Yöntem makalesi

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

DOI:

10.3791/53883

⸱

2 Şubat 2016

 , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 3Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 4Genome and Systems Biology Degree Program, National Taiwan University and Academia Sinica

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaprak biti embriyoları üzerinde tam montajlı immün boyama protokolü sunulmuştur, burada arka plan boyamasını azaltmak ve doku geçirgenliğini artırmak için kritik koşullar ele alınmaktadır. Bu koşullar, yaprak bitlerinin embriyonik dokularında protein ekspresyonunun etkili bir şekilde tespit edilmesi için özel olarak geliştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezelye yaprak biti Acyrthosiphon Pisum, bir sıralı genom ve bol fenotipik plastisite ile genomik ve gelişimsel çalışmalar için gelişmekte olan bir model haline gelmiştir. Diğer yaprak bitleri, A gibi. Pisum embriyoları ovaryol bir montaj hattı moda yumurta odaları içinde geliştirmek partenogenetik doğuran üreme yoluyla hızla yaymak. Daha önce biz yaprak biti embriyolarda mRNA ifadesinin tespiti sağlayan in situ hibridizasyon tam mount güçlü bir platform kurduk. Protein ifadesini analiz etmek için olsa da, tatmin edici sonuçlar üretmek değil aseksüel viviparous Yaprakbitlerinin ovaryolden immün için protokol kurdu. Burada doku geçirgenliğini artırarak ve kurulan yaklaşımları uygularken sorunlarla her ikisi de arka plan boyama, azaltmak için optimize edilmiş koşulları bildirmektedir. Optimizasyon içerir: esas f bulunmuştur proteinaz K (1 ug / ml, 10 dakika), (1) inkübasyonorta ve geç evre yaprak biti embriyolarda veya antikor penetrasyon; Bir digoxigenin (DIG) tarafından tedarik edilen bir bloke edici tepkin madde ile normal keçi serumu / büyükbaş hayvan serum albümin (2) yerine ayarlanmış tampon ve endojenez peroksidazı ağartılması için, metanol yerine hidrojen peroksit (H2O 2), (3) bir uygulama merkezli; bu anlamlı biti dokularda bir arka plan renklendirmesini azaltmıştır. Immün için optimize Bu kritik şartlar A. Pisum ve diğer Yaprakbitlerinin embriyolar gen ürünlerinin etkin algılama sağlayacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaprak bitleri küçük (1-10 mm) yumuşak organları ile hemipteran böceklerdir. Onlar piercing, ağız parçaları ile floem öz suyunu emerek bitkiler üzerinde beslenirler. Ek olarak, floem özsuyu diyet eksiktir esansiyel amino asitleri sentezlemek için, bir zorunlu endosimbiyotik bakterinin, Buchnera aphidicola güveniyor. Yaprak bitleri bahar ve yaz uzun gün fotoperiyodların ve kışlama yumurta 1,2 sınırlı sayıda yatıyordu sırasında kısa gün fotoperiyodların tarafından tetiklenen cinsel yumurtlayarak çoğalan üreme sırasında partenogenetik viviparous üreme içeren karmaşık bir hayat öyküsü var. İlkbaharda bu yumurtalar sonbahara kadar partenogenetik üreme çok sayıda mermi takip, hepsi kadın yaprak bitleri (fundatrices) birinci nesil üretmek için yumurtadan. Yıllık yaşam döngüsünde eşeysiz ve cinsel fazlar alternatif, evrimsel yenilik 1,2 olarak kabul edilmiştir yaprak bitleri, devresel parthenogenesis. Partenogenetik viviparous yaprak bitleri içinde, Embryogenesis yumurtalık tübül (ovaryolden) yumurta odaları içinde yer alır. Buna karşılık, cinsel yumurtlayarak çoğalan embriyolar döllenmiş yumurtanın içinde gelişir. Ayrı üreme plastisite gelen, yaprak bitleri kuşaklararası kanat polyphenism görüntüleyebilirsiniz: kalabalık sinyalleri ve predatör tehditlerine yanıt olarak, unwinged aseksüel dişiler viviparously uzun mesafe göç kanatlı yavrular üretebilir. Bezelye yaprak biti genom dizisinin Yayın Acyrthosiphon Pisum -the ilk genom sekansı, bir bazal hemimetabolus böcek sağlar üreme plastisitesi, kanat polyphenism ve molekül üzerindeki yaprak biti böcek bitki etkileşimleri viral vektör ve ortak yaşam dahil olmak üzere diğer özelliklerin daha da araştırma temeli 3.

