Kontakt lens (ZL) ve diğer göz ile ilgili başvurularının değerlendirilmesi için mevcut in vitro modeller ciddi sınırlıdır. sunulan okular platformu fizyolojik gözyaşı akışı, gözyaşı hacmini, hava pozlama ve mekanik aşınma simüle. Bu sistem, çok yönlü ve CL analizler nitro çeşitli uygulanabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Şu anda, ilaç iletimi için kontakt lenslerin (CL'ler) in vitro değerlendirmeleri tipik olarak fizyolojik gözyaşı hacimlerini taklit edemeyen büyük hacimli şişelerde1-6 gerçekleştirilmektedir. 7 Geleneksel modelde, her ikisi de oküler ortamın tanımlayıcı faktörleri olan doğal gözyaşı akışı bileşeni ve göz kırpma refleksi de yoktur. Bu çalışmada, fizyolojik gözyaşı hacmini taklit edebilen 2 parçalı benzersiz bir tasarım, göz küresi ve göz kapağı parçasından oluşan yeni bir modelin geliştirilmesi anlatılmaktadır. Modeller, polidimetilsiloksan (PDMS) ve agar gibi çeşitli polimerlerden göz modelleri oluşturmak için kullanılabilen 3D baskılı kalıplardan (Politetrafloroetilen veya Teflon kalıplar) oluşturulur. Ekilen bir insan veya hayvan korneasının veya insan kornea yapısının entegrasyonu gibi göz merceklerinde yapılacak daha ileri modifikasyonlar, daha karmaşık in vitro oküler çalışmalara izin verecektir. Ticari bir mikroakışkan şırınga pompası, fizyolojik gözyaşı salgısını taklit etmek için platforma entegre edilmiştir. Havaya maruz kalma ve mekanik aşınma, biri göz kapağı parçasını yanal olarak hareket ettiren ve diğeri göz küresi merceğini dairesel olarak hareket ettiren iki mekanik aktüatör kullanılarak elde edilir. Model, ilaç iletimi ve CL'ler üzerinde gözyaşı bileşenlerinin birikmesi için CL'leri değerlendirmek için kullanılmıştır.
Giriş
kontakt lens (KL) arena içinde ilgi iki önemli alanlar rahatsızlık ve yeni CL uygulamalarının geliştirilmesini içermektedir. CL rahatsızlık altında yatan mekanizmaların tanıtılması yıllardır alanını atlatmış olan bir konudur. 8 romanın gelişimi, bu tür ilaç iletim cihazları 1,3,9 ve biyosensörler gibi fonksiyonel ZL, 10-12 büyüyen bir ilgi alanıdır, önemli potansiyel pazarları ile. Her iki durumlarda, in vitro model sofistike bir gelişim aşamasında lens malzemeleri veya tasarım özellikleri uygun seçilmesi ile yardımcı olmak için ilgili bilgileri sağlayacaktır. Ne yazık ki, cls ve diğer göz ile ilgili uygulamalar değerlendirilmesi için in vitro modellerinde geçerli nispeten kaba ve deneyimsiz bulunmaktadır. Geleneksel olarak, gözyaşı filmi birikimi veya ilaç dağıtım değerlendiren in vitro CL çalışmalar sabit bir sıvı hacmi içeren statik, büyük hacimli şişeler içinde yapılır hangi greatly fizyolojik miktarlarda aşmaktadır. Ayrıca, bu basit model, doğal gözyaşı akışı bileşen ve göz çevresinin faktörleri tanımlayarak, her ikisi de yanıp sönen refleks, yoksun.
