Yöntem makalesi

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma

6.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53890

⸱

11 Ağustos 2016

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, Biointerfaces Institute, University of Michigan

Bu makalede

Özet

Gen ekspresyonlarını ve kollajenolitik aktivitelerini değerlendirmek için stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fare inguinal (subkütan) ve perigonadal (viseral) yağ dokusu depolarından izole etmek için gerekli teknikleri sunuyoruz. Bu yöntem, immünomanyetik hücre ayrımı kullanılarak Sca1yüksek yağ kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) zenginleştirilmesini içerir.

Özet

Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) izolasyonu, adipoz doku biyolojisi, adipogenez ve hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesi alanında önemli bir yöntemdir. İn vivo, fibriller kollajenlerden oluşan ECM'den zengin ortam, obezitenin ilerlemesi ve gerilemesi sırasında yağ dokularına yapısal bir destek sağlar. Matriks metalloproteinazların (MMP'ler) aracılık ettiği fizyolojik ECM yeniden şekillenmesi, yağ dokusu boyutunun ve fonksiyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynar1,2. Fizyolojik kollajenolitik ECM yeniden şekillenmesinin kaybı, aşırı kollajen birikimine (doku fibrozu), makrofaj infiltrasyonuna ve nihayetinde insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik homeostaz kaybına yol açabilir3,4. Gen hedefli fare modellerinde yağ dokusunda fenotipik bir değişiklik gözlendiğinde, in vitro çalışmalar için primer ASC'lerin yağ depolarından izole edilmesi, ASC'lerin işlevini düzenlemede spesifik genin rolünü tanımlamak için etkili bir yaklaşımdır. Aşağıda, Sca1yüksek ASC'lerin immünomanyetik bir ayrımını tanımlıyoruz.

Giriş

Hücre antijeni 1 (SCA1 veya LY6A / e) kök ilk hematopoietik ve mezenkimal kök hücreleri 5,6 ile ifade edilen bir hücre yüzey markerı olarak tespit edilmiştir. Fare yağ depolarından elde edilen yağ dokusu stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fibroblastlar, makrofajlar, vasküler endotelyal hücreler, nöronal hücrelerin ve adiposit progenitör hücrelerin 7 hücrelerinden oluşan heterojen bir popülasyonu. Adiposit progenitör hücreleri veya adipoz kaynaklı kök hücreler (TSK) kollajen zengin perivasküler hücre dışı matriks (ECM) 8 ikamet dışı lipid yüklü hücrelerdir. CD34 +: SCA1 + 9 ve CD29 + - yaklaşık SVF% 50 soy-negatif (Lin) olarak karakterize edilmiştir TSK oluşmaktadır. In vitro adiposit farklılaşması edebilen adiposit ataları, - CD24: bu hücrelerin çoğu Sca1 + 'dır Bununla birlikte, hücrelerin sadece küçük bir kısmı (SVF 0.08%) SCA1 teşkil +: çoğalan ve in vivo koşullarda 9 adipositlere farklılaşma tamamen yetenekli CD24 + hücreler. CD24 gelen CD24 + hücreler demeden Sca1 + SVF kullanarak potansiyel ihtar rağmen - immunomagnetic hücre ayırma kullanarak yağ depolarından SCA1 + TSK, hücreler izole birincil adiposit progenitör hücrelerin hücre özerk fenotip belirlemek için etkili ve pratik bir yaklaşımdır.

Obezite ve diyabet, doku fibrozu ve enflamasyon alanına tip-2 diyabet 3 gelişimi ve korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Son zamanlarda, Tokunaga ve ark. (VIS veya visseral) inguinal (ya da deri altı, SQ) ve perigonadal izole Sca1 yüksek hücreler C57BL6 / J yağ depoları vitro 10 farklı gen imzalar ve ECM biçimlenme sergilerler gösterdi. MMP14 (MT1-MMP), membran-t prototip üyesiYPE matriks metalloproteinaz (MMP) ailesi kolajenolitik aktiviteye 1 ile beyaz adipoz dokuda (WAT) gelişimini aracılık eder.

