Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kombine bir 3D doku mühendisliği

9.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53885

⸱

6 Nisan 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hedefli tedavilere karşı duyarlılığı incelemek için biyolojik bir kollajen iskelesine dayalı üç boyutlu (3D) bir akciğer kanseri modeli sunuyoruz. Proliferasyon indeksi, apoptoz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) durumunu belirlemek için farklı okuma teknikleri gösteriyoruz. Toplanan veriler, ilaç duyarlılığının tahmini için in silico bir modele entegre edilmiştir.

Özet

Bu çalışmada, biz belirli bir mutasyon birikimine göre ilaç yanıtının tahminler optimize etmek için siliko modelinde bir bir in vitro 3D akciğer tümörü modeli birleştirdi. Model bazal membran içeren hücre dışı matris kompozisyon ve mimarlık ile ilgili dokuya özgü özellikleri üretir bir decellularized domuz iskele üzerinde oluşturulur. Biz ilaç tedavisinin üç gün olmak üzere 14 gün içinde yapay tümör dokusu nesil sağlayan bir protokol standardize. Bizim makale 3D birkaç ayrıntılı açıklamaları Okuması tarama teknikleri etkinliğini değerlendirmek için yararlı araçlar vardır mezenkimal geçiş M30-ELISA ile süpernatanlarından proliferasyon indeksi Ki67 boyama kıyafetleri, apoptoz tespiti ve epitel değerlendirilmesi (EMT), gibi sağlar terapötik bileşikler. Biz 2B kültürüne Relat olan 3D tümör modelinde çoğalması bir azalma karşılaştırıldığında gösterisi olabilirKlinik duruma ed. Bu, daha az çoğalma rağmen, model HCC827 akciğer karsinoma hücre çizgilerinin karşılaştırılması ile gösterildiği gibi doğru bir şekilde biyomarker durumuna göre EGFR -targeted ilaç yanıtları tahmin (EGFR -mutated Kras vahşi tip) ve A549 (EGFR vahşi tip Kras - tirozin-kinaz inhibitörü (TKİ) gefitinib ile tedavi) mutasyona uğramış. vimentin / pan-sitokeratin immünofloresan boyama ile değerlendirilen daha gelişmiş tümör hücrelerinin ilaca cevabı araştırmak için, TGF-beta-1 uzun vadeli tedavisi ile EMT neden olmuştur. Bir akış biyoreaktör dokusu oluşumunu geliştirilmiş fizyolojik koşullar, kültürün ayarlamak için kullanıldı. Apoptoz, proliferasyon indeksi ve EMT - - Boolean içine siliko modelinde Ayrıca, gefitinib tedavisi veya TGF-beta-1 stimülasyon üzerine ilaç yanıtları entegrasyonunu göstermektedir. Buna ek olarak, belirli bir mutasyon arka plan ve sayısı ile tümör hücrelerinin kadar ilaca cevabı açıklardirence karşı erstrategies tahmin edilebilir. Biz özellikle de siliko genişlemesi ile in vitro yaklaşımında bizim 3D ve 2D hücre kültüründe daha gerçekçi koşullarda klinik öncesi uyuşturucu testi için ek bir değer sağlar eminiz.

Giriş

İlaç endüstrisi çok büyük maliyetler 1-5 sebep klinik fazda kanser tedavisi alanında% 95'e varan yüksek aşınma oranları ile karşı karşıyadır. Bu açık bir nedeni, şu anda potansiyel yeni bileşiklerinin etkinliği kanseri hücre çizgilerinin 2B hücre kültürlerinde ya da hayvan modellerinde geniş ölçekli taramalarında değerlendirilir gerçektir. Hayvan modelleri daha yüksek bir karmaşıklık var ama fareler ve erkekler 6,7 arasında önemli farklılıklar vardır. Son on yılda, farklı yaklaşımlar kullanarak 3D kanser modelleri 2D kanser hücre çizgilerinin kültürü ve in vivo tümör 6,8,9 bir kompleks arasındaki boşluğu doldurmak için oluşturulmuştur. Hücre farklılaşması üzerine ve aynı zamanda sinyalizasyon 3D çevrenin etkisi yıllar önce çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir (örneğin., Mina Bissell tarafından) 10,11. Bugün, birçok 3D hücre kültürü modelleri, sfero kültürlerin, hidrojeller veya mikroakışkan cips 12-16 olarak mevcuttur. Hatta thes rağmenE modelleri çoğunlukla, aynı zamanda, tümör-destekleyici etkileri ve etkiler ilacın etkinliği olduğu bilinen bir doku mikro-eksikliği geleneksel 2B kültür sistemlerine kıyasla karmaşıklığı artırır.