Sofistike, fizyolojik ilgili göz "model" geliştirilmesi multi-disipliner bir yaklaşım gerektiren ve in vivo doğrulama önemli gerektirecektir. Bu nedenlerden dolayı, bizim in vitro göz modeli için temel çerçeve modeli sürekli gelecek yükseltmeleri ve modülasyon yoluyla geliştirilebilir şekilde, son derece çok yönlüdür. Bugüne kadar, bir model gözyaşı hacmini, yırtılma akışı mekanik aşınma ve hava maruz uyarabilmesi. Amaç vivo ve ex vivo gözlemlerinde için akıllı ve ücretsiz bir anlamlı sonuçlar verecektir in vitro bir model, yaratmaktır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler Üniversitesi'nin Waterloo hayvan araştırma etik komitesi tarafından belirtilen tüm ilgili kılavuzlara uygun ve uyumlu tamamlanmıştır. sığır gözler cömertçe yerel mezbahaya bağışlanan.
1. Göz Modeli
- Tasarım ve Kalıp 13 Üretimi
- İnsan yetişkin gözlerin ortalama fizyolojik boyutlarına göre göz modelleri tasarlar. 13
- göz küresi ve göz modelinin göz kapağı parçaları arasında 250 mikron bir boşluk bırakın. bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak ilgili kalıp tasarımı.
- AutoCAD veya Solidworks ile yeni .cad dosyası veya .sldprt dosyası oluşturun. insan göz küresi / göz kapağı 3D modelleri oluşturun. modellerin kalıpları oluşturun ve stl dosyaları olarak kalıpları kaydedin.
- 3D yazıcı yazılımı içine İthalat stl dosyaları (replicator2 örneğin, makeware). Baskı parametrelerini (yer, seyrekliği, ölçek, oryantasyon, pürüzsüzlük, vb belirtin ) 13.
- 3D yazıcılar okumak için G-kod dosyası olarak kaydedin. Bu PLA (polilaktik asit), ABS (akrilonitril butadien stiren), PC (polıkarbonat) veya bunların bir kombinasyonu gibi seçin malzeme, kalıp 13 baskı.
- seçim malzemesi istenilen iplik takın. okumak için 3D yazıcının içine G-kod dosyasını içe aktarın. kalıp yazdırın.
NOT: Göz modeline yumuşak bir yüzey isteniyorsa, alternatif olarak, (CNC) makine kontrollü bir bilgisayar nümerik kullanarak göz kalıpları üretmek. CNC kalıp üretimi için kalıp malzemeleri artık termal plastik sınırlıdır, ancak metal, seramik ve bu Politetrafloroetilen gibi kimyasal direnç polimerler uzatmak. - Bir kesim matkap bağlı olan CNC yazılım arayüzü açın. Ön, üst, yan ve kontrol yazılımı arayüzü, daha önce inşa göz küresi / gözkapağı modeli kalıp perspektif görünümleri göre 3D kalıpları oluşturun. için uygun parametreleri seçinMakinede (bit boyutu, alt tabaka malzemesi, malzeme kalınlığı) ve kalıp kesim geçin.
- PDMS kullanılması Oküler sentezi
- Bir şırınga kullanılarak, PDMS (polidimetilsiloksan) baz 10 mi hacmini ölçmek ve 15-50 ml santrifüj tüpüne doldurun. PDMS toplam ağırlığına göre, elastomer çözeltisi ağ / hac% 10 ekleyin. Bir karıştırma çubuğu kullanarak, iyi çözüm karıştırın.
- göz küresi ve göz kapağı kalıpların içine PDMS çözüm dökün. PDMS RT O / N yerleşmek için izin verin (ya da en azından 12 saat süreyle) polimerizasyonu başlatmak ve kabarcıklar polimerin dışına çözünmesi için izin vermek.
NOT: yükselecek ya da genişletmek olabilir PDMS sol hava kabarcığı olmadığından emin olun. - Daha sonra, 1 saat, ya da 5 dakika için 150 ° C (302 ° F) 75 ° C (167 ° F) fırına kalıplar koydu. daha yumuşak bir jel, PDMS tamamen polimerize için en az 48 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- Bir kaç dakika dondurucuda örnekleri koymak; Bu PDMS küçültmek ve basitleştirecekkalıplardan numune alım. ince bir spatula kullanılarak kalıplardan oküler ekstrakte edin.
