Yöntem makalesi

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma yüksek Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

DOI:

10.3791/53890

⸱

11 Ağustos 2016

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, Biointerfaces Institute, University of Michigan

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen ekspresyonlarını ve kollajenolitik aktivitelerini değerlendirmek için stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fare inguinal (subkütan) ve perigonadal (viseral) yağ dokusu depolarından izole etmek için gerekli teknikleri sunuyoruz. Bu yöntem, immünomanyetik hücre ayrımı kullanılarak Sca1yüksek yağ kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) zenginleştirilmesini içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) izolasyonu, adipoz doku biyolojisi, adipogenez ve hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesi alanında önemli bir yöntemdir. İn vivo, fibriller kollajenlerden oluşan ECM'den zengin ortam, obezitenin ilerlemesi ve gerilemesi sırasında yağ dokularına yapısal bir destek sağlar. Matriks metalloproteinazların (MMP'ler) aracılık ettiği fizyolojik ECM yeniden şekillenmesi, yağ dokusu boyutunun ve fonksiyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynar1,2. Fizyolojik kollajenolitik ECM yeniden şekillenmesinin kaybı, aşırı kollajen birikimine (doku fibrozu), makrofaj infiltrasyonuna ve nihayetinde insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik homeostaz kaybına yol açabilir3,4. Gen hedefli fare modellerinde yağ dokusunda fenotipik bir değişiklik gözlendiğinde, in vitro çalışmalar için primer ASC'lerin yağ depolarından izole edilmesi, ASC'lerin işlevini düzenlemede spesifik genin rolünü tanımlamak için etkili bir yaklaşımdır. Aşağıda, Sca1yüksek ASC'lerin immünomanyetik bir ayrımını tanımlıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre antijeni 1 (SCA1 veya LY6A / e) kök ilk hematopoietik ve mezenkimal kök hücreleri 5,6 ile ifade edilen bir hücre yüzey markerı olarak tespit edilmiştir. Fare yağ depolarından elde edilen yağ dokusu stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fibroblastlar, makrofajlar, vasküler endotelyal hücreler, nöronal hücrelerin ve adiposit progenitör hücrelerin 7 hücrelerinden oluşan heterojen bir popülasyonu. Adiposit progenitör hücreleri veya adipoz kaynaklı kök hücreler (TSK) kollajen zengin perivasküler hücre dışı matriks (ECM) 8 ikamet dışı lipid yüklü hücrelerdir. CD34 +: SCA1 + 9 ve CD29 + -

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) (Laboratuar Hayvan Araştırma Enstitüsü, Ulusal Araştırma Konseyi) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca tüm yöntemleri ve protokolleri onayladı. Fareler bir Michigan Üniversitesi vivari tutulur ve gıda ve suya ücretsiz erişim verildi ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü üzerinde tutulur.

1. hazırlıklar

  1. DMEM,% 10 FBS, 1x P / S / G, ve 1x antibiyotikler / antifungal ile primer kültür ortamı hazırlayın. Bu daha önce sindirime dokuları tutmak için kullanılır. 37 ºC su banyosunda stok ve kısım yerleştirin.
  2. 5 mg / ml (....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklı Yağ Pads gelen Sca1 yüksek TSK zenginleştirilmesi.

SQ yağ görüntüleme fibroblast benzeri izole vasküler stromal hücreler SCA1 sentezleme seviyesi (Şekil 1A) bağımsız hücre şekli uzanıyordu. VIS Öte yandan, (eWAT türevi), yüksek Sca1 ve Sca1 düşük hücreleri, hücre şekli belirgin farkı göstermektedir. VIS SQ (IWAT türevi) Sca1 yüksek hücreler gibi VIS Sca1 .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda izolasyon ve farklı yağ pedleri gelen fare TSK immunomagnetic hücre ayırma ve in vitro deneyler için onların kullanımını göstermektedir. Sunulan yöntem TSK 9,14 arasında, teknik olarak karmaşık ve pahalı FACS aracılı izolasyon avantajlıdır Sca1 pozitif TSK sayıda hızlı izolasyonu için etkilidir. FACS aksine immünomanyetik hücre ayırma, bir hedef hücre popülasyonunun belirlenmesine ilişkin birden fazla antijenin kullanılmasına izin vermez. Yüzey antijeni iyi karakterize eğer Bununla birlikte.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser (THC) NIH DK095137 tarafından desteklenmektedir. Biz anlatılan yöntemlerin geliştirilmesine ve gelişmişliği katkıda mevcut ve eski laboratuar üyelerine teşekkür ederim.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tip 3 KollajenazWorthington BiyokimyasalLS004182Doku sindirimi
DMEMGibco11965-092Yüksek glikoz kültür ortamı
Kalem / Strep / Glutamin (100x)Gibco10378-016Medya antibiyotik
Anti-anti (100x)Gibco15240-062Medya mantar önleyici
FBSGibco16000-044
PBS (1x, pH 7.4)Gibco10010-023
Tripsin (%0,05)Gibco25300-054
Hücre süzgeciBD Bioscience352360100-μ m hücreli süzgeç
60 mm plakalarBD Falcon353004
MakasFST14001-12Büyük
MakasFST14091-11İnce, kavisli uç
Büyük ForsepsFST11000-12
İnce ForsepsHerhangi bir satıcı
25G 5/8" iğnelerBD305122
22G 1.5" iğnelerBD305159
15 ml konik tüplerBD Falcon352097
50 ml konik tüplerBD Falcon352098
MACS ayırma kolonlarıMiltenyi Biotec130-042-201
Anti-Sca1 mikroboncuk kiti (FITC)Miltenyi Biotec130-092-529FITC-anti-Sca1 1º Ab ve anti-FITC mikro boncuklar 2 º Ab
AutoMACS çalışan tamponMiltenyi Biotec130-091-221
MiniMACS ayırıcıMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Mavi chux pedleriFisher276-12424
Emici pedlerFisher19-165-621
Strafor levha50 ml'lik tüplerden kullanım
%70 etanol
İzofluranHerhangi bir satıcı
Sıçan IgG2a Alexa Fluor 647InvitrogenR2a21
Sıçan IgG2a anti-fare Sca1 Alexa Fluor 647InvitrogenMSCA21
Sıçan IgG2a R-PEInvitrogenR2a04
Sıçan IgG2a anti-fare F4 / 80 R-PEInvitrogenMF48004
Yuvarlak tabanlı tüpBD Falcon352058
HBSS (– Ca, – Mg)Gibco14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)Gibco14025-092Kollajenaz çözeltisi için
Tip I kollajen (37 mm asetik asit içinde 2,7 mg / mlEvde hazırlayın12
10x MEMGibco11430-030
1 M HEPESGibco15630-080
0.34 N NaOHEvdehazırlayın
Kapak fişleriCorning2870-22
Alexa Fluor 594 karboksilik asit, süksinimidil ester, karışık izomerlerInvitrogenA-20004
0.89 M NaHCO3  Gibco25080-094

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
  2. Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sca1 Pozitif H crelerYa Deposu zolasyonuKollajenaz ile Doku SindirimiAk Sitometrisi AnaliziAnti Sca1 AntikoruManyetik Boncuk ile Ay klamaSubk tan Ya PedleriViseral Ya Pedleri

İlgili makaleler