Yöntem makalesi

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

DOI:

10.3791/53909

⸱

27 Mart 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüsün konak hücrelere girişi sırasında influenza A virüs çekirdeklerinin sökülmesi çok adımlı bir işlemdir. Viral kaplamanın erken aşamalarını analiz etmek için bir in vitro yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımda, tanımlanmış koşullar altında kaplamayı başlatan adımları biyokimyasal olarak incelemek için hız gradyan santrifüjlemesi kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asitle tetiklenen moleküler süreçler, endositik sistemden giren birçok virüsün hücre girişini yakından kontrol eder. İnfluenza A virüsü (IAV) durumunda, endozomal membran ile virüs füzyonu ve ardından viral kapsidin soyulma adı verilen sökülmesi, endositik veziküller içindeki iyonik koşullar tarafından yönetilir. Virüs yaşam döngüsündeki erken adımların incelenmesi zordur, çünkü endozomlara deneysel olarak doğrudan erişilemez ve bu da in vitro bir yaklaşıma ihtiyaç yaratır. Burada, IAV çekirdeğinin ve stabilitesinin analizini sağlayan iki katmanlı bir gliserol gradyanı yoluyla saflaştırılmış virionların hız gradyanı santrifüjlenmesine dayanan bir yöntemi açıklıyoruz. Gradyan, virüs dibe doğru çökelirken çözündürme yoluyla viral zarı çıkarmak için alt katmanında iyonik olmayan bir deterjan (NP-40) içerir. Nötr pH'ta, viral çekirdekler stabil yapılar olarak peletlenir. Ana çekirdek bileşenler, matris proteini (M1) ve viral ribonükleoproteinler (vRNP'ler), SDS-PAGE ile pelet fraksiyonunda açıkça tanımlanabilir. Alt katmanda pH'ın 6.0 veya daha düşük bir seviyeye düşürülmesi, M1'i peletten seçici olarak uzaklaştırır ve ardından daha asidik koşullarda vRNP'lerin salınması gelir. Coomassie ile boyanmış jeller üzerindeki viral protein bantları, IAV demontajının ara durumlarını izlemek için dansitometrik kantifikasyona tabi tutulabilir. PH'ın yanı sıra, tuz konsantrasyonu ve varsayılan viral kaplama açma faktörleri gibi viral çekirdek stabilitesini etkileyen diğer faktörler, deterjan içeren gliserol tabakasının buna göre modifiye edilmesiyle değerlendirilebilir. Birlikte ele alındığında, sunulan teknik, in vitro viral kaplamanın yüksek oranda tekrarlanabilir ve kantitatif analizine izin verir. Karmaşık kaplama açma işlemlerinden geçen diğer zarflı virüslere uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnfluenza A virüsü (IAV) zarflı bir virüstür ve Ortomiksoviridae ailesine aittir. Bu genler, parça parça, negatif sens, tek iplikçikli bir RNA genomu üzerindeki kodlanır. İnsanlarda, IAV mevsimsel salgın salgınlar meydana solunum yolu enfeksiyonları, nedenleri ve küresel salgın hastalıklar 1 potansiyelini taşımaktadır. Ev sahibi hücre yüzeyi 2 sialik asit artıkları bağlanma üzerine, IAV klatrin bağlı endositoz ve klatrin bağımsız yollar 3-8 ile yerleştirilebilir. Endositik vakuollerde asidik ortam (pH <5.5), viral füzyonu ve geç endosomal zarı 9 sonuçlanır IAV başak glikoprotein hemaglutinin (HA), büyük bir yapısal değişim tetikler. Site o - IAV kapsid kez geç endosomes (LES), bu çekirdeğin içine viral ribonükleoproteinlerin (vRNPs) taşınması ve ardından sitozolde kaplanmamış olan kaçan (burada da viral "çekirdek" olarak anılacaktır)f virüs replikasyonu ve transkripsiyonu 10-13. HA asit aktivasyonu öncesinde virüs ileride bunun demontajı 14-16 çekirdek hazırlar endositik sistemi, pH tedrici bir azalma yaşar. Bu "priming" proton ve K +10,14,16 akını aracılık viral membran M2 iyon kanallarını adım. Virüs iç iyonik konsantrasyon değişim etkileşimleri, viral matriks protein M1 ve sekiz vRNP demet tarafından inşa rahatsız ve membran füzyon 10,14-17 aşağıdaki sitoplazmada IAV olmama kolaylaştırır.

hazırlama aşamasında doğrudan ve kantitatif analiz endozomlar deneysel ulaşılması zor olduğu gerçeği engel olmuştur. giriş süreci, dahası, son derece olmayan eşzamanlı olduğunu. Buna ek olarak, bu tür serbest viral RNA veya enfekte ölçümlerinin QRT-PCR gibi son nokta tahlilleri, viral capsi biyokimyasal durumu hakkında detaylı bir resmini sağlamazgiriş herhangi bir aşamasında, d. SiRNA veya ilaç tedavisi ile endozomlardan pertürbasyon anlamlı IAV girişi 18-20 anlayışına katkıda bulunurken, ince ayar sıkı kontrol endosome olgunlaşma programında belirsiz yan etkileri zor ve eğilimli.