- göz küresi ve göz kapağı parçaları arasındaki boşluğa bir çözüm teslimi için, 1/16 "eşit bacak bağlantı borusu konnektörü ile 1/16" x 1/8 "politetrafloroetilen tüp bağlamak ve boru delik göz kapağı parça ekleyin .
- Agaroz kullanma Gözküresi Piece sentezi
NOT: gözün parçası örneğin agaroz gibi polimerler kullanılarak sentezlenebilir. Aşağıdaki prosedür, aynı zamanda, PDA (patates dekstroz ağar) ya da SDA'nın (Sabouraud Dextrose Agar) agar türleri, çeşitli göz parçaları üretmek için değiştirilebilir.- % 2 (2 g / 100 mi) jel, ölçü agaroz 2 g üretim ve ultra saf su ve 100 ml karıştırın. Agaroz tamamen eriyene şekilde Çıban (100 ºC) çözüm getirin. Çözelti 5 dakika soğumaya bırakın.
- göz küresi kalıba çözüm dökün ve çözüm 3 soğumasını bekleyinOda sıcaklığında 0 dak. bir spatula ile gözün parçalarını çıkarın. Bir de gözün agar Mağaza -20 daha sonra kullanmak üzere ° C dondurucu. Mikrobiyoloji çalışmaları için, otoklav ve / veya UV-ışıması ile gözün kalıpları sterilize edin.
- PDMS göz küresi üzerinde Sığır Kornea Ortaklığın
Not:. Bu protokol Parekh ark adapte edilmiştir 14- bir laminar akış başlığı altında steril şartlarda sığır kornea diseksiyon ve birleşme gerçekleştirmek. gözleri kazanmak ve aynı gün onları teşrih.
- Kullanmadan önce 10 dakika akış kaputu açın ve% 70 etanol alkol ile dezenfekte. Tüm malzemeler ve aletler 273 ° F / 45 dakika 133 ° C'de otoklav ile steril ve akış kaputu girişinde az 4 inç konumlandırılmış emin olun.
- 2 dakika için seyreltilmiş bir povidon-iyodin solüsyonu içeren bir cam kapta sığır göz bırakın. fosfat tamponlu tuzlu su ihtiva eden bir beher içinde göz yıkama (PBS) p-H 7.4. Forseps hafifçe cam petri, kornea yüzü yukarı göz yerleştirin.
- künt uç diseksiyon makas ile skleral eki noktalarında kesim tarafından aşırı kas ve yağ dokusu çıkarın. hayvan atıkları için belirlenmiş bir steril beher içine aşırı doku atınız.
- Mikro-makas kullanarak, gözün konjonktiva çıkarın. limbusta en az 1 cm'lik bir mesafeyi koruyarak, steril gazlı bez ile göz sarın.
- Altta yatan koroid ve vitreus penetrasyonunu önlemek ve yüzeysel şekilde bir neşter kullanılarak, yaklaşık 2 mm limbus bölgeden sklera insizyon. Dikkatle doğal eğrilik kornea deforme olmadan bir neşter veya diseksiyon makas kullanılarak 360 ° kesi uzatmak.
- ince forseps ile gözün kornea çıkarın. forseps kullanarak, dikkatli herhangi yapışan uveal dokuyu çıkarmak ve PBS ile kornea durulayın.
- Kültür steril bir kap içinde 31ºC kornea MağazaOrta (Medium 199 gibi), doku nem ve hücre besin sağlamak için% 3 fetal sığır serumu ihtiva eden.
- deney öncesinde, PDMS göz küresi üzerinde eksize kornea dinlenme ve özel bir klipsli ile birlikte iki adet kelepçe.
