Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Özet

Burada, MS analizi için minyatür çok işlevli bir cihaz olan tek probu kullanarak hem dokuların ortam kütle spektrometresi görüntülemesini (MSI) hem de yerinde canlı tek hücreli MS (SCMS) analizini gerçekleştirmek için protokoller sunuyoruz.

Özet

Kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) ve ortam koşulları altında yerinde tek hücreli kütle spektrometresi (SCMS) analizi, biyolojik örneklerden biyomoleküllerin ayrıntılı kütle spektrometresi (MS) analizi için büyük potansiyele sahip, gelişmekte olan iki alandır. Entegre örnekleme ve iyonizasyon özelliklerine sahip minyatür bir cihaz olan tek prob, hem ortam MSI hem de yerinde SCMS analizi gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Ortam MSI için, tek prob, numunenin MS analizini sürekli olarak yürütmek için yüzey mikro ekstraksiyonunu kullanır ve bu teknik, fare beyni ve böbrek bölümleri gibi biyolojik numunelerden yüksek uzamsal çözünürlüğe (8,5 μm) sahip MS görüntülerinin oluşturulmasına izin verir. Ambient MSI, analizden önce çok az numune hazırlığına ihtiyaç duyulması veya hiç numune hazırlanmasına ihtiyaç duyulmaması avantajına sahiptir, bu da veri toplamada mevcut olan potansiyel artefaktların miktarını azaltır ve elde edilecek numunenin daha temsili bir analizine olanak tanır. In-situ SCMS için, tek prob ucu, küçük örnekleme ucu boyutu (< 10 μm) nedeniyle HeLa hücreleri gibi canlı ökaryotik hücrelere doğrudan yerleştirilebilir ve bu teknik, tek tek hücrelerin içindeki çok çeşitli metabolitleri neredeyse gerçek zamanlı olarak tespit edebilir. SCMS, tek hücre düzeyinde elde edilecek kimyasal bilginin daha fazla hassasiyetini ve doğruluğunu sağlar, bu da biyolojik süreçler hakkındaki anlayışımızı daha önce mümkün olandan daha temel bir düzeyde geliştirebilir. Tek problu cihaz, çok çeşitli MSI ve SCMS çalışmaları için potansiyel olarak çeşitli kütle spektrometreleri ile birleştirilebilir.

Giriş

Kütle spektrometresi görüntüleme (MSI), ilgilenilen bileşiklerin yüzeyler üzerindeki uzamsal dağılımını sağlamak için nispeten yeni bir moleküler görüntüleme tekniğidir. MSI analizi sırasında, kütle spektrometresi (MS) ölçümleri, ilgilenilen türün 2D görüntüsünü oluşturmak için yüzey boyunca tek bir piksel bazında kaydedilir ¹. MSI teknikleri, çok çeşitli metabolitler için uzamsal olarak çözülmüş bir özellik dağılımı sağlama yeteneğine sahiptir, bu da bir numuneden geleneksel moleküler görüntüleme tekniklerinin kullanılmasından çok daha fazla miktarda bilgi elde edilmesine olanak tanır ve biyolojik ve farmakolojik çalışmalar için biyolojik numunelerin analizini büyük ölçüde iyileştirme potansiyeline sahiptir ². MSI, genel olarak ortam dışı ve ortam yaklaşımları olarak ikiye ayrılabilir. Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI) MS ³ ve uçuş süresi ikincil iyon MS (ToF SIMS) ⁴ gibi ortam dışı MSI analiz teknikleri, yüksek uzamsal çözünürlük (sırasıyla yaklaşık 5 μm ve 100 nm) ve yüksek hassasiyet yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, bu yöntemler, matris moleküllerinin numune yüzeyine uygulanması ve elde edilen verilere artefaktlar getirebilecek bir vakumlu numune alma ortamı gibi kapsamlı numune hazırlama gerektirir. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu (DESI) MS ⁵, lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyonu (LAESI) MS ⁶ ve nano-DESI MS ⁷ gibi ortam teknikleri, ortam ortamında çok az veya hiç ön hazırlık yapılmadan numunelerin MSI'sini yapabilir, bu da numuneyi en doğal haliyle potansiyel olarak yansıtan MS görüntüleri üretebilir. Bununla birlikte, bu tekniklerin çoğu, ortam dışı tekniklere kıyasla genellikle yüksek uzamsal çözünürlük ve algılama hassasiyetinden yoksundur ve deneyler tipik olarak piksel başına yaklaşık 150 μm'de gerçekleştirilir ⁸.