Sıralı genom ek olarak, gen ekspresyonu ve fonksiyonunu karakterize etmek için araçlar, olgun bir model organizma olarak 4 bezelye yaprak biti teşvik etmek için gereklidir. Biz bütün-mount sağlam protokoller tanımlamışlardır biti embriyoların 5-7 mRNA ekspresyonunu tespit etmek için in situ hibridizasyon. Çift kollu bir RNA enjeksiyon ve besleme ile RNA interferans (RNAi) biti nimf ve yetişkinlerde gen susturma kullanılmaktadır, ancak embriyolar demonte gen için stabil şartlar yapılmamış 8-10 rapor edilmemiştir. Immün ve RNAi demonte sonra bezelye yaprak biti embriyolar 11-13 yapılmadan önce numuneler içindeki protein ifadesi tespit edebilir bir antikor-bazlı yaklaşım. Ancak, doku geçirgenliği ve arka plan boyama ortadan kaldırılması artış bezelye yaprak biti aseksüel viviparous embriyolar immün standart protokolleri kullanarak henüz tatmin edici değildir. Örneğin, dokulara antikorun bu penetrasyon Gastrulasyon embriyolarda azaldığı bulundu (8-10 evre) ve morfolojik olarak tanımlanabilir ekstremite tomurcukları (aşamaları 13-14) ile embriyolar antikor zorlukla geçirgen olduğunu. Buna ek olarak, arka plan renklenmesi eşeysiz viviparo görüntülenmiştir edildigerm işaretleyici Vasa yanı sıra buna karşı embriyonik segmentlerde 12,13 olarak ifade Engrailed / Invected proteinine karşı antikor kullanılarak boyandı bize bezelye yaprak biti embriyolar. Aslında arka plan renklenmesi yine tek başına ikincil antikor ile boyandı embriyolar açıkça görülebilir.

Yaprak biti dokuların bütünlüğünü bozmadan geçirgenliğini arttırmak için dikkatli bir şekilde proteinaz K konsantrasyonunun titre edildi ve yaprak biti embriyolar Doku sindirimi için en uygun koşulları belirlendi. Bezelye yaprak biti spesifik olmayan lekelenmenin engellenmesi için, etkili bir şekilde bloke eder ve embriyolar endojen peroksidaz (POD) aktivitesini, immün sırasında sinyallerini yükseltmek için kullanılan bir enzim baskılayabilir bileşikleri aramışlardır. Geleneksel olarak kullanılan normal keçi serumu yerine (NGS) bir digoxigenin (DIG) bazlı tampon seti tarafından temin edilen bir bloke edici tepkin maddesi / sığır serum albümini (BSA), önemli ölçüde bir arka plan renklendirmesini azalttı. Ayrıca, metanol inhi bulunmuşturHidrojen peroksit daha etkili endojen POD faaliyetini bit (H 2 O 2). Embriyoların üzerinde immün için bu yaprak biti özgü koşullarına ilişkin ayrıntılar aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaprak bitleri 1. Kültür

NOT:. Partenogenetik viviparous bezelye yaprak biti A laboratuvar zorlanma Pisum başlangıçta merkezi Tayvan'da toplandı ve 300'den fazla nesiller için uzun gün fotoperiyodunda konak bitkileri (bahçe bezelye Pisum sativum veya bakla Vicia faba) yetiştirilen olmuştur (bir kuşak: ~ 10 gün).

  1. Tohum Çimlenme
    1. Oda sıcaklığında 3-5 gün boyunca musluk suyu konakçı bitkilerin tohumlarının bekletin. Günde bir kez temiz su ile doldurun.
      NOT: Alternatif olarak, düz nemli toprağa konukçu bitkilerin tohumları koyarak yanı sıra çimlenme neden olabilir.
    2. Işık periyodu 16 saat aydınlık / 20 ° C'de 8 saat karanlık altında bir büyüme odasında toprak ile küçük bir kap (9 cm çapında x 7 cm boyunda) içinde 10 çimlenme tohum büyütün.
    3. Büyüme başlıyor Yaklaşık 10 gün sonra, kimin yüksekliği en fazla 8 cm bitkiler üzerine kurtları aktarmak.
  2. Yaprak bitleri Devri
    1. , 1 L'lik bir cam beher içinde bitkilerin her saksı tutun bir boya fırçası ile bitkiler üzerine 8, yetişkin kurtları aktarmak ve sonra kaçmasını önlemek için yaprak bitleri gibi gazlı mesh olarak hava geçirgen bir kapak ile beher mühür.
    2. Işık periyodu 16 saat aydınlık / 20 ° C'de 8 saat karanlık altında bir büyüme odasında inkübe yaprak bitleri. Her gün bir kez bitkilerin her bitki pot sulayın.
    3. Yaprakbitlerinin nesil elde etmek için, adımları 1.1.3-1.2.2 on gün birincil yaprak biti transferinden sonra yineliyoruz.