2. Blink platform
- Blink-platform Tasarımı ve Üretimi
NOT: kırpma platform üç fonksiyonel bölümden oluşmaktadır: göz modeli (bölüm 1 'de tarif edilmiştir), bir vites indirgeme sistemi, elektronik sistem.- Tasarım göz modeli (bölüm 1.1) için tarif edilene benzer CAD ve 3D baskı kullanarak yanıp platformu üretim ve. O eyepieces yanal ve dönme hareketleri içine motorların basit dönüşünü çevirir şekilde vites sistemi tasarlayın. 15
- pinyon ve dişli mekanizmasını kullanarak, kapak parçalarına bağlı olan bir dişli, yatay hareketine bir kademeli motorun dönme hareketi çevirir.
- Kullanmakkonjuge bir vites indirgeme sistemi, üç farklı küresi parçaları için üç (veya daha fazla) dönme hareketleri bir adım motoru ile ilgili bir dönme hareketi yükseltmek.
- ikisi arasındaki mesafenin sabit böylece, iki dişli sistemleri, göz kapağı diğeri göz küresi için bir hizaya getirin. bir mikro motor kalkan ve iki motor ile elektronik sistem monte edin.
NOT: yanıp sönen bir hareket içine dişli sistemi tarafından çevrilmiştir dönme motorları sağlamak için iki step motorlar kullanın. - mikrodenetleyici yığılmış bir motorlu kalkan oluşan bir sistem ile iki step motorlar bağlayın. Bağlayın ve açık kaynak kodlu yazılım ürünleri ile çalışmak için elektronik bileşenler yapılandırın.
- Böyle dakikada mermi (RPM), ileri mermi sayısı, geriye mermi sayısı ve dönme tarzı olarak motor parametrelerini kontrol etmek için sistemin programlanmasına.
NOT: Ayrıntılı bilgi için tamamlayıcı "Arduino kod dosyası" bölümüne bakın. - ma sistem yazılımını indirinnufacturers 'web sitesi.
- yazılımı yükleyin ve açın. İstenilen yapılandırmada step motorları kontrol etmek için bir kod yazın. araştırmacı tarafından tanımlanan motorlar istenilen şekilde hareket böylece elektronik sistem güç bir kaynağı ile bağlantı sistemi.
NOT: Ek "Arduino kod dosyası" bölümüne bakın.
- Mikroakiskan ile Meclisi (Yapay Gözyaşı Çözüm)
- Sentezlenen göz küresi ve göz kapağı parçaları alın ve göz modeli için bunlara karşılık gelen klip-ons üzerine onları kayma. gözkapağı parça (bölüm 1.2.5) ile mikroakışkan pompa üzerinde bir şırınga ile katıldı ve konumlandırılmış boru bağlayın. Test platformu çalıştırmak ve tutarlı hareket edin.
- Başbakan boru ve suni gözyaşı solüsyonu (ATS) sürekli bir akış kontrol edin. ATS için reçete daha önce rapor edilmiştir. 16
- El ile, bir seviye uçakta birlikte göz modeli parçaları taşımak şekilde göz küresi ve gözKapak temas halindedir. istenen değerlere mikroakışkan pompa akış hızını ayarlayın. 1-1.5 ul / dk fizyolojik debileri ayarlayın. 17
- deney başlamak için pompayı ve aktüatörler başlayın. ilaç verme deneyleri için, göz küresi parçasına ilaç içeren kontakt lens yerleştirin.
- akış sıvısı 12 plaka içine damla izin verin. İstenen belirlenen zaman aralıklarında, UV-Vis spektroskopisi veya floresan gibi ortak bulgulama yöntemleri kullanarak analit veya ilaç konsantrasyonunu ölçmek. 1,4,18
- kontakt lensler göz yaşartıcı bileşenlerinin birikimi değerlendirmek çalışmaları için, "göz küresi" parçasının üzerine kontakt lens yerleştirin. atılabilir akış sıvısı, toplayın.