Tek hücre analizi (SCA), biyolojik örneklerin kimyasal bileşimini hücresel düzeyde karakterize etme yeteneğine sahip büyüyen bir alandır. SCA, biyolojik sistemlerin, bir hücre popülasyonunun ortalama sonucunu üreten geleneksel hücre analiz tekniklerinden daha temel bir düzeyde analiz edilmesini sağlar ve potansiyel olarak daha önce inatçı olan içgörüler sağlar ⁹. MS teknikleri son zamanlarda SCA'ya (tek hücreli kütle spektrometresi veya SCMS olarak adlandırılır) MALDI MS ¹⁰ ve ToF SIMS ¹¹ gibi hücrelerin analizden önce ön işleme tabi tutulduğu ortam dışı teknikler kullanılarak ve LAESI MS ¹² gibi ortam teknikleri ve canlı tek hücreli video-MS ^{13, 14} gibi doğrudan ekstraksiyon yöntemleri kullanılarak uygulanmıştıryumurta, bitki ve kanser gibi çok çeşitli hücre tiplerini analiz etmek için. Ortam teknikleri, canlı hücrelere uygulanma avantajına sahiptir, bu da artefaktları en aza indirir ve canlı hücrelerdeki metabolitlerin daha iyi temsil edilmesine yol açar. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan doğrudan ekstraksiyona dayalı yöntemler, numune ekstraksiyonu ve analiz sürecini iki farklı adımda gerçekleştirir, bu da analiz sırasında numune içinde bulunan metabolitleri potansiyel olarak değiştirebilecek bir zaman aralığı ile sonuçlanır.

Tek prob, biyolojik doku bölümleri ¹⁵ üzerinde yüksek uzamsal çözünürlüklü ortam MSI ve canlı tek hücreler ¹⁶ üzerinde neredeyse gerçek zamanlı yerinde SCMS gerçekleştirebilen minyatür çok işlevli bir cihaz. Tek prob, bir solvent sağlayan giriş ve erimiş silika kılcal damarlardan yapılmış bir nano-ESI yayıcı ile birleştirilmiş çekilmiş çift delikli bir kuvars kılcal damardan oluşan entegre bir yapıya sahiptir ve solvent dağıtımının ve analit ekstraksiyonunun tek bir cihazdan gerçekleştirilmesini sağlar. Ortam MSI modunda, tek prob numune dokusunun üzerine yerleştirilir ve yüzey mikro ekstraksiyonu gerçekleşir, bu da yüksek uzamsal çözünürlükte rasterleştirilmiş bir MS görüntüsünün yapılmasına izin verir. Özellikle, tek probun konik ucu, yerinde SCMS analizi için canlı ökaryotik hücrelere yerleştirilecek kadar küçüktür, burada metabolit tespiti, prob yerleştirme ile MS tespiti arasında iki saniyeden daha az sürer ve kimyasal bilgilerin neredeyse gerçek zamanlı olarak alınmasına olanak tanır. Tek problu cihazı imal etmek ve tek problu MS tekniklerini kullanarak hem ortam MSI hem de SCMS modlarını yürütmek için protokoller aşağıda verilmiştir.

Protokol

Hayvan kullanımı ve refah Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokoller aşağıdaki Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu'na uygun olmalıdır. Fare doku örnekleri ortak çalışan Dr. Chuanbin Mao tarafından temin edildi.

1. Fare Doku Bölüm Hazırlık

1. De küçük plastik merkezine çıkar (beyin, böbrek, karaciğer, vb) bir bütün fare organı (örneğin, 12-iyi hücre kültür plakası) yerleştirin ve yaklaşık 10 mm yükseklikte bileşiği kadar gömme dokuda daldırın. Doku gömme bileşikte ve organ istenen yönde (yani, sagital, koronal, vs.) yerleştirildiğinden emin oluşan hiçbir kabarcık olmadığından emin olun.
2. Hemen flaş dondurma sıvı azot içine dokuları yerleştirin. Uzun süreli depolama için, -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş örnekleri saklamak.
3. Donmuş fare organı alın ve bir temperatu içinde ° C -15 çözülmekontrol cryomicrotome yeniden.
4. Doku gömme bileşiğin yaklaşık 500 ul ve bir çelik tabanı üzerine güvenli doku istenen kesit oryantasyon bıçak sunulan böylece montaj kesit bir cryomicrotome üzerine yerleştirin.
5. Bölüm 12 mikron kalınlığında doku. polikarbonat mikroskop lamı üzerine kesitli doku dilimleri yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumaya bırakın. Uzun süreli depolama için, -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş slayt saklayın.