Bu sorunu gidermek için, biz bir decellularized domuz jejunum türetilmiştir SISmuc (küçük-bağırsak-submukoza + mukoza) olarak adlandırılan biyolojik iskele dayalı bir 3D tümör modeli oluşturulur. Böylece, doku mimarisi ve farklı kolajenler yanı sıra bazal membran yapısı olarak ECM önemli bileşenleri 17 korunur. Bu eşsiz özellik epitelyumdan ortaya çıkan ve katı tümörlerin yaklaşık% 80 ihtiva karsinom tümör modeli üretimi için çok önemlidir. Ayrıca, doku mühendisliği tümör modelinde proliferasyon hızı 2B kültür elde yapay yüksek oranlara göre azalır. çoğalma ilaç etkinliğini değerlendirmede önemli bir parametredir gibi uyuşturucu testi daha benzer bizim modelinde etkindirin vivo koşullar 17 tümörler.

Doğru olarak EGFR -biomarker statüsünde farklılık iki farklı akciğer kanseri hücre hatları için, biz burada mevcut verileri biyobelirtecin bağımlı ilaç etkinliğini tahmin etmek bizim modelin potansiyelini değerlendirmek için. Bu mutasyon durum KHDAK hastalarında rutin belirlenmeye başlamıştır. Bu tür platin bazlı kemoterapi 18-21 olanlara göre bir aktive EGFR mutasyon göstermek üstün sonuçlar taşıyan tümörlere karşı EGFR -inhibitor gefitinib olarak TKİ ile hedefe yönelik tedaviler.

Biz bileşik etkinliğini değerlendirmek için önemli olan birkaç okuma-out teknikleri kurdu. Ayrıca, TGF-beta-1 ile uyarıldıktan sonra habis dönüşüm 22,23 önemli bir adım olduğu düşünülmektedir ve ilaç dayanı bağlı olan EMT sürecini başlatan, tümör hücrelerinde bileşik işlemleri araştırabilirizce 24.

3D tümör modeli hedeflenen tedaviler, kemoterapi, ya da iyi tezat ilaç kombinasyonlarına hücreye özel yanıtları izlemek izin verir. Geliştirmek ve uyuşturucu taraması hızlandırmak ve direnç karşılaşma için, bu siliko simülasyon bir tamamlanmaktadır. Bir kaç deneylere dayanarak, tümör yanıtı ilaçlar ve bunların kombinasyonları bir dizi için sonuçlarına ilişkin siliko tahmin edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İki boyutlu (2D) Hücre Kültürü

  1. Ticari olarak, tümör hücre çizgisi HCC827 (DSMZ) elde. Kültür RPMI-1640 içinde akciğer adenokarsinomu hücre soyu HCC827 (mutasyona uğramış EGFR Kras vahşi tip)% 20 FCS ile takviye edilmiştir. 3 gün - her 2 orta değiştirin. Bir haftada iki kez hücreleri bölün. geçidi 20 ulaşana kadar hücreleri kullanılır.
  2. Ticari olarak tümör hücre dizisi A549 (DSMZ) edinin. Kültür akciğer karsinoma hücre soyu, A549 (EGFR vahşi tip Kras mutasyona uğramış), RPMI-1640 içinde% 10 FCS ile takviye edilmiştir. yukarıda belirtildiği gibi kültür gerçekleştirin. geçidi 20 ulaşana kadar hücreleri kullanılır.
  3. (- 6 hafta her 4) gibi mikoplazma kontaminasyon olarak kontaminasyon için düzenli hücreleri test edin.
  4. Cam lamelleri A549 veya HCC827 hücreleri Kültürleme
    1. Bir cımbız kullanarak 24 oyuklu plakanın her bir 1, steril cam lamel.
    2. Wells 500 ul bir hacimde her iki hücre hattına Tohum 50,000 tümör hücreleriCam lamelleri, sırasıyla.
    3. Kültür hücreleri, standart kültür koşulları altında% 70 konfluent ulaşana kadar (37 ° C,% 5 CO2). Bu süre zarfında, bir Pasteur pipeti kullanarak eski orta aspire ve her 2 500 ul taze orta ekleyin - kültür 3 gün.