2. Diseksiyon ve Yumurtalıkların Fiksasyon

  1. Taze sabitleme tampon 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlar.
  2. PFA (yaklaşık 500 ul) ile bir nokta plakasının bir kuyu doldurun düşük büyütme stereo mikroskop altında plaka yerleştirin ve diseksiyon için PFA içinde yetişkin bir afidi daldırın.
  3. , Forseps bir set ile baş ve karın tutan dorsal açık keserek yumurtalıkların teşrihKarın manikür ve karın boşluğunun uzak yumurtalıklar sürükleyerek.
  4. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında PFA 1 ml ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içinde yumurtalık üç çift sabitleyin.
  5. Bir transfer pipet (cam ya da tek kullanımlık) 1x PBS içinde% 0.2 TritonX-100 (PBST) 10 dakika her 3 kez yumurtalıkların yıkayın ve sonra birlikte Durusu sabitleme tampon. Hafif (dönüş açısı: 60 ° (F60) / devir hızı: 8 RPM) bir mikser / rotator sallayarak sabitleme ve yıkama hem de tavsiye edilir.

3. proteinaz K (PK) ile tedavi Embriyonik Dokuların Geçirgenlik Artırma

NOT: PK tedavisi ileriye mikrop bant uzantısı (evre gelişme 11) embriyolar uygulanır. Genç embriyoların için, bu adım isteğe bağlıdır.

  1. Seri olarak çalışma konsantrasyonu 1 mg / ml'ye 1x PBS ile PK'nin stok solüsyonu (10 mg / ml) seyreltin.
  2. Hafif çalkalama ile 10 dakika için PK (yaklaşık 500 ul) 1 ug / ml yumurtalık inkübe edin.
  3. Durusu PK solutive Glisin 700 ul (2 mg / ml) 5 dakika her biri için 3 kez yumurtalıkların yıkama ile.
  4. 10 dakika her biri iki kez% 0.2 PBST ile yumurtalıkları yıkayın.
  5. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sabitleme tamponu ile tekrar yumurtalıkların sabitleyin.
  6. Süpernatantı atın ve 10 dakika her biri için iki kez% 0.2 PBST ile yumurtalıkların yıkayın.

4. Metanol Kuluçka Endojen peroksidaz Bastırma (POD) faaliyeti için

Not: Metanol inkübasyon metanol duyarlı Phalloidin boyama veya antikor epitoplarının tutulan embriyolarda uygulanmaz.

  1. Seri olarak% 0.2 PBST içinde metanol farklı yüzdesi yumurtalıkların dihidrat (3: 1: 1: 1, 3: 1 h / h) hafif ajitasyon ile, 10 dakika boyunca metanol çözeltisinin her konsantrasyonunda yumurtalıkları inkübe edilerek.
  2. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 100 metanol ile yumurtalıkları kurutmak.
    Not: boyama tatmin edici sonuçları hala% 100 metanol içinde depolanmıştır biti dokulardan elde edilebilir ve -20# 176; C bir ay.
  3. Seri olarak% 0.2 PBST içinde metanol farklı yüzdesi yumurtalıkların rehidrate (1: 1: 1: 3, 1: hac / hac 3) hafif ajitasyon ile, 10 dakika boyunca metanol çözeltisinin her konsantrasyonunda yumurtalıkları inkübe edilerek.

5. Antikor Boyama

  1. DIG-tabanlı tampon kümesinden 10x engelleme çözümü sulandırmak (DIG-B) 1x için.
    Not: 1x DIG-B bloke edici solüsyonu (BSA standardı bloke% 5 oranında reaktif maddesi (hac / hac) normal keçi serumu (NGS) ve% 0.5 (v / v) inek serumu albümini daha boyama arka azaltmak için daha etkilidir )% 0.2 PBST içinde.
  2. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de oda sıcaklığında ya da O / N oranında 2,5 saat 4 için 1x DIG-B bloke edici bir solüsyonuyla yumurtalıkların inkübe edin.
    NOT: 1.5 ml tüp içinde yumurtalıkların üç çift için 200 ul örnek engelleme ve antikor boyama için minimum hacimdir.
  3. Süpernatant Durusu ve uygun diluti birincil antikor içeren taze 1x DIG-B engelleme çözümü ile değiştirinoranı. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de oda sıcaklığında ya da O / N 4 saat boyunca yumurtalıkları Leke.
    Not: (1) ApVas1 antikoru: 1: Burada anlatılan deney için, primer antikorların müteakip optimum dilüsyonları kullanımı kromojenik boyama 500, immünofloresan boyama 1:50; (2) anti-α tübülin antikoru: 1: 500; (3) 4D9 monoklonal antikoru: 01:25.
  4. 15 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez yumurtalıkların yıkayın.
  5. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1x DIG-B bloke edici bir solüsyonuyla yumurtalıkların inkübe edin.
  6. Süpernatant Durusu ve taze 1x DIG-B engelleme çözümü uygun seyreltme oranında ikincil antikor içeren değiştirin. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de oda sıcaklığında ya da O / N 4 saat boyunca yumurtalıkları Leke.
    1. İkincil antikor, aşağıdaki seyreltme oranları kullanın: (1) için immünofloresan boyama: 1: Alexa Fluor 633 keçi anti-tavşan IgG veya Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG ile 500; (2) boyama için kromojenik: 1: 200 biyotinile keçi anti-tavşan IgG.
      Not: biyotinlenmiş sekonder antikor boyama sinyalleri önemli ölçüde güçlendirilmiş olan, alt-tabaka bazlı (kromojenik) algılama bölgesi avidin-biyotin-kompleksi (ABC) etkileşime girmek için uygulanır.
    2. Ikincil antikor duyarlı hafif olduğu için immünofloresan boyama için, karanlıkta boyama yürütmek.
  7. 10 dakika her biri için% 0.2 PBST ile 4 kez ikincil antikor yıkayın.

6. Nükleer ve F-aktin Boyama

Not: Bu yalnızca immünofloresan boyama uygulanır.

  1. Karanlıkta oda sıcaklığında DAPI (2 ng / | il) ve 2 saat Phalloidin-TRITC (100 nM) ihtiva eden% 0.2 PBST ile yumurtalıkları Leke.
  2. 10 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez yumurtalıkların yıkayın.
  3. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de montaj orta O / N yumurtalıkların inkübe edin.

7. Sinyal Geliştirme

Not: Bu yalnızca kromojenik boyanması için uygulanır.

  1. 100 ul hazırlayınbiyotin yaban turpu peroksidaz ile konjüge edilmiş (Reaktif B 1 ul,% 0.2 PBST 98 ul Reaktif A (avidin) 1 ul ekleyerek yumuşak pipetleme ile iyice karıştırarak ve ekleyerek sinyali artırmak için (ABC) reaktif avidin-biyotin-kompleksi ), anında karıştırılması, ardından. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı.
  2. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca belirteç, A ve B karışımı içinde (kopuk yumurta odaları dahil) yumurtalık inkübe edin.
  3. 10 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez belirteç, A ve B karışımı yıkayın.
  4. Plastik damlalık ile nokta plaka üzerinde bir kuyuya PBST batmış yumurtalıklar aktarın.
  5. 3,3'-diaminobenzidin (DAB) içinde alt-tabaka çözeltisi hazırlayın: Bir DAB tablet artı 1 dakika boyunca güçlü döndürülerek ile GKD 2 O, 1 ml bir tane ihtiva eden üre hidrojen peroksit çözülür.
    NOT: DAB, peroksidaz bir tetikleyici substrat, immün için popüler bir Kromojen olduğunu. Bir br üretirperoksidaz tarafından okside sonra kendi ve çözünmez çökelti. Zayıf sinyalleri alt-tabaka çözeltisi (nihai konsantrasyon 0,05-0,08%) nikel klorit ilave edilerek artırılabilir.
  6. Oyuk kalan PBST solüsyonu çıkarın ve sinyal gelişimi için DAB alt-tabaka çözeltisi 100 ul ile doldurun.
  7. Düşük büyütme stereo mikroskop altında sinyallerin yoğunluğunu izleyin.
  8. Hemen 1x PBS ile dolum ardından DAB çözüm kaldırarak tepkilerini durdurun. İki kez yıkama tekrarlayın.
  9. 1,5 ml'lik bir tüpe geri yumurtalıkların aktarın ve daha sonra 15 dakika her biri için iki kez 1 x PBS veya PBST ile yıkanır.
  10. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de, bir gliserol tabanlı bir montaj ortamına (70% gliserol) O / N olarak yumurtalıkların inkübe edin.