2. Hücre Kültürü

Not: Hücre kültürü, steril koşullar altında, biyolojik güvenlik kabini (Biyolojik Güvenlik Seviye II) 'de yapılmıştır. HeLa hücre hattı, bir model sistem olarak kullanılır, ve hücreler, aşağıdaki klasik protokoller ile tam kültür ortamı içinde kültürlenmiştir:

1. Sıcak reaktifler (örneğin, tripsin, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), ve hücre kültür ortamı), 37 ° C arasındadır.
   Not: hücre kültür ortamı inorganik sa içeriyorLTS, amino asitler, vitaminler, ve diğerleri. bileşenlerin tam listesi için, üreticiden formülasyona bakın.
2. Hücre örneği (örneğin, 1 mi HeLa hücre süspansiyonu) elde edilir ve standart bir 10-cm hücre kültürü plakası tam hücre kültür ortamında 9 ml ekleyin. Başlangıç ​​hücre sayısı yaklaşık 0,5 x 10 ⁶ hücre / ml 'dir. Artan yüzey hücre kültür plakası üzerinde% 70-80 olarak kaplanana kadar 2-3 gün boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de kültür içinde hücreleri tutun. Birbirini izleyen her tur için rekor hücre pasaj sayısı.
3. Hücre kültürü plakası hücre pasajlanmasını (yani, hücre bölünmesi) gerçekleştirin.
   1. Aspire büyüme ortamı ve hücreleri durulama 1x PBS 5 ml kullanın. steril aspirasyon ucunu kullanarak PBS çıkarın ve kültür plakasından hücreleri ayırmak için 37 ° C'de ~ 5 dakika boyunca tripsin (% 0.25) 2.5 ml hücreleri inkübe edin.
      Not: Gerçek tripsin tedavi süresi belirli tripsin süreden göre optimize edilmesi gerekirct üreticisinden satın aldı. Aşırı tedavisi hücre ölümüne sebep olur ise yetersiz tedavi süresi, plakaya bağlı hücreler bırakır.
   2. 7.5 ml tam hücre kültür ortamı eklenerek tripsin aktivitesi durdurun ve muntazam hücreleri (toplam hacim 10 mi) yeniden süspanse edin. SCMS örneklerinde (adım 2.4) kültür (adım 2.2) veya hazırlanması için hücre süspansiyonu kullanın.
4. SCMS deneyler için hücre örnekleri hazırlayın.
   1. 12 oyuklu bir plaka içerisinde, bireysel mikro kapak slaytlar yerleştirin ve 1.8 ml hücre kültür ortamına ilave ve de hücre süspansiyonu, 0.2 mi.
   2. Yavaşça plaka hafif bir sallama ile hücrelerin karışımı, 24 saat ~ 37 ° C'de,% 5 _CO2 ortamında inkübe edin. Kültürlenmiş hücrelere ilaç tedavisini gerçekleştirmek için, 12-iyi hücre kültür plakasına (DMSO içinde, örneğin (dimetil sülfoksit)), bir ilaç bileşiği çözeltisi ilave edilir.
      Not: nihai ilaç konsantrasyonu (örneğin, 10 nM, 100 nM, 1 uM ve 10 uM) ve treatment zaman (örneğin, 4 saat) çalışmaların belirli bir amaç doğrultusunda çeşitlidir. Hücreler mikro kapak slaytlar bağlı ve ÇKYS deneyleri (adım 6) için hazırdır.