Biyolojik Kollajen Scaffold Tümör Testi Sistemleri 2. Nesil

  1. Statik Kültür Koşulları
    1. Hücresizleştirilmiş ince bağırsak-alt mukozayı + mukozayı (SISmuc) oluşturmak ve önceki yayında 25'te tarif edildiği gibi, iki metal halkalar olarak adlandırılan hücre tepeleri arasındaki sabitleyin.
    2. Hücre kron sabit gut eski lümeninin yüzüne 500 ul toplam hacim içinde HCC827 ya A549 hücreleri, ya bir tohum 100,000 hücre.
    3. Tümör hücreleri, 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 2 saat boyunca yapışmaya izin verin. Hücre taç içinde 1 ml orta ekleyin ve dışarıda 1 ml.
    4. tümör Kültür37 ° C'de statik koşullar altında bir model, 14 gün boyunca kuluçka makinesi içinde% 5 CO2. 3 gün - her 2 kültür ortamı değiştirin. (:% 10, HCC827:% 20 A549) hücre taç içinde ve dışında aynı ortamın 1.5 ml Bu nedenle, bir Pasteur pipeti ile pipet FCS uygun miktarda, 1 ml taze RPMI kullanılarak orta aspire.
  2. Dinamik Kültür Koşulları
    1. 2.1.3 için alt bölüm 2.1.1 bölümünde açıklandığı gibi hücre kron ve hücre tohumlama içinde decellularized matriks ile tümör testi sistemi kurmak.
    2. Kültür, statik koşullar altında bir tümör modeli 37 ° C, 3 gün boyunca kuluçka makinesi içinde% 5 CO2.
    3. Otoklava biyoreaktör monte edin ve daha önce 25 olarak yayınlanan numaralı seribaşı SISmuc yerleştirin.
    4. Pipet FCS uygun miktarda 45 ml RPMI (A549:% 10, HCC827:% 20) flask içine ve biyoreaktör arasındaki boru sistemine iğnesiz örnekleme cihazı bağlamakOrta bir şişe.
    5. , Inkübatör biyoreaktör yerleştirin, 37 ° C,% 5 CO2 de sabit bir orta akış (3 mL / dakika) ile pompa ve kültüre ilave 14 gün boyunca, tümör modeli bağlayın.
    6. 7 gün sonra tüm kültür ortamı değiştirin. Bunun için, bir laminar akış başlığı altında inkübatörden biyoreaktör hareket ettirin. Pasteur pipeti kullanarak medya şişede orta aspire. boru sisteminde orta kurtulmak için aspire ederken biyoreaktör yukarı kaldırın. balona Pipet 45 ml taze ortam. geri kuvöz içine biyoreaktör yerleştirin ve pompa bağlayın.

Gefitinib ile statik Tümör Modelinin 3. Tedavi

  1. Kültür bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi tümör modeli.
  2. kültürün 11. günde, 1 uM gefitinib (her bir hücre taç 2.5 mi) ile RPMI / FCS hazırlar. Pasteur pipeti kullanarak kuyulardan eski orta aspire ve t içinde hazırlanan RPMI / FCS / gefitinib 1 ml ekleyino hücre taç ve dışında aynı ortamda 1.5 ml.
    Not: çözülmüş gefitinib stok çözeltisi bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
  3. alt bölüm 3.2 altında açıklanan günde 13 de orta değiştirin.

EMT İndükleme TGF-beta-1 ile statik Tümör Modeli 4. stimülasyonu

  1. Kültür bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi tümör modeli.
  2. Kültür 3. günde, 2 ng / ml TGF-beta-1 bir taşıyıcı ile (her bir hücre taç 2.5 mi) ile RPMI / FCS hazırlar. Pasteur pipeti kullanarak kuyulardan eski orta aspire ve 1 hazırlanmış RPMI / FCS / TGF-beta-1 hücre taç içinde ml ve dışında aynı ortamda 1.5 ml ekleyin. 4.2 altında tarif edildiği gibi, 14 gün kadar 3 gün - Orta TGF-beta-1, her 2 ile takviye edilmiş değiştirin.