8. Yaprak biti Embriyolar Montaj

NOT: Yaprak biti embriyoların kalınlığı gelişim aşamaları arasında değişmektedir. Montaj stratejileri, böylece erken uyacak şekilde modifiye (germaria ve 0-10 aşamaları), orta (aşamaları vardırŞekil 2B gösterilmiştir 11-18), ve geç embriyolar (aşamaları 19-20), - D. Embriyonik evreleme Miura ve ark izledi. 12

  1. Düşük büyütme stereo mikroskop altında örnekleri plastik damlalık ile hücre tepsisine montaj orta ile birlikte yumurtalıkların aktarın ve gözlemleyin.
  2. Böcek pimleri kullanarak yan yumurtalık ile ilgili kaliksi kesin ve daha sonra bir damlalık ile de boş cam bir izole ovaryol aktarın. Montaj orta kullanarak ul 50-100 son hacim Makyaj.
  3. Cam damlalık ile slayt üzerine bir ovaryol aktarın ve ardından böcek pimleri kullanarak yumurta odaları incelemek.
    NOT: geliştirme aşamasında 6 yaşından büyük embriyolar için yumurta odaları ayrılması tavsiye edilir; germaria ve evre 6 yaşından küçük ilk iki yumurta odaları için, ayrılık isteğe bağlıdır.
  4. Cam damlalık kullanarak temiz bir slayt bir disseke yumurta odasına yerini değiştirin.
  5. Bir Lamel (boyut koyun: 22 x 22disseke germaria ya da yavaş kabarcıkları önlemek için yumurta odaları (aşamaları gelişimin 1-10 embriyolar içeren) üzerinden mm).
    1. Dağı yumurta odaları tek taraflı lamel köprü ile bir slayt (aşamaları gelişimin 11-18 embriyolar içeren) ve başka bir lamel yerleştirin: numune üstünde (boyut 18 x 18 mm).
    2. Dağı yumurta odaları çift taraflı lamel köprü ile bir slayt (geliştirme aşamasında 19 yaşından büyük embriyoları içeren) ve başka bir lamel yerleştirin: numune üstünde (boyut 18 x 18 mm).
  6. Numuneyi kurumasını önlemek için montaj medya ile üst lamel altında boşluğu doldurmak.
  7. Hafif gözlem için doğru yönlendirmeyi elde etmek için lamel kaydırarak embriyo döndürün.
  8. Oje ile (köprü lamelleri dahil) lamelleri kenarına etrafında mühür.

9. Görüntüleme Analizi

  1. Fotoğraf diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri compou ile embriyolar tüm montajnd mikroskop DIC optik ve kameraya bağlı bir kuru objektif lens (10X, 20X, 40X) ile donatılmış. Üreticinin talimatlarını kullanarak kamera ve bilgisayar arasındaki görüntü aktarımı için yazılımı yükleyin.
  2. Bir lazer-tarama konfokal mikroskop 14 floresan etiketli embriyoların projeksiyonlar elde edin. , Fotoğraf z-istifleme ve 3D görüntüleme yazılımı ile projelendirme için üreticinin yönergelerini izleyin.
    1. 10X amacı ile monte örneği bulmak, baş aşağı slayt çevirin ve ince yağlı bazlı kalem ile örnek alan daire.
      NOT: Bu konfokal mikroskop hedefleri doğrultusunda bunun ararken örnek daha kolay belirlenmesi yapar.
    2. Karşı tarafta 9.2.1 de açıklandığı gibi etiketlenmiş lamel alanının üstünde bir damla yağ ekleyin.
  3. 40X yağ daldırma amaca odak düzlemi daha sonra bir 63X yağ daldırma hedefi değiştirmek bulun. Manuel olarak ince odak denetimi taşımak ve yapılacakwn iyi odak düzlemi yakalamak için.
    NOT: germaria ve erken embriyo yapısal ayrıntıları gözlemleyerek için, 40X hedefleri veya daha yüksek büyütme olanlar kullanmanızı öneririz.
  4. Farklı uyarma kanallarda embriyo tarayın ve z-yığın görüntü elde.
    Not: bezelye yaprak biti dokuları, 1.5 um ya da daha az kadar her bir optik bölümünde kalınlığını azaltır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, biz aseksüel bezelye yaprak bitleri (Şekil 1A) embriyolar üzerinde tüm montaj immün uygulandı. Bu dişiler partenogenetik ve viviparously yavrular üretirler. Bu kadın embriyolar yumurtalık tübül (ovaryolden) (Şekil 1B ve Şekil 2A) yumurta odaları içinde gelişir. Mikroskopi önce disseke ovaryolden boyama hedefleri; Bununla birlikte, yumurta bölmelerinin ayrılması, bir mikroskop (- D Şekil