Bu sorunları önlemek için, hız gradyanı ile santrifüjleme 17 kullanımına dayanmaktadır, daha önce geliştirilmiş in vitro protokol adapte edilmiştir. Çoğunlukla proteolitik bölünme EM analizi ile izlenmiştir deterjan muamelesi kombinasyonları dayanmaktadır diğer girişimlerde 21,22, 23,24, aksine, bu yaklaşım kolayca ölçülebilir bir sonuç sağladı. Farklı gradyan katmanları üzerinden Santrifüj çöktürülmesi parçacıklar maruz bırakılmış ve kontrollü bir şekilde değişen koşullara reaksiyona sağlar. Sunulan protokol olarak, IAV açıklık allantoik akışkan ya da saflaştınlmış viral parçacıkların elde edilen iki tabakalı bir gliserine çöktürülürgradyan olup, buradaki alt tabaka, iyonik olmayan bir deterjan NP-40 (Şekil 1) içerir. Virüs, ikinci deterjan içeren katmanı girdiğinde, viral lipid zarfı ve zarf glikoproteinleri yavaşça çözülmüş ve geride bırakılır. çekirdek, sekiz vRNP demet oluşan ve bir matris tabakasıyla çevrili, pelet fraksiyonu içine kararlı bir yapı olarak çökelleri. M1 ve vRNP ilişkili nükleoprotein (NP) ve viral çekirdek proteinleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile pelet içinde tespit edilebilir. Özel olarak, ticari olarak temin edilebilen gradyan jelleri yararlanarak ve son derece hassas Coomassie 25 ile boyama, yüksek hassasiyet ve viral çekirdek ilişkili proteinlerin küçük miktarlarda bile tespitini sağlar.

Bu pH, tuz konsantrasyonu ve varsayılan kılıfının faktörler temel bileşenleri ve çekirdek stabil ve sedimantasyon davranışları üzerindeki etkileri gibi farklı koşullar olup olmadığını test etmek için temel ayarlar Sığ. Bu amaç için, gliserol geçişi olarak sadece düşük, deterjan içeren katman faktörü ya da ilgi duyulan durum girerek modifiye edilir. Teknik IAV çekirdek 16 bütünlüğüne pH değerleri ve tuz konsantrasyonları farklı etkisini araştıran özellikle değerli olmuştur. IAV olmama arasında ara adımlar pH 5.5 ve daha düşük 16,17 (Şekil 1) vRNP ayrışma ardından hafif asidik pH'ta (<6.5) matris tabakasının dahil olmak üzere ayrılmasını takip edilebilir. Ikinci adım geç endositik ortamı 16 yansıtan gliserol tabakasında yüksek K + konsantrasyonu varlığında tarafından geliştirilmiştir. Virüs ve çekirdek degrade ile tortulaşmış Böylece, onlar bir değişen ortam endosemelerde taklit koşullar yaşadı. Sonuç hücre biyolojisi deneyleri türetilen sonuçları tamamlayan, in vitro viral çekirdek kademeli sökme oldu.

t "> Burada sunulan yöntem, hızlı etkin ve IAV son derece tekrarlanabilir analiz etti (X31 ve A / KAA / 33) ve IBV (B Lee / 40 /) asidik pH ile tetiklenir ve demontaj yanı sıra K +16,17 artan olmama Bu düşünülebilir alkali pH maruz 17 üzerine paramiksovirüs çekirdeklerin. yaklaşım hücre girişi sırasında viral kapsid yapısı ve kapsid sökme biyokimyasal özellikleri içgörü kazanmak için diğer zarflı virüsler adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tamponlar ve Stok Çözümleri hazırlanması 1.