5. Oku-çıkışları

  1. ELISA Ölçümleri Numune alınması
    1. Statik (bölüm 2.1) ve dinamik (bölüm 2.2) kültür süpernatantlar sırasında numune almayagün kültür 11-14 Şekil 2'de gösterildiği gibi en gefitinib (bölüm 3) ile tedavi. Ayrıca, tedavi (T0) öncesinde bir örnek almak.
    2. Statik kültür koşulları altında, hücre taç içinden 100 ul örnek almak. Dinamik kültür koşulları altında, örnekleme cihazı şırınga vida ve biyoreaktör sistemin dışına 1 ml orta almak. ELISA gerçekleştirilene kadar -80 ° C'de ve toplanan yüzey maddeleri saklayın.
  2. Apoptoz Niceleme için M30-ELISA
    1. Üst fazlar, üreticinin talimatlarına göre hücre ölümü tahlili gerçekleştirmek apoptozu ölçmek için. tüm reaktifler tahlil yapmadan önce RT ulaşmasına izin verin.
    2. Vortex tüm reaktifler. 500 ml yeni, iyonu giderilmiş su, yıkama tableti çözülür. Konjuge Seyreltme Tampon 9.2 ml HRP Eşlenik sulandırılır ve karıştırılır. Pipet standart veya numune başına kuyunun 25 ul.
    3. seyreltilmiş HRP konjugat 75 ul ekleyinoyuk başına kapısı çözeltisi. plaka Kapak ve oda sıcaklığında 4 saat süre ile bir çalkalama inkübe. plakayı yıkayın, el ile hazırlanan yıkama çözeltisi 250 ul 5 kez.
    4. Her bir oyuğa, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) substrat 3,3 '200 ul ekle. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. Her bir oyuğa durdurma çözeltisi 50 ul ekle. 10 saniye mikroplağı çalkalayın ve absorbansı okumadan önce 5 dakika boyunca mikroplağı bırakın. mikroplaka okuyucu içinde 450 nm'deki absorbans belirler. Standart eğri ve Menşe olarak ELISA tipi verilerini işlemek için uygun bir program kullanarak örneklerinde konsantrasyonları hesaplayın.
  3. örnek Boyama
    1. Tespit, Parafin gömme ve 3D Model Bölüm Hazırlanması
      1. 2 saat boyunca hücre taç başına 2.5 ml% 4 paraformaldehid (PFA) kullanılarak numaralı seribaşı SISmuc düzeltmek ve parafin içine gömmek
      2. Daha önce yayınlanan boyama 3 um doku bölümleri hazırlanması25.
    2. 2B kültür koşullarında yetiştirilen hücreler sabitlenmesi
      1. % 70 birleştiği ulaşıldığında, bir kez PBS ile 24 oyuklu plaka cam lameller üzerine kültürlenmiş hücreler yıkama ve 500 ul% 4 PFA / oyuk 10 dakika sabitleyin.
      2. PFA çıkarın ve boyama gerçekleştirilir kadar 4 ° C 'de PBS ile kaplı iyi plaka cam lameller saklayın.
    3. H & E Boyama
      1. standart protokollere göre bir genel boyama olarak da Hematoksilin / Eosin ile yeniden hidrate edilmiş kısımlar Leke.
    4. 3D Model immunofluorescent Boyama
      1. immünofloresan boyama, 20 dakika boyunca ısıtılmış sitrat tamponu (pH 6.0) ile buhar ocak içine deparafinize ve rehidre slaytlar yerleştirerek bir antijen alımı gerçekleştirmek.
        NOT: sitrat tamponu hazırlamak için Malzeme ve Ekipmanları en tablosuna bakın.
      2. slaytlar aktarınYıkama tamponu (0.5 M PBS tamponu +% 0.5 Tween) için, PAP kalemle daire bölümleri boyama çözümü için gerekli hacmi en aza indirmek için ve bir nem odasında slaytlar yerleştirin.
      3. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca alt bölüm Genel bakış 5.3.4.6 kullanılan ikincil antikor konak türlerinden% 5 serum ile doku bölümleri bloke.
      4. 100, tavşan anti vimentin 1: 100, fare anti-pan sitokeratin-1 üreticinin talimatlarına (Ki67 1 anti tavşan uygun bir seyreltme çevrelediği bölümlere birincil antikor yavaşça kağıt doku slaytlar dokunarak bloke serumu çıkarın ve geçerli : 100). 4 ° C'de O / N inkübe edin. çift ​​boyama için, farklı ev sahibi türünden birincil antikorlar kullanılmalıdır.