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bezelye yaprak biti A başarılı immün kritik uygun koşulları belirledi. Pisum, genomik ve gelişim çalışmalarında 3,15 için gelişmekte olan bir model organizmadır. Doku geçirgenliğini artırarak ve arka plan boyama azaltmak için optimize edilmiş koşullar yoğunluğu ve sinyallerin özgüllüğünü geliştirilmiş. Bunlar, hücre zarlarında gözenekleri oluşturma ve spesifik olmayan bağlanma bloke edici antikor için aşamalar diğer hayvan modellerinde immün için standart protokollere göre farklılık göst...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monoklonal 4D9 antikorunu sağladığı için Chau-Ti Ting'e (Tayvan'daki Fly Core), konfokal mikroskopi için College of Life Science NTU'nun Technology Commons'ına (TechComm), el yazmasını düzelttiği için Hsiao-Ling Lu'ya ve çekimlere yardımcı olduğu için Chen-yo Chung'a minnettarız. CC, stratejik öneriler sağladığı ve makalenin eleştirel düzenlemesi için Charles E. Cook'a özellikle teşekkür eder. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (GWL ve CC için 101-2313-B-002-059-MY3 ve 104-2313-B-002-022-MY3) ve Ulusal Tayvan Üniversitesi (CC için NTU-CESRP 101R4602D3; GWL için 103R4000) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 30 hidrojen perksidaz (H2< / sub>O2< / sub>)Sigma-Aldrich18304Embriyoların endojen peroksidazının ağartılması için.
4' 6-diamidino-2-fenil-indol dihidroklorür (DAPI)Sigma-AldrichD9542Çift sarmallı DNA'yı etiketlemek için. ZEHİRLİ. Eldiven giyin, küçük alikotlara dağıtın ve maruziyeti en aza indirmek için feeze
4D9 anti-engrailed / invected fare monoklonal antikoruGelişimsel çalışmalar hibridoma bankasıAB_528224Embriyonun gelişmekte olan segmentlerini etiketlemek için.
ApVas1 tavşan poliklonal antikoruLaboratuvarımızN/AEmbriyolarda yaprak biti germ hattına özgü Vas1 proteinini etiketlemek için. Bu antikor laboratuvarımız tarafından yapılmıştır.
Austerlitz Böcek pimleriENTOMORAVIAN/AHer bir yumurta odasını bir yumurtalıktan ayırmak için kullanılır. Boyut 000, SİYAH EMAYE LED. 
Sığır serum albümini (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için.
Yaprak biti embriyolarının fotoğrafını çekmek içinbileşik mikroskopCanonEOS 5D'ye
Kolorimetrik 8 hücre tepsisiKartell Labware357Yaprak biti embriyolarının boyama sinyalini geliştirmek için. Çap 95 x 57 mm, hücre derinliği 2 mm.
DIC optikli bileşik mikroskopLeica MicrosystemsDMRSlaytlara monte edilmiş yaprak biti embriyosunun fotoğrafını çekmek için.
DIG Yıkama ve Blok Tampon SetiSigma-Aldrich (Roche)11585762001Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için. 10x Bloke etme solüsyonunu bloke edici reaktif olarak 1x'e seyrelttik.
Forsepsİdeal-tekN/A Yaprakbitlerinden yumurtalıkların diseksiyonu için. Üretici parça No 5: 5 SA. 
Cam damlalıkN/AN/AYaprak bitlerinin yumurtalıklarını splot plakasından tüplere aktarmak için. 150 mm toplam uzunluk ve 5 3/4" uç uzunluğu.
GliserolSigma-AldrichG5516Yaprak biti embriyolarının temizlenmesi ve montajı için.
GlisinBioshopN/AProteinaz K'nin (PK) enzim aktivitesini bloke etmek için.
Keçi anti-fare IgG konjuge Alexa Fluor 488InvitrogenA11017Fareden primer antikorun tespiti için.
Keçi anti-tavşan IgG konjuge Alexa Fluor 633InvitrogenA21072Tavşandan primer antikorun tespiti için.
Intelli karıştırıcıELMI laboratuvar ekipmanlarıRM-2MReaktiflerin yumurtalıklarla şiddetli reaksiyonunu iyileştirmek için.
Lazer taramalı konfokal mikroskopiLeica MicrosystemsSP5Florecent etiketli slaytlara monte edilmiş yaprak biti embriyosunun fotoğrafını çekmek için.
metanol ve nbsp;Burdick ve JacksonAH2304Embriyoların endojen peroksidazının ağartılması için.