  1. 80 mi GKD 2 O 470 mg TRIS-hidroklorid, 390 mg MES hidrat ve 580 mg NaCI çözülmesiyle (20 mM MES, 30 mM Tris ve 100 mM NaCl) MNT tamponu hazırlayın PH 7.4 tampon ayarlamak ve GKD 2 O 100 ml'lik bir nihai hacme getirmek
  2. 80 ml ​​dH 2 O her 9.76 gr MES hidrat çözerek 500 mM MES tamponu üç özdeş çözümler hazırlayın. konsantre NaOH ile titre edilerek, sırasıyla pH 5.8, 5.4 ve 5.0, tamponları ayarlayın. DH 2 O 100 ml'lik nihai hacme kadar her bir tampon getirmek
  3. DH 2 O 80 ml, her 7.88 gr TRIS-hidroklorid çözülmesiyle 500 mM Tris tamponu, iki özdeş çözüm hazırlanması ve konsantre HCI ile titre edilerek, sırası ile 7.4 ve 6.4, pH ayarlamak. DH 2 O 100 ml'lik nihai hacme kadar tampon getirmek
  4. DH 2 O% 50 gliserol çözeltisi hazırlayın ve glisin kadar iyice karıştırınerol berrak bir karışım. Bir cam şişe içine Steritop filtre birimi (0.22 um gözenek boyutu) ile çözelti filtre.
  5. 10% NP-40 çözeltisi ve DH 2 O 1 M NaCl hazırlanması
  6. 4 ml GKD 2 O. iki tablet çözerek 25x konsantre proteaz inhibitörü hazırlayın

Gliserol Gradyanların 2. Hazırlık

  1. 5 mi deterjan tamponu ana karışımı hazırlanması (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 ve 5.0) test etmek için, her bir pH durumu için çözeltisi (300 mM NaCl,% 2 NP-40, 2 x proteaz inhibitörü konsantre edildi). Bu amaçla, 1 M NaCI 9 mi, 10% NP-40, 6 ml 25x proteaz inhibitörü stokunun 2.4 mi, 9 mi GKD 2 0 karıştırın.
  2. Her pH koşulu pipet için 50 ml konik tüp içine ana karışımı 4.4 ml.
  3. pH değerleri 5.8 üzerinde tüp için ilgili pH'ı ayarlanmış 500 mM Tris stok çözeltisi 0.6 ml ekleyin. pH 5.8 ve daha düşük için ilgili pH'ı ayarlanmış 500 mM MES, stok çözeltisi 0.6 ml ekleyin.
  4. 5 yapmak300 mM NaCl ihtiva eden tampon çözeltisi mi, 2x proteaz inhibitörü, 60 mM Tris pH 7.4, GKD 2 O ayarlandı Bu deterjan içermeyen kontrol degrade tampon olarak görev yapacak.
  5. Gerekirse, sırasıyla konsantre edildi HCI ve NaOH çözeltileri eklenerek pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 ve 5.0 için çözeltilerin pH ince ayarlar.
  6. altı farklı% 25 gliserol Çözeltilerin elde edilen deterjan içeren deterjan içermeyen tampon karışımları, 5 ml% 50 gliserol stokunun 5 ml. pH indikatör şeritleri kullanarak pH değerlerini kontrol edin.
    Not: ölçülü bir pH istenen değerden önemli ölçüde farklıdır durumda, ilgili çözümleri tekrar hazırlanmalıdır.
  7. 7 oranında a 3 dH 2 O ile% 50 gliserol stok karıştırılarak% 15 gliserol çözeltisi hazırlayın.

IAV 3. Ultrasantrifüj

  1. 5 ml'lik bir şırınga ve bir öncesine kullanılarak ultra net santrifüj tüpleri içine (13.2 mi, 14 mm x 89 mm), 3 ml% 15 gliserol solüsyonu ilavedle (9 cm uzunluğunda 21 G). Bu eğim bütünlüğünü bozacağı olarak borunun iç duvarında damla bırakmayın. Altı santrifüj tüpleri test beş pH koşulları her biri için, kontrol örneği için bir toplam için tekrarlayın.
  2. Dikkatli bir şekilde 5 ml şırınga ve uzun bir iğne kullanılarak% 15 gliserol tabakasının altında 3.4 mL% 25 gliserol çözeltisi yerleştirin. iki kat karıştırmak değil özen gösterin. ilgili pH ayarlı gliserol çözeltileri test etmek altı koşulları için tekrarlayın.
    NOT: Aşağıdaki adımlar için sınıf II biyogüvenlik kabini içinde çalışmak.
  3. Yavaşça 1 mi MNT tamponu içinde seyreltilmiş IAV (X31, H3N2) içeren alantoik akışkan açıklık 30 ul gliserol gradyanlar Bindirme her gradient (20-30 ug toplam viral proteinin karşılık gelir).
  4. Denge tüpleri karşı ve SW41 Ultrasantrifügasyon rotor içine koyun. 55.000 x g'de 150 dakika, ve 12 ° C santrifüj.
  5. Santrifüj işleminden sonra, dikkatli bir şekildeTemiz bir Pasteur pipeti ve bir aspiratör kullanarak süpernatant, yani hem gliserol katmanlarını kaldırmak. 40 ul (1 x), LDS numune tamponu indirgeyici olmayan pelletini. Tamamen pelet çözülür aşağı birkaç kez pipetleyin ve önemlidir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine örnek aktarmak.