- istenilen zaman aralıklarında sonra, göz küresi parçasından kontakt lensi çıkarın ve konfokal mikroskopi olarak daha fazla analiz için lensi hazırlamak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Makine dükkandan ve 3-D baskı elde edilen sentez göz kalıplar, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu kalıplar, istenen özelliklere sahip oküler üretilmesi için, örneğin agaroz PDMS ve benzeri gibi polimerler, çok çeşitli kullanılabilir. Mikroakışkan şırınga pompası göz modeli platformun işaret düzeneği, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Platformu ve kapak parçasının hareketi üzerinden yan boyunca gözün parçasının döndürme ve havaya maruz vasıtasıyla mekanik a...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Orada özel dikkat gerektiren protokolü içinde üç kritik adımlar şunlardır: tasarım ve kalıp üretimi (bölüm 1.1), platformu montajı (bölüm 2.2.1-2.2.3) ve deneysel koşmak izleme (bölüm 2.2.4-2.2.7 ). tasarımı ve kalıplar (Bölüm 1.1) üretimi açısından, gözün parçası, bir insan kornea boyutlarına göre tasarlanmış olmalıdır. Ancak, mükemmel bir ticari kontakt lens (CL) uyuyor oluşturulabilir bir göz küresi parçasının önce kalıbın birden prototipler gerektirebilir. göz küresi ve göz kapağı parçası CL mevcut olduğunda gözyaşı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar Gelişmiş Oftalmik Malzemelerin Geliştirilmesi için fon kaynağı NSERC 20/20 Ağ kabul etmek istiyorum.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Arduino Uno R3 (Atmega328 - montajlı) | Adafruit | 50 | Kart |
| Step motor | Adafruit | 324 | Motor ve Motor kalkanı |
| Eşit Bacak Bağlayıcı 1.6mm 1/16" | VWR | CA11009-280 | 50 adet tüp konektörü |
| Boru PT / SIL 1/16 "x1 / 8" | VWR | 16211-316 | 50feet |
| PDMS | Dow Corning | KasasıSylgard 184 Güneş Pili Kapsülleme | |
| Agaroz, Tip 1-A, düşük EEO | Sigma-Aldrich | A0169-25G | |
| PHD UltraTM | Harvard Aparatı | 703006 | MikroAkışkan Pompa |
| Sığır korneası | Cargill, Guelph/ON | ||
| Soldidworks | Dassault Systemes | Yazılımı | |
| 3 boyutlu baskı | Waterloo Üniversitesi - 3D Baskı Merkezi | ||
| Diseksiyon araçları | Güzel Bilim Araçları | Genel diseksiyon araçları | |
| Orta 199 | Sigma-Aldrich | Kültür ortamı kornea için depolama | |
| Fetal sığır serumu | Thermo Fisher | Kültür ortamına ekle, toplam hacmin %3'ü |
Kaynaklar
- Phan, C. M., Subbaraman, L. N., Jones, L. In vitro drug release of natamycin from beta-cyclodextrin and 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin-functionalized contact lens materials. J Biomater Sci Polym Ed. 25, 1907-1919 (2014).
- Peng, C. C., Kim, J., Chauhan, A. Extended delivery of hydrophilic drugs from silicone-hydrogel contact lenses containing vitamin E diffusion barriers. Biomaterials. 31, 4032-4047 (2010).
- Hui, A., Willcox, M., Jones, L. In vitro and in vivo evaluation of novel ciprofloxacin-releasing silicone hydrogel contact lenses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 4896-4904 (2014).
- Boone, A., Hui, A., Jones, L. Uptake and release of dexamethasone phosphate from silicone hydrogel and group I, II, and IV hydrogel contact lenses. Eye Contact Lens. 35, 260-267 (2009).
- Lorentz, H., Heynen, M., Trieu, D., Hagedorn, S. J., Jones, L. The impact of tear film components on in vitro lipid uptake. Optom Vis Sci. 89, 856-867 (2012).
- Hall, B., Phan, C. M., Subbaraman, L., Jones, L. W., Forrest, J. Extraction versus in situ techniques for measuring surface-adsorbed lysozyme. Optom Vis Sci. 91, 1062-1070 (2014).
- Mishima, S., Gasset, A., Klyce, S. D., Baum, J. L. Determination of tear volume and tear flow. Invest Ophthalmol Vis Sci. 5, 264-276 (1966).