Aşağıdaki protokol ile izole edilmiş ve zenginleştirilmiş hücreleri ile gerçekleştirilebilir deney örnekleri arasında, üç boyutlu bir kültür, farklılaşma çalışmaları, kolajen alçalmasının tahlilleri ve RNA sıralaması 10,11 bulunmaktadır. Parçalanma deneyleri telopeptit 11,12 korunmasını sağlamak için asit ekstre kollajen ile yapılmalıdır. Aşağıdaki protokol farklı yağ depolarından birincil vasküler stroma hücreleri izole ve immunomagnetic hücre ayırma yöntemi adiposit progenitör hücreler zenginleştirmek için yöntemler gösterecektir. Hücre sıralama geçerliliği akım sitometri ile ve bir Sca1 promotör 13 tarafından tahrik SCA1 + hücrelerde GFP ifade Sca1-GFP fareler kullanılarak yoluyla değerlendirilecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) (Laboratuar Hayvan Araştırma Enstitüsü, Ulusal Araştırma Konseyi) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca tüm yöntemleri ve protokolleri onayladı. Fareler bir Michigan Üniversitesi vivari tutulur ve gıda ve suya ücretsiz erişim verildi ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü üzerinde tutulur.

1. hazırlıklar

  1. DMEM,% 10 FBS, 1x P / S / G, ve 1x antibiyotikler / antifungal ile primer kültür ortamı hazırlayın. Bu daha önce sindirime dokuları tutmak için kullanılır. 37 ºC su banyosunda stok ve kısım yerleştirin.
  2. 5 mg / ml (+ Ca, Mg), yağ yastığı her bir tipi için beş fare kadar yalıtıldıktan HBSS içinde çözülmüş tip III kolajenaz çözeltisi, beş mililitre hazırlayın. Tek bir genotipten SQ ve VIS izole edilirken, vahşi tip ve mutant kare olduğu ve VIS, 20 ml yapmak, örneğin, 10 ml yapmak. 7.4 Ste pH ayarlamaFiltreyi rile. 50 ml tüpler içine kısım. kenara ışıktan uzakta ayarlayın.
  3. Cerrahi alan dezenfekte% 70 etanol kullanın. aşağı silin ve mavi ped ile kaplayın. Mavi pad üzerinde bazı etanol püskürtün.
  4. strafor kurulu bir emici ped aşağı pin ve makasla kesme 22 G iğne kullanın. sonra mavi pad üzerinde kurulu ayarlayabilir ve diseksiyon başlamadan kadar başka bir mavi ped ile kaplayın etanol ile pedi püskürtün.
  5. cerrahi alan bitişik bir stand etanol ve yer ile iki 50 ml tüpler doldurun. Etanol makas ve forseps yerleştirin.
  6. cerrahi aletleri etanol kapalı durulama için PBS artı 1x anti-anti başka 50 ml tüp doldurun.
  7. kaputu, her bir doku tipi etiket 60 mm yemekleri ve 37 ºC ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Cerrahi alana bitişik tabak yerleştirin.

Subkütan (SQ) Yağ Pads 2. izolasyonu

  1. izofluran ve pnömotoraks aşırı dozda fare Euthanize.
  2. Nazikçe% 70 etanol ile fare sprey ve sırtüstü yatıyordu. 22 G iğne ile köpük kuruluna pençeleri sabitleyin.
  3. Alt karın derisinde küçük bir kesim yapın. forseps ile kesilen üst Holding, makas almak ve periton cilt ayırmak.
  4. Cilt karından göğüse periton ayrılır sonra, vücudun yan tarafında deride yan keser yaparak uzak kafasına doğru periton cilt yansıtır.
  5. vücuttan uzak kasık yağ tutma kalan cilt yansıtır ve 22 G iğne ile kuruluna aşağı pin.
  6. ince makas ve forseps geçin. periton yakın kökeni forseps ile kasık yağ yastığı tut ve deri ile SQ kirletici kaçınarak kasık doğru ilerleyen deri ve kasık yağ arasında uzak snip.
  7. etiketli 60 mm çanak güneşe maruz kasık yağ yastığı yerleştirin.

Visseral (VIS) Yağ Pads 3. İzolasyon

  1. Benzer bir şekilde, 2.5 adım yağ yastıkları ve bağırsak visseral maruz açık periton kesmek için.
  2. uzakta toraks doğru gut hareket ettirin.
  3. uzak ucunda VIS yağ yastığı tut ve yavaşça yukarı doğru çekin. doku (dişi fareler kullanıyorsanız, ya da rahim) epididimal dışlamak için dikkat ederek VIS yağ yastığı parçalara ayır.
  4. etiketli çanak ve kalan VIS pad adımı yineleyin 3.3 yerleştirin.