Mikroskop slaytları Termo bilimsel10143560Embriyoların montajı için. SUPERFROST zemin kenarları, ca./env. 76 x 26 mm.
Mikroskop Kapak camlarıMarienfeld0101030Embriyoları slaytlara monte etmek için. Boyut: 18 x 18 mm. Kalınlık No. 1 (0,13 ila 0,16 mm)
Mikroskop Kapak camlarıMarienfeld0101050Embriyoları slaytlara monte etmek için. Boyut: 22 x 22 mm. Kalınlık No. 1 (0,13 ila 0,16 mm)
fare monoklonal anti-alfaTubulin antikoru (DM1A)Santa Cruz Biotechnologysc-32293Hücrelerin alfa-tubulin dağılımını etiketlemek için.
OjeN/AN/ASlaytlardaki lamellerin sızdırmazlığı için kullanılır.
Normal keçi serumu (NGS)Sigma-AldrichG9023Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için.
Paraformaldehit (PFA)VWRMK262159Yaprak biti yumurtalıklarının fiksasyonu için.
Phalloidin-TRITCSigma-AldrichP1951F-aktinin embriyolar üzerindeki dağılımını etiketlemek için.
Fosfat tamponlu salin (PBS)N/AN/AYaprak biti yumurtalıkları için izotonik çözelti olarak.
Plastik damlalıkN/AN/AYaprak bitlerinin yumurtalıklarını tüpten hücre tepsisine aktarmak için kullanılır. Boyut 3 ml. 
Proteinaz KMerck124678Hücre zarı üzerinde gözenekler oluşturmak (delme) ve antikorların erişimini kolaylaştırmak için kullanılır.
Pyrex spot plakasıN/AN/AMikroskopi altında yaprak biti yumurtalıklarının diseksiyonu ve renk reaksiyonları için. Çapı 22 mm olan her boşluk ve  derinlik 7 mm.
SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidin (DAB) tabletleri Sigma-AldrichD4168Alt tabakalı sinyallerin geliştirilmesi için. DAB peroksidaz substrat tablet seti olarak da adlandırılır.
Stereo mikroskopLeica MicrosystemsEZ4Yaprak biti yumurtalıklarının diseksiyonu ve gözlemi için.
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787Hücre zarında gözenekler oluşturmak (delme) için.
VECTASHIELD Elite ABC Kiti (Tavşan IgG)Vektör laboratuvarlarıPK-6101Sinyalin iyileştirilmesi için. Biyotinile keçi anti-tavşan IgG ikincil antikoru, A ve B reaktifleri dahil.
VECTASHIELD montaj ortamıVektör laboratuvarlarıH1000Yaprak biti embriyolarının temizlenmesi ve montajı için.
bağlı kamera.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. Minks, A. K., Harrewijn, P. , Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).
  2. Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
  3. The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8 (2), e1000313(2010).
  4. Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).
  5. Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).
  6. Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).
  7. Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).
  8. Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38(2006).
  9. Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63(2007).
  10. Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
  11. Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1 (1), e21(2003).
  12. Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).
  13. Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).
  14. Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237(2014).
  15. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).
  16. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  17. Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  18. Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).
  19. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23 (4), 345-358 (2001).
  20. Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18(2014).
  21. Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm n Boyama ProtokolProteinaz K lemiMetanol ile A artmaDIG Tabanl BloklamaOvaryol DiseksiyonuParaformaldehit FiksasyonuAntikor Penetrasyonu

İlgili makaleler