3. Tek-prob Fabrikasyon

1. Bir lazer mikropipet çektirmenin içine çift delik kuvars tüp (iç çapı (ID) 127 mikron dış çap (OD) 500 mikron) yerleştirin ve bir çift delik kuvars iğneyi çekin. (Tüm birimler üreticinin birimleridir) Heat = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150 ve Pul = 250: başlangıç ​​noktaları olarak aşağıdaki parametreleri kullanın. çekti çift delik kuvars iğne sağlamak optimum prob özellikleri için bir konik uca sahiptir. ~ Diğer ucunda terk unpulled çift lümenli kuvars kılcal 5 mm uzunluğunda olacak şekilde çekilir ucu kesilir.
   Not: Lazer çektirmenin gerçek parametreleri aygıtının özel koşullara göre optimize edilmelidir.
2. erimiş silis kılcal bir ~ 80 mm bölümünü kesmek (ID 40 mikron, OD. çözücü olarak 105 mikron) kılcal sağlayan ve çift delik kuvars iğnenin düz ucunda bir delik içine yerleştirin.
3. erimiş silis kılcal (ID 40 mikron, OD 105 mikron) bir ~ 40 mm bölümü kesin ve orta noktasından poliimid kaplama ~ 5 mm tıraş için bir jilet kullanın. hızlı ısı ve ince konik bir nano-elektrosprey iyonizasyon (ESI) yayıcı içine erimiş kılcal çekmek için bir propan alevi kullanın. Bir nano-ESI yayıcısı (~ 7-10 mm uzunluğunda) Kes ve çift delik kuvars iğnenin düz sonunda diğer deliğin içine yerleştirin. Seçenek olarak ise, ince bir konik üretilmesi için, lazer çektirme kullanın.
4. Çift delik kuvars iğnenin düz ucuna (~ 1-2 ul) UV reçine az miktarda uygulayın ve kılcal ve nano çözücü güvenli ~ 20 sn LED UV lamba kullanılarak sağlayan reçine katılaşmaya ESI yayıcı. Tek prob içine tek tek parçaları birleştirmek için prosedürler Şekil 1a gösterilmiştir.
5. Standart bir mikroskop gl Cuteşek slayt uzunlamasına ortadan ikiye (1 "x 3"). Nano-ESI yayıcı dışarı doğru sivri şekilde cam slayt bir ucuna tek sonda yerleştirin. Bu cam slayt (Şekil 1b) üzerine sabitlenmiş olur, böylece tek sonda gövdesinin düzenli epoksi uygulanır. sertleştirme için bir gece bekletin. Çift Şekil 1d 'de gösterildiği gibi bir kütle spektrometresi bağlı tümleşik tek prob ayarları (Şekil 1c) ile imal tek prob.

4. Entegre Tek prob MS Kur oluşturun

1. Kütle spektrometresi iyon kaynağı arayüzü flanş değiştirmek ve dijital stereoskop (ayarlanabilir pozisyon ve yüksekliğe sahip) standı imal (Şekil 1e ve 1f).
   1. bir alüminyum optik kurulu eki için izin veren iki delikli bir iyon kaynağı arayüzü flanş delin. slayt demiryolu cihazı ve bir yükseklik ayarlama çubuğunu olun (ekliDijital stereoskop sistemi alüminyum optik kurulu (Şekil 1e takılabilir şekilde ince pozisyon ayarı için bir XY)).
2. modifiye dijital stereo mikroskop, bir USB dijital mikroskop, esnek bir kelepçe sahibi ile bir minyatür manuel XYZ çeviri aşamasında, kütle spektrometresi özelleştirilmiş iyon kaynağı arayüzü flanş üzerine monte alüminyum optik kuruluna, Motorlu XYZ çeviri sahne sistemi takın (Şekil 1c ve 1f). Tek prob ile bağlı cam slayt düzeltmek için esnek kelepçe tutucu kullanın.
3. Kütle spektrometresi (Şekil 1 f) tek prob kurulumu takın. kütle spektrometresi girişinde önünde tek prob yayıcı yerleştirmek için esnek kelepçe tutucu ve minyatür XYZ sahne ayarlayın. Tek p yakınlaştırılmış görüntü sağlamak için tek prob tarafında (ayarlanabilir görüş açısı ile) USB dijital mikroskop kullanmakTek prob üzerinde elbise ucu veya nano-ESI yayıcı ve (yüksekliği ayarlanabilir), dijital stereoskop hücreleri ve prob ucunu görmek için.
   Not: İlgili iyon kaynağı flanş kullanarak, bu entegre tek prob sistemi ortam iyonizasyon kaynakları ile donatılmış kütle spektrometre başka türlerine bağlanabilir.