Yağ Pads 4. kollajenaz sindirimi

  1. doku kültürü kaputu 60 mm yemekleri taşımak ve medya aspire.
  2. kavisli makas sonra kollajenaz çözüm eklemek ile yağ yastıkları kıyma. etanol ve PBS ile doku tipleri arasındaki makas ve forseps durulama emin olun.
  3. dokular dijeste kadar 300 rpm'de 10-20 dakika boyunca 37 ° C'de çalkalanır. SQ bazı parçaları hala görünür eğer kabul edilebilir. Bu bir sonraki adımda ele alınacaktır.
  4. collag durdurmak için kollajenaz çözeltisine kültür ortamı 25 ml ilave edilir10 ml'lik serolojik pipet ile enase tedavi ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez sindirilmiş dokuları dağıtmak için.
  5. 100 mikron hücre süzgeç kullanarak Gerilme hücreleri. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj.
  6. Dikkatle pelet rahatsız ve yavaşça hücrelerin askıya pipet pelet steril su 5 ml ekleyin ve için medyayı kapalı süzün. eritrositleri lizise uğratmak üzere 2 dakika bekleyin.
  7. yeni bir 100 mikron hücre süzgecinden% 10 FBS ve şekil hücreleri ile ortam 25 ml ilave edilir.
  8. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj. Durusu medya ve kültür ortamı 1 ml tekrar süspansiyon pelet.
  9. 1 tripan mavi: 1 kullanarak bir hemasitometre ile hücre sayımı.
  10. 6 oyuklu bir plaka üzerinde, bir oyuk Levha 1 x 10 6 hücre.

5. Manyetik Hücre Ayırma

  1. Hücre yapışması, yaklaşık 4 ila 6 saat sonra, HBSS (-Ca, -mg) ile iki kez hücreleri yıkayın. % 0.05 tripsin kullanılarak yapışkan hücreleri ayırmak. 1 ml ayırma tamponu ve spin tripsin hücre süspansiyonu seyreltilir300 x g 5 dak.
  2. Süpernatant aspire. 500 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  3. 300 x g, 5 dakika boyunca Spin hücreleri.
  4. Aspire tamamen süpernatanlarına. 90 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul anti-Sca1-FITC ile primer antikor ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
  5. mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın. tamamen süpernatantı.
  6. 80 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
  7. mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın.
  8. 500 ul tampon süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
  9. Manyetik tutucu sütun yerleştirin ve 500 ul tamponu ile sütun yıkayın.
  10. kolonuna hücre süspansiyonu ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının.
  11. Etiketsiz SCA1 toplayın - </ Sup> hücreler ve 500 ul tampon ile kolon 3 kere yıkayın. rezervuar boşken sadece yeni tampon ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının.
  12. manyetik tutucu sütunu çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin.
  13. Kolon rezervuar üzerinden sağlanan pistonu iterek Sca1 + kolona tampon ve Zehir ml 1 ekleyin.
  14. 300 x g'de 5 dakika boyunca hücre kesirler aşağı doğru döndürün. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse hücreleri.
  15. etiketli ve etiketsiz kesirler 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  16. 6 plaka 1 kuyuda her bir hücre fraksiyonu Plate.

Akım Sitometrisi ile Sca1 yüksek ACSS ve İmmunomanyetik Ayrılık 6. Doğrulama

  1. HBSS (-Ca, -MG) ile iki kez hücreleri durulayın ve% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri ayırmak.
  2. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse edin hücreleri ve hemasitometre kullanarak saymak.
  3. Elde> 10 6 1 ml kültür ortamı içinde hücre ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
  4. süpernatant ve tekrar adım 6.3 iki kez daha çıkarın.
  5. % 2 keçi serumu, 1 ml +% 2 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir blok ile yeniden süspanse hücreleri.
  6. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri.
  7. çözümü engelleme çıkarın.
  8. 4 ° C'de% 2 keçi serumu ve% 2 BSA + PBS ile 100 ul PBS içinde: ya da anti-SCA1 Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1): sıçan IgG2a Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1) ekleme karanlıkta 30 dakika karıştırıldı.
  9. hücreler soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje 300 x g.
  10. süpernatant ve tekrar adım 6.9 iki kez daha çıkarın.
  11. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse hücreleri. akım sitometri analizi için hazırlık 100 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonları iletin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Farklı Yağ Pads gelen Sca1 yüksek TSK zenginleştirilmesi.