Topak bölümleri ve Coomassie boyama 4. SDS-PAGE

  1. 10 dakika boyunca 95 ° C 'de, tüm numuneler ısıtın. bu, SDS-PAGE ile analiz edilinceye kadar, bu noktada numune -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. Yük bir prekast gradyanı (% 4-12) üzerinde eritildi pellet 20 ul Bis-Tris Mini jeli ve çalışan tampon 1x MOPS SDS içinde 200 V de 1 saat boyunca çalışır.
  3. GKD 2 O'da% 40 metanol ve% 10 buzlu asetik asit ile sabitleme çözeltisi yapmak
  4. 1 saat için tespit çözeltisi içinde jel inkübe ve Coomassie solüsyonu yeterli bir hacmi ile 15 cm'lik bir hücre kültür kabı içinde gece boyunca hafifçe lekeOda sıcaklığında çalkalayarak.
    NOT: boyama çözeltisi buharlaşmasını önlemek için yemek kapatmak için önemlidir.
  5. GKD 2 O. jel destain Jel arka plan berrak hale gelinceye kadar GKD 2 O her 15-20 dakikada bir değiştirin. Bu bant ölçümü için taranır kadar 4 ° C 'de GKD 2 O jel saklayın.
  6. yüksek çözünürlükte jel tarayın ve protein bandı yoğunluklarının ölçümü için piyasada mevcut veya ısmarlama yazılımı kullanın. İlgili bantları yakın bir bölgeden arka plan sinyalini çıkartın ve (pH 7.4'te) deterjan içermeyen kontrol numunelerine bu değerleri normalize.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce tartışıldığı gibi, endosemelerde priming yetkili olmama IAV çekirdeğini oluşturmak için gereklidir. çekirdeğin protonlanma M1 ve vRNPs etkileşimini zayıflatır (viral RNA, NP oluşan ve polimeraz kompleksi PB1 / PB2 / PA). Gelen virüsü erken endozomlarda (AİS) 6.5 (veya daha düşük) bir pH değerine maruz kalmış ve LES yaklaşık pH 5.0'a virüs sigorta kadar devam eder, bu işlem başlatılır.

pH düşmesi taklit etmek amacıyla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral kapsidler metastabil makromoleküler kompleksler bulunmaktadır. virionlar montaj virüs genomunun encapsidation ve yoğunlaşmayı gerektirir, enfeksiyon sonraki turda başlanması bu kompakt kapsid yapısının sökülmesi bağlıdır. Virüsler hücresel reseptörler, şaperonlar, proteolitik enzim, motor protein ve helikazlar yanı sıra pH ve iyonik anahtarları 26,27 tarafından sağlanan fiziksel kuvvetler de dahil olmak üzere kılıf kılıfının döngüsü kontrol etmek için çeşitli hücresel mekanizmalar yararlanmaya gelişmişt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz reaktif bize sağlamış Yohei Yamauchi ve Roberta Mancini teşekkür ederiz. AH laboratuvar Marie Curie ilk Eğitim Ağları (ITN) tarafından desteklenmiştir, ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) (Sinergia).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
cOmplete™, EDTA içermeyen proteaz inhibitör tabletleriSigma-Aldrich11873580001Stok çözeltisi 2 ila 8 ° C'de saklanabilir; 1 ila 2 hafta boyunca C
Buzlu asetik asitMerck Millipore100063
Gliserol susuz BioChemicaAppliChemA1123
Hidroklorik asitMerck Millipore100317
Uzun enjeksiyon iğnesi (21 & nbsp; G, 9 cm, eğim veya kör uçlu)
MES hidratSigma-AldrichM8250
MetanolMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Şimdi ticari olarak IGEPAL® olarak mevcuttur; CA-630
NuPAGE %4-12 Bis-Tris mini jeller, 10  kuyular, 1.0 mmYaşam TeknolojileriNP0321
NuPAGE LDS numune tamponu (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS çalışan tampon (20x)Life TechnologiesNP0001
pH indikatör şeritleri, pH 4.0-7.0Merck Millipore109542
QC Kolloidal Coomassie LekesiBIO RAD1610803
Sodyum klorürMerck Millipore106406
SodyumhidroksitMerck Millipore106498
Steritop filtre ünitesiMerck Millipore SCGPT05RE
SW41 Ti, ultrasantrifüj rotor setiBeckman Coulter331336
İnce duvar, Ultra şeffaf santrifüj tüpleri, 13.2 & nbsp; ml, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
Tris hidroklorür AppliChemA1087
X31 İnfluenza A virüsü (H3N2), yumurtada yetiştirilen, arıtılmış allantoik sıvıVirapur4 &° C'de taze çözülmüş; Ç

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H z Gradyan Santrif jlemeViral Kapsid Ayr t rmaGliserol GradyanNP 40 SolubilizasyonupH a Ba l UncoatingSDS PAGE AnaliziViral ekirdek StabilitesiMatriks Proteini M1Viral Ribon kleoproteinler

İlgili makaleler