      5. Dikkatle 5 dakika boyunca yıkama tamponu ile üç kez, bağlanmamış antikor yıkayın.
      6. bölümlere 400 ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin: spesifik bir antijen-antikor bağlama belirlenmesi için, seyreltme 1 sekonder antikor uygulayın.
      7. unb yıkayınYıkama tamponu ile ikamesi, antikor, 5 dakika için üç kez.
      8. çekirdekleri counterstain ve kuru O / N onlara izin DAPI içeren sulu ortam ile slaytlar monte edin.
    5. 2B Kültür Hücrelerinin immunofluorescent Boyama
      1. PBS çıkarın ve geçirgenliği 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 Triton-X100 ile tohumlanır cam kapak slipi üzerinde kapsamaktadır. 5 dakika boyunca yıkama tamponu (0.5 M PBS tamponu +% 0.5 Tween) ile cam kapak slipi üzerinde yıkanır.
      2. 5.3.4.7 adımları 5.3.4.3 yapınız. sallanan bir platform üzerinde iyi plaka tüm adımları çalıştırır ve plakayı baş aşağı çevirerek reaktifler uzaklaştırılır.
      3. Montaj için, kaplanmamış bir cam slayt üzerine çekirdekleri counterstain ve forseps kullanılarak montaj orta bakan hücreleri ile buna kapak kayma aktarmak için DAPI içeren sulu bir ortam içinde bir damla nokta. görüntüleme önce kurumaya bırakın.
  4. Çoğalma Endeksi Belirlenmesi
    1. immunofluorescent gerçekleştirin5.3.4 uygun Ki67 karşı boyama. veya 5.3 5.
    2. bir inverted mikroskop ile doku bölümleri veya 2D kültürlenmiş hücrelerin flüoresan görüntülerini almak. DAPI boyamalar ve Ki67 boyamalar görüntülerini çekmek için farklı filtreleri kullanın. ölçümü için, numunenin çakışmayan parçaları ile her bir durum 3D bölümden 10 görüntü ya da 2 boyutlu kültürleri (20x büyütme) 5 görüntülerin kullanımı.
    3. 2B Ki67 için çekirdek sayısını ve pozitif çekirdeklerin sayısını belirler
      1. Ki67 el Yazılımın Fiji 26 eklenti hücre sayacını kullanarak olumlu çekirdekleri sayın. Bu nedenle, görüntüyü açmak ve "Eklentiler" → "Analiz" → "Hücre Sayaç" tıklayın. Basın "Başlatma" ve karşı türünü seçin. Her Ki67 pozitif çekirdeğin üzerine tıklayın. tıklama sayısı, seçilen sayaç tipi yanında gösterilir.
      2. Çekirdeklerin toplam sayısının otomatik hücre sayımı Fiji 27,28 kullanarak bir makro oluşturun. adjust her boyama ve hücre hattı için makro. Ardından, bir makro oluşturmak için nasıl bir örnek görmek.
        1. Makro kaydedici başlatın. DAPI-görüntü açın ve "Görüntü" → "Tip" → "8-bit" tıklayarak 8 bit biçimine dönüştürmek. Set "normalleştirmek", "1" olarak "doymuş" ve "kontrast geliştirin" tıklayın.
        2. Görüntüyü netleştirmek için "keskin olmayan maske" olarak ayarlayın. "0.60" nin "1" ve "maske" bir 'yarıçapı' kullanın. Görüntüyü binarise için 'siyah zemin üzerine beyaz nesneler' ile yöntem "RenyiEntropy" seçin, "auto eşiği" tıklayın.
        3. Hücreleri ayırmak için "5" bir erozyon yarıçapı ile "Eklentiler" → "BioVoxxel" → "havza düzensiz özellikler" i tıklayın. → "Analiz" seçeneğini tıklayın "Parçacıklar Analiz" ve "0.02-Infinity" için "beden" olarak ayarlayın.
          NOT: partiküller / hücre sayısısayıları olarak özet tabloda gösterilmiştir.
        4. Daha fazla görüntü analizi için makro kaydetmek için "Create" düğmesine tıklayın.
    4. fıkrasında 5.4.3.1 açıklandığı gibi manuel olarak 3D çekirdeklerin sayısını ve Ki67 pozitif çekirdeklerin sayısını belirler.
    5. aşağıdaki formüle göre ortalama proliferasyon endeksi (PI) hesaplayın:
      figure-protocol-1
      n = görüntü sayısı (3D: 10, 2D: 5)

HCC827 Hücreleri Anti-EGFR Tedavisinin Silico Tümör Modeli Üretimi ve Simülasyon 6.