5. Ortam MSI

1. Oda sıcaklığında örneği bölümüne çözülme ve tek prob altında motorize XYZ çeviri sahne sistemi üzerine yerleştirin. kontrol yazılımı koordinatları değiştirerek örnek konumunu ayarlayın.
2. Şırınga kullanılarak uygun bir hızı (örneğin, 0.2 ul / dakika) örnekleme çözücü pompa ve iyonizasyon voltajı (ör 5 kV) uygulamak. Örnekleme çözücünün seçimi esnektir ve yaygın olanları MeOH içerir: su (9: 1) ve asetonitril. Nano-ESI damlatıcının ölü hacim 3 nl ve prob-taşlama arasındaki zaman ~ olduğu tahmin edilmiştirce temas ve iyon sinyal gözlem genellikle az 1 sn ^15'dir.
   Not: özelleştirilmiş iyon kaynağı arayüzü flanş iyonizasyon voltajı bir timsah klibi ile bir iletken birliğe kütle spektrometresi teslim edilmesini sağlar. iyonlaşma gerilimi daha sonra kılcal ve tek prob kanalları içinde çözücü bir iletken sendika aracılığıyla iletilen ve örneklenmiş analitleri iyonize nano-ESI yayıcı üzerine tatbik edilir. iletken sendika ile timsah klibi bağlarken iyonizasyon voltajı kapalı olduğundan emin olun.
3. sadece numunenin yüzeyi üzerinde dinlenme ve metabolitleri yüzey çıkarma gerçekleştirmek mümkün böylece tek prob yüksekliğini ayarlayın. Dikkatle Z-sahne kaldırın ve ardından tek prob ucu ve doku yüzeyi arasındaki mesafe değişimini izlemek için (tek-sondasının tarafında) USB dijital mikroskop kullanıyoruz. Bu yükseklik ayarı sırasında kütle spektrumunda değişiklikleri izlemek ve asansör durdurmakDoku metabolitlere çözücü kökenli iyon sinyalinin bir değişiklik görülmektedir Z-sahne ing.
4. Adımı yineleyin 5.3 üç kez otomatik yüzey düzleştirme ayarlama için sahne kontrol programı kapsamında üç farklı noktalarını ayarlamak için. birbirinden yaklaşık 10 mm bir mesafede Örnek yüzeyi üzerinde üç noktada tek prob ucu yerleştirin. yukarı basarak ve simgeler aşağı yükseklik ayarı gerçekleştirin ve "Plan yöntemi" altında pozisyona üç puan kilitleyin.
5. Bu programı kullanarak numune içinde ilgi bölüm boyunca rastering diğer parametrelerini ayarlayın. Burada sunulan fare böbrek bölümleri için, 10,0 mm / sn rasterleme hızı ve satırlar arasındaki 20 mikron mesafe kullanın. Motorlu kademeli sistem 0.1 mikron minimum artış hareketi vardır. Tek prob ucu ve doku arasındaki mesafe Aşama 5.3 elde edilir.
6. kütle spektrometresi MS spektrumları otomatik edinimi için bir yöntem ayarlayın. foFare böbrek numune üzerinde r yüksek kütle çözünürlüğü MSI, aşağıdaki parametreleri kullanın: kütle çözünürlüğü 60.000 (m / Δm), ~ 5 kV pozitif mod, 1 MicroScan, 150 msn maksimum enjeksiyon süresi ve AGC üzerinde. MS görüntünün bireysel hat temsil tüm kazanılmış MS spektrumları üretilen görüntüler için piksel boyutları düzgün yayılı belirten, her taramada arasında düzgün zaman aralıkları ile taramalar aynı sayıda vardı.
7. MSI veri toplama başlatın. kütle spektrometresi MS edinme dizisi başlatmak ve daha sonra XYZ kontrol programı için rasterleme dizisini başlatır.
   1. Örneğin, burada kullanılan MS veri toplama programında, "Yeni dizisi" seçeneğini "Dizi kurulumu" gidin X için kullanılan satır sayısı olan X, 01 numaralandırılmış yeni bir dizi için dosyaları bir dizi oluşturmak istenilen MS görüntü alınır ve ardından "Çalıştır dizisi" basın.
   2. yazılım conta üretmek için izin vermek için bir ev yapımı elektronik cihaz kullanınkütle spektrometresi için ct kapatma sinyali veri toplamak için. Devre şeması referans olarak ilave şekil (Şekil S1) gösterilmiştir.
8. Uygun MSI görselleştirme yazılımı kullanarak ham MS dosyaları MS görüntüleri oluşturun. PNNL ¹⁷ at Layı grubu tarafından geliştirilen yazılım paketi kullanarak Örneğin, aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. "Kaşlar Dosya" yı tıklayın. MSI deneyden elde edilen ilk dosyayı seçin. Belirtin nerede altında dosya başlangıç ​​ve bitişini "Hatların sayısı." "Enter MZ Aralığı" altında MS görüntü aralığı için, m / z değerleri bir dizi seçin.
   2. Görüntü oluşturma işlemini başlatmak için "Başlat" düğmesine basın. MS görüntü yapıldıktan sonra bilgisayar görüntüleri depolamak için "Araç Çubuğu" altında "Resmi Kaydet" i tıklayın.