SQ yağ görüntüleme fibroblast benzeri izole vasküler stromal hücreler SCA1 sentezleme seviyesi (Şekil 1A) bağımsız hücre şekli uzanıyordu. VIS Öte yandan, (eWAT türevi), yüksek Sca1 ve Sca1 düşük hücreleri, hücre şekli belirgin farkı göstermektedir. VIS SQ (IWAT türevi) Sca1 yüksek hücreler gibi VIS Sca1 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda izolasyon ve farklı yağ pedleri gelen fare TSK immunomagnetic hücre ayırma ve in vitro deneyler için onların kullanımını göstermektedir. Sunulan yöntem TSK 9,14 arasında, teknik olarak karmaşık ve pahalı FACS aracılı izolasyon avantajlıdır Sca1 pozitif TSK sayıda hızlı izolasyonu için etkilidir. FACS aksine immünomanyetik hücre ayırma, bir hedef hücre popülasyonunun belirlenmesine ilişkin birden fazla antijenin kullanılmasına izin vermez. Yüzey antijeni iyi karakterize eğer Bununla birlikte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu eser (THC) NIH DK095137 tarafından desteklenmektedir. Biz anlatılan yöntemlerin geliştirilmesine ve gelişmişliği katkıda mevcut ve eski laboratuar üyelerine teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tip 3 KollajenazWorthington BiyokimyasalLS004182Doku sindirimi
DMEMGibco11965-092Yüksek glikoz kültür ortamı
Kalem / Strep / Glutamin (100x)Gibco10378-016Medya antibiyotik
Anti-anti (100x)Gibco15240-062Medya mantar önleyici
FBSGibco16000-044
PBS (1x, pH 7.4)Gibco10010-023
Tripsin (%0,05)Gibco25300-054
Hücre süzgeciBD Bioscience352360100-μ m hücreli süzgeç
60 mm plakalarBD Falcon353004
MakasFST14001-12Büyük
MakasFST14091-11İnce, kavisli uç
Büyük ForsepsFST11000-12
İnce ForsepsHerhangi bir satıcı
25G 5/8" iğnelerBD305122
22G 1.5" iğnelerBD305159
15 ml konik tüplerBD Falcon352097
50 ml konik tüplerBD Falcon352098
MACS ayırma kolonlarıMiltenyi Biotec130-042-201
Anti-Sca1 mikroboncuk kiti (FITC)Miltenyi Biotec130-092-529FITC-anti-Sca1 1º Ab ve anti-FITC mikro boncuklar 2 º Ab
AutoMACS çalışan tamponMiltenyi Biotec130-091-221
MiniMACS ayırıcıMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Mavi chux pedleriFisher276-12424
Emici pedlerFisher19-165-621
Strafor levha50 ml'lik tüplerden kullanım
%70 etanol
İzofluranHerhangi bir satıcı
Sıçan IgG2a Alexa Fluor 647InvitrogenR2a21
Sıçan IgG2a anti-fare Sca1 Alexa Fluor 647InvitrogenMSCA21
Sıçan IgG2a R-PEInvitrogenR2a04
Sıçan IgG2a anti-fare F4 / 80 R-PEInvitrogenMF48004
Yuvarlak tabanlı tüpBD Falcon352058
HBSS (– Ca, – Mg)Gibco14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)Gibco14025-092Kollajenaz çözeltisi için
Tip I kollajen (37 mm asetik asit içinde 2,7 mg / mlEvde hazırlayın12
10x MEMGibco11430-030
1 M HEPESGibco15630-080
0.34 N NaOHEvdehazırlayın
Kapak fişleriCorning2870-22
Alexa Fluor 594 karboksilik asit, süksinimidil ester, karışık izomerlerInvitrogenA-20004
0.89 M NaHCO3  Gibco25080-094

Kaynaklar

  1. Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
  2. Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
  3. Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
  4. Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
  5. Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  6. Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
  7. Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
  8. Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
  9. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  10. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
  11. Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
  12. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  13. Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
  14. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
  15. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
  16. Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
  17. Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sca1 Pozitif H crelerYa Deposu zolasyonuKollajenaz ile Doku SindirimiAk Sitometrisi AnaliziAnti Sca1 AntikoruManyetik Boncuk ile Ay klamaSubk tan Ya PedleriViseral Ya Pedleri

İlgili makaleler