  1. Ağ Nesil Şebeke Analizi Yazılımı kullanarak
    1. Önemli deneysel okuma-out parametreleri ve HCC827 hücre hattının mutasyon birikimine göre tümör ağı oluşturmak için bilinen farklı veritabanları kullanın.
    2. Görselleştirmek için ağ analizi yazılımı 21 açınağ.
      1. "Dosya" → "Yeni" → tipi 'JoVE_tumor modellerini tıklayın → Yeni bir ağ oluşturmak için "Tamam" a tıklayın. Bir çift zarında reseptörü görselleştirmek için "Tamam" "Kare Closeup North" → tıklayın. dikdörtgenler → tipi 'EGFR' → "Tamam" a tıklayın olarak düğümleri (= proteinler) görselleştirmek için "Genel Protein" üzerine tıklayın; ağdaki her düğüm için bu tekrarlayın.
      2. ağdaki düğümler Etiket: Sağ tıklayın → "Renk Değişimi ve Şekil ..." → düğümleri EGFR ve (EGF-EGFR) renk kodu "255,0,0" (kırmızı renk) için seçin; düğümleri, c-MET ve (c-MET) renk kodu "0,255,0" (yeşil renk) için; Gefitinib renk kodu için "255,255,0" (rengi sarı); PI3K-Inh renk kodu için "204204204" (renk açık gri); MEK-Inh renk kodu için "102102102" (renk koyu gri); ağ seçme renk kodu diğer tüm düğümler için4; 255255255 "(beyaz renk).
      3. altıgenler → tipi 'çoğalması' olarak okuma-out parametreleri görselleştirmek "fenotipe" tıklayın → "Tamam" a tıklayın → Sağ → "Değişim Renk & Şekli ..." Seçenek → renk kodu "255204204" (renk somon) tıklayın; select renk kodu "255,51,204" (renk mor) → Parametre apoptosis için bu tekrarlayın.
      4. engellemeler için (körelmiş oklar) "önlenmesinin" tıklayın, aktivasyon (oklar) için "Devlet Geçiş" tıklayın;: Kenarları (= etkileşimler) görselleştirmek ağdaki her etkileşim için bu tekrarlayın.
    3. "Dosya" → "Farklı Kaydet ..." → türü 'JoVE_tumor models.xml tıklayın → .xml biçiminde ortaya çıkan sinyal ağı kaydetmek için "Kaydet" düğmesine tıklayın.
  2. Silico Simülasyon SQUAD kullanarak
    NOT: KADRO inci temsile ağı ayrı bir mantıksal Boole sistemi (AND, OR, NOT) olarak topoloji ve kararlı durum analizi yapar. Kararlı durum analiz sistemi denge ve sinyalizasyon uyaranlara üzerine sorumluluk (örn., Ilaç uygulaması veya mutasyon) yansıtır.
    1. Açık KADRO 17 yazılım, yükleme → "Load Ağı" 'JoVE_tumor models.xml' dosyasını tıklayın. "Run analizi" ni tıklayın:
      NOT: Sonraki, KADRO zamanla ağ davranış dinamik simülasyonu (renkli sigmoid aktivite eğrileri) izin verir Boolean ağ bağlantısı, katmak için üstel fonksiyonu uygular.
    2. Bir simülasyon protokolü yazmak için "Gelişmiş" → "Perturbator" tıklayın. Anti EGFR direnci benzetin: Click "Düzenle Protokolü"
      1. "Pertürbasyon" → standart kullanımı "initialstate = SS-4" (kararlı hal 4) → "Yeni Sabit Pulse 'eklemek için" Add "düğmesine tıklayın → Se tıklayınlect parametresi "devlet" Select zaman → → Hedef seç "FLIP" "0" → Seç değer "0.4" → "Tamam" ı tıklayın.
      2. Bu tekrarlayın: → Seç parametre "devlet" → Hedef seç "c-MET" → Seç zaman "0" → Seç değer "0.4" → "Tamam" Click "Ekle" yi tıklayın; Click Seç zaman → → Seç parametresi "devlet" → Hedef seç "Gefitinib" "Ekle" "0" → Seç değer "1" → "Tamam" ı tıklayın.
      3. aktif düğüm (EGF-EGFR) bir devlet değerini ayarlayın: "activenode" tıklayın → "Düzenle" → Seç devlet "0,8" → "Tamam" Tıklayın; Diğer tüm düğümler için: "Düzenle" yi tıklayın → durumu "0" → "Tamam" ı tıklayın seçin. protokolü kaydetmek için "OK" tıklayın.
      4. Belirli eğrileri görüntülemek: paneline gidin "Seçenekler" → "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "kaspaz", "(c-MET)", "PI3K" "(EGF-EGFR)" seçin, "gefitinib", "apoptoz", "çoğalma", "MEK-Inh" ve grafiksel gösterimi için "PI3K-Inh". Sistemin tepki tam bir simülasyonu başlatmak için "Başlat" → "Çalıştır" a tıklayın. "Reset" seçeneğini tıklayın, yeni bir simülasyon başlatmak için.
    3. Kombine PI3K ve MEK inhibitörü tedavisi benzetin: Click "Düzenle Protokolü"
      1. 6.2.2.3 - 6.2.2.1 altında tarif edildiği gibi aynı düğüm parametresini kullanın. → "Add" tıklayın "yeni Sabit Pulse '→ Seç parametresi" devlet "→ Hedef seç" PI3K-Inh "→ Seç zaman" 0 "→ Seç değer" 1 "→" Tamam "ı tıklayın eklemek için" pertürbasyon "üzerine tıklayın; Click "Ekle"Seç zaman → 'yeni Sabit Pulse' → Seç parametresi "devlet" → Hedef seç "MEK-Inh" eklemek için "0" → Seç değer "1" → "Tamam" ı tıklayın.
      2. protokolü kaydetmek için "OK" tıklayın. "Seçenekler" paneline gidin: 6.2.2.4 altında tarif edildiği gibi grafiksel gösterimi için aynı düğümleri kullanın. Sistemin tepki tam bir simülasyonu başlatmak için "Başlat" → "Çalıştır" a tıklayın. simülasyon bitirmek için "Reset" düğmesine tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

SISmuc iskele (C Şekil 2A) temelinde, bir 3D tümörü test sistemi (Şekil 2D) üretilmesi, stimülasyon ve tedavisi için bir standart operasyon protokolü kurulmuştur. Bu model, proliferasyon indisi ve sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 3'te gösterildiği gibi M30-ELISA kullanılarak apoptoz miktarının belirlenmesini mümkün kılar. 3 gösterir A549 ve HCC827 modelleri Örnek H & E boyama ve gefitinib sadece bir te...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir in vitro kombine kurduk / Biyomarker güdümlü tedavi tahminleri için siliko tümör testi sisteminde. In vitro model gibi aynı zamanda siliko 17 simüle edilebilir belirli bir mutasyon arka planda tümör hücre çoğalması ve apoptoz değişiklikler gibi bileşik eylemlerin farklı önemli yönlerini değerlendirir. Burada, 3D tümör modeli üretimi ve çoğalması ve apoptoz ölçümü ve siliko modelinde bir habercisiydi kurulması da dahil olmak üzere bileşik test ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu araştırma Wuerzburg Üniversitesi Hastanesi Disiplinlerarası Klinik Araştırma (IZKF, hibe BD247) Merkezi ve (Heike Walles verilen) Bayern Fit programı sponsor oldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BiyoreaktörlerDoku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Kürsüsü, Wü rzburg (GER)Biyoreaktör kurulumu
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Hücre kronlarıDoku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Başkanı, Wü rzburg (GER)statik 3D kültür için
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-Bu yazılım ağı çizmek için kullanıldı.
Sitrat tampon stok çözeltisi (10x)ev üretiminde42 g/L Sitrik asit monohidrat, 17,6 g/L Deiyonize suda sodyum hidroksit peletleri, pH 6.0, RT'de depolanır.
Ev üretimindesitrat tampon çalışma çözeltisiDemineralize suda% 10 Sitrat tampon stok çözeltisi, RT'de depolanır.
Sitrik asit monohidratVWR, Darmstadt (GER)1002441000sitrat tamponu için kullanılır
Kapak fişleriVWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (ABD)SBA-0100-20
KEGG, HPRD ve QIAGEN gibi veritabanları (Genler & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-Ağtopolojisini oluşturmak için bilinen farklı literatür veri tabanları kullanılmıştır.
Kadın Luer Lug Tarzı TeeMednet, Mü nster (GER)FTLT-1Biyoreaktör kurulumu
5/16 "Hex ila 1/4-28 UNF İplikMednet, Mü ile Dişi Luer İplik Stili; nster (GER)SFTLL-J1A Biyoreaktör kurulumu
Fetal Buzağı SerumuBio& SATIŞ, Feucht (GER)FCS. ADD.0500ısıyla etkisiz hale getirilmemiş
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER)S1025-100 mg100 mM stok çözeltisi
DMSO ile glas şişesi (Schott, GER) cam hortum bağlantısı ile sağlanırWeckert, Kitzingen (GER)özel yapım
Histofix %4 (Paraformaldehid)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
Hortum bağlantısıMednet, Mü nster (GER)CC-9Biyoreaktör kurulumu
Biyoreaktörler için İnkübatörDoku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Başkanı, Wü rzburg (GER)Biyoreaktör kurulumu
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Erkek Luer Entegre Kilit HalkasıMednet, Mü nster (GER)MTLL230-J1ABiyoreaktör kurulumu
Nem odasıözel yapım
Fare anti Pan-SitokeratinSigma-Aldrich, Münih (GER)   C2562-2MLKlon C-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3 + M20 + A53-B / A2, immünofloresan için 1/100 kullanılır
İğnesiz Swabable Vana Dişi LuerMednet, Mü nster (GER)NVFMLLPCBiyoreaktör kurulumu, numune alma için, gama ile sterilize edilmiş
O-Ring MVQ 10 kırmızı 37 x 3 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444O-ring büyük, Biyoreaktör kurulumu
O-Ring MVQ 70 kırmızı 27 x 2,5 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170O-ring küçük, Biyoreaktör kurulumu
PAP kalemiDako, Hamburg (GER)S002
ParafinCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
Peristaltik pompaIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)Biyoreaktör kurulumu
Fosfat Tamponlu TuzluSu Sigma-Aldrich, Münih (GER)   D8537-6x500ml
Pompa boru kasetiIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Biyoreaktör kurulumu
Tavşan anti Ki67Abcam, Cambridge (İngiltere)ab16667Klon SP6, IF Rabbit anti Vimentin Abcam için 1/100 için kullanılır
, Cambridge (İngiltere)ab92547için 1/100 kullanılır
Yaşam teknolojileri, Darmstadt (GER)61870-04437 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Silikon tüpCarl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)HC66.1Biyoreaktör kurulumu
Sodyum HidroksitSigma-Aldrich, Mü Sitrat tamponu için kullanılan30620-1KG-R
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Buyazılım, yarı kantitatif simülasyonları gerçekleştirmek için kullanıldı.
Steril hava filtresi, gözenek boyutu 0.2 & mSartorius Stedium Biyoteknoloji, Gö ttlingen (GER)16596-HYKBiyoreaktör kurulumu
Şırınga Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649biyoreaktör örneklemesi için
Doku kültürü test plakaları: 6-,          12, 24, 96 kuyuluTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048 
Transforme edici büyüme faktörü-beta 1 (TGF-β 1) taşıyıcıHücre Sinyalizasyonu ile, Frankfurt (GER)8915LCsteril sitrat tamponunda stok çözeltisi pH 3.0
Triton X-100Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)X100-1L
Ara-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500mlimmünofloresan boyama tamponunu yıkamak için
, IF RPMI-1640 ortamı nchen (GER)

Kaynaklar

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B Akci er T m r Modelila Yan t ng r sEGFR Mutasyonlu H crelerGefitinib TedavisiKi67 Proliferasyon ndeksiM30 ELISA ApoptozuEpitel Mezen imal Ge iAk Biyoreakt r K lt rBoole In Silico Modeli
Kombine bir 3D doku mühendisliği
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.