- Nichols, J. J., et al. The TFOS international workshop on contact lens discomfort: executive summary. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 7-13 (2013).
- Peng, C. C., Burke, M. T., Carbia, B. E., Plummer, C., Chauhan, A. Extended drug delivery by contact lenses for glaucoma therapy. J Control Release. 162, 152-158 (2012).
- Faschinger, C., Mossbock, G. Continuous 24 h monitoring of changes in intraocular pressure with the wireless contact lens sensor Triggerfish. First results in patients. Der Ophthalmologe : Zeitschrift der Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft. 107, 918-922 (2010).
- Shaw, A. J., Davis, B. A., Collins, M. J., Carney, L. G. A technique to measure eyelid pressure using piezoresistive sensors. IEEE transactions on bio-medical engineering. 56, 2512-2517 (2009).
- Liao, Y. T., Yao, H. F., Lingley, A., Parviz, B., Otis, B. P. A 3-mu W CMOS glucose sensor for wireless contact-lens tear glucose monitoring. Ieee J Solid-St Circ. 47, 335-344 (2012).
- Coster, D. J. Cornea. , John Wiley & Sons. Wiley-Blackwell (Imprint) John Wiley & Sons (2002).
- Parekh, M., et al. A simplified technique for in situ excision of cornea and evisceration of retinal tissue from human ocular globe. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3765(2012).
- Gear and pinion. US patent. , US2279216A (1942).
- Lorentz, H., et al. Contact lens physical properties and lipid deposition in a novel characterized artificial tear solution. Molecular vision. 17, 3392-3405 (2011).
- Furukawa, R. E., Polse, K. A. Changes in tear flow accompanying aging. American journal of optometry and physiological optics. 55, 69-74 (1978).
- Bajgrowicz, M., Phan, C. M., Subbaraman, L., Jones, L. Release of ciprofloxacin and moxifloxacin from daily disposable contact lenses from an in vitro eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. , (2015).
- Luensmann, D., Zhang, F., Subbaraman, L., Sheardown, H., Jones, L. Localization of lysozyme sorption to conventional and silicone hydrogel contact lenses using confocal microscopy. Current eye research. 34, 683-697 (2009).
- Tieppo, A., Pate, K. M., Byrne, M. E. In vitro controlled release of an anti-inflammatory from daily disposable therapeutic contact lenses under physiological ocular tear flow. Eur J Pharm Biopharm. 81, 170-177 (2012).
- Ali, M., et al. Zero-order therapeutic release from imprinted hydrogel contact lenses within in vitro physiological ocular tear flow. J Control Release. 124, 154-162 (2007).
- White, C. J., McBride, M. K., Pate, K. M., Tieppo, A., Byrne, M. E. Extended release of high molecular weight hydroxypropyl methylcellulose from molecularly imprinted, extended wear silicone hydrogel contact lenses. Biomaterials. 32, 5698-5705 (2011).
- Kaczmarek, J. C., Tieppo, A., White, C. J., Byrne, M. E. Adjusting biomaterial composition to achieve controlled multiple-day release of dexamethasone from an extended-wear silicone hydrogel contact lens. J Biomater Sci Polym Ed. 25, 88-100 (2014).
- Mohammadi, S., Postnikoff, C., Wright, A. M., Gorbet, M. Design and development of an in vitro tear replenishment system. Ann Biomed Eng. 42, 1923-1931 (2014).
- Lorentz, H., Heynen, M., Khan, W., Trieu, D., Jones, L. The impact of intermittent air exposure on lipid deposition. Optom Vis Sci. 89, 1574-1581 (2012).
- Peng, C. C., Fajardo, N. P., Razunguzwa, T., Radke, C. J. In vitro spoilation of silicone-hydrogel soft contact lenses in a model-blink cell. Optom Vis Sci. 92, 768-780 (2015).
- Liu, P., et al. Dissolution studies of poorly soluble drug nanosuspensions in non-sink conditions. AAPS PharmSciTech. 14, 748-756 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