In-situ 6. Canlı SCMS

1. Kurulum kullanabilmesidir göre tek prob sistemiMSI iyonlar. Akış hızı çözücü (örn MeOH / H ₂ O veya asetonitril) ayarlayın (örneğin, ~ 25 nl / dk).
2. kültürel ortam ve hücre dışı ilaç bileşenleri kaldırmak için PBS ile, mikro kapak cam slaytlar bağlı olan kültür hücreleri, yıkayın. deney için motorize XYZ çeviri sahne sistemi üzerine cam slayt içeren hücreyi yerleştirin.
   Alternatif olarak kültürlenmiş hücreler durulama (fetal inek serumu ihtiva eden olmadan) taze bir hücre kültür ortamını kullanmak Not:. Az iyon bastırma gözlenmiştir. Buna ek olarak, hücre, ortam sıcaklığı (~ 20 ° C) bir kültür sıcaklığında (37 ° C) çok daha düşük bir deney sırasında uzun süre hayatta kalabilir. İlaç türü, çözüm konsantrasyonu ve tedavi süresi değişik çalışmalarda farklılık gösterir.
3. Analiz sırasında hücre penetrasyonu izlemek için tek prob ucuna (numune üzerinde) dijital stereo mikroskop odaklanın. s USB dijital mikroskop (kullanınTek prob ide) tek prob üzerindeki nano-ESI yayıcı çalışma koşullarını izlemek için.
4. ilgi hücreyi bulmak için motorize XYZ sahne kontrol programı ve (hücreler üzerinde) dijital stereo mikroskop kullanımı ve hassas numune üzerinde tek prob ucu yerleştirin. Tek prob ucu hücresine sokulur önce MS veri toplama başlatın.
   1. kütle çözünürlüğü 100,000 (m / Δm), ~ 3 kV pozitif ve negatif mod, 1 MicroScan, 150 msn maks enjeksiyon süresi hakkında AGC modu: MS analizi için referans yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanılarak aşağıdaki parametreleri kullanın. MS spektrumları otomatik edinimi, MS veri toplama programında "Başlat" tıklayarak yapılır.
   2. hücre zarı nüfuz ve hücreden üretilen MS sinyalini kayıt tutmak için simgesini tıklatarak motorlu Z-sahne kaldırın. 1-2 saniyelik bir zaman gecikmesi genellikle sonda yerleştirilmesi ve MS sinyal tespiti arasında görülmektedir. Diğer teyidi olarakHücre penetrasyon MS sinyallerinin dramatik bir değişim hücre zarının nüfuz tespit edilebilirler. Hücre içi bileşiklerin MS sinyalleri genellikle 15-20 sn önemli ölçüde azalacaktır ~ sürebilir.
   3. hücreden tek prob ucunu çekin plaka içeren hücreye aşağı indirin. Genellikle gürültü seviyesini yaklaşmak hücresel bileşiklerin iyon sinyalleri için <15 sn sürer. ~ 3 dk tamamen tek sondayı temizlemek için çözücü akışını edelim. Bu arada, analiz edilecek bir sonraki hücreyi bulmak için motorize XYZ sahne sistemi yerleştirin. Her bir hücre deneyi ~ 3 dk gerçekleştirilebilir gerektirir.

Sonuçlar

Tek prob başarıyla kesitli fare böbrek dokusunun ¹⁵ ortam MSI analizi için kullanılmıştır. Cihaz MSI sonuçlarