklık-pozitif gösterilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bu yazıda bir dokuya özgü indüksiyon protokolü takiben 5-aza-CR geçici ve kısa maruz kalma ile, insülin üreten hücreler, insan deri fibroblast dönüşümünü sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım transkripsiyon faktörleri veya microRNA zorla ifade ne de hücreler daha istikrarsız ve hatalar 14 eğilimli kılan istikrarlı bir pluripotent devletin satın alma olmadan, mezodermden endoderm ilgili hücrelere bir anahtar verir.

İlk adımda, hücre plastisite terminal açıdan farklılaşmı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Carraresi Vakfı ve Diyabet Araştırmaları için Avrupa Vakfı (EFSD) tarafından finanse edildi. GP Milano Üniversitesi'nden bir post-doc bursu tarafından desteklenmektedir. Epigenetik ve Periconception çevre ve BM1308 Paylaşımı büyük hayvan modellerinde gelişmeler MALİYET Eylem (Salaam): Yazarlar MALİYET Eylem FA1201 EPICONCEPT üyeleridir. TALB'e MALİYET Eylem CM1406 epigenetik Kimyasal Biyoloji (EPICHEM) üyesidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu TuzluSigmaD5652PBS; hücre yıkama ve çözelti hazırlama için
Antibiyotik AntimikotikÇözelti SigmaA5955Fibroblast, HP ve Pankreas ortamının
Fibroblast izolasyonu için100 mm Petri kabıSarstedt83.3902
Bulaşık kaplama içinDomuz JelatiniSigmaG1890
WaterSigmaW3500Çözelti hazırlama için
35 mm Petri kaplarıSarstedt83.39Fibroblast izolasyonu için
DMEM, yüksek glikoz, piruvatYaşam Teknolojileri41966052Fibroblast kültür ortamı için
Fetal Sığır SerumuYaşam Teknolojileri10500064FBS; Fibroblast ve HP ortamının bileşeni
L-Glutamin çözeltisiSigmaG7513Fibroblast, HP ve Pankreas ortamının
Tripsin-EDTA çözeltisiSigmaT3924Fibroblast ayrışması için
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 IZGARALIHycor Biomedical87144Hücre sayımı
5-AzasitidinSigmaA23855-aza-CR, inkrimeraz hücresi için Fibroblastlarda plastisite
Ham'ın F-10 Besin KarışımıYaşam Teknolojileri31550031HP orta
DMEM, düşük glikoz, piruvatiçin Yaşam Teknolojileri31885023HP ortamı için
KnockOut Serum ReplasmanıYaşam Teknolojileri10828028HP ortamı
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitlerin Bileşeni Çözelti ÖmrüTeknolojileri11140035HP ve Pankreatik Bazal ortamın bileşeni
2-MerkaptoetanolSigmaM7522HP ve Pankreas Bazal ortamının bileşeni
GuanozinSigmaG6264Nükleosit karışım stoğu HP ortamının
AdenozinSigmaA4036ortamının nükleosit karışım stoğu bileşeni
CytidineSigmaC4654HP ortamının nükleosit karışım stoğu bileşeni
UridineSigmaU3003nükleosit karışım stoğu bileşeni
mikro'nun nükleosit karışım stoğu bileşeni
; mMilliporeSLGS033SBÇözeltinin sterilizasyonu için
FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinant İnsan ProteinYaşam TeknolojileriPHG0261bFGF; HP ve Pankreas Bazal ortamı
Sığır Serumu AlbüminSigmaA3311BSA'nın bileşeni; Pankreas Bazal Ortamı
DMEM/F-12Yaşam TeknolojileriBileşeniPankreas Bazal Ortam
B-27 Takviyesi için 11320074 Eksi A VitaminiYaşam Teknolojileri12587010Pankreas Ortamı
Bileşeni N-2 TakviyesiYaşam Teknolojileri17502048Pankreas Bazal Ortamı
Bileşeni Aktivin A Rekombinant İnsan Proteini Yaşam TeknolojileriPHG9014Pankreas ortamı
için Retinoik AsitSigmaR2625Pankreas ortamı
için Dimetil sülfoksitSigmaD2650DMSO; Retinoik Asit stok hazırlama için
İnsülin-Transferrin-SelenyumYaşam Teknolojileri41400045ITS; Pankreas için Son ortam
Anti-Vimentin antikoru Abcamab8069İmmünositokimyasal analiz için. Çalışma seyreltme 1:100
4′,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorürSigma32670DAPI. İmmünositokimyasal analizler için. Çalışma seyreltme  1 ve mikro;
5-MetilsitidinEurogentecMMS-900P-B. Çalışma seyreltme 1:500
Anti-C Peptid antikoru Abcamab14181İmmünositokimyasal analizler için. Çalışma seyreltme 1:100
Anti-PDX1 antikoru Abcamab47267İmmünositokimyasal analizler için. Çalışma seyreltme 1:500
Mercodia İnsülin ELISAMercodia10-1113-10İnsülin salınımı tespiti için
bileşeni bileşeni bileşeni HP HP orta Timidin Sigma T1895'in HP orta Millex-GS 0,22 ve İmmünositokimyasal analisys için g / ml

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

5 aza sitidin UygulamasPankreatik DiferansiyasyonRetinoik Asit nd ksiyonuAktivin A TakviyesiITS B27 BFGS BesiyeriPDX1 CPEP Ko lokalizasyonuGlikozla Stim le ns lin Sal n m

İlgili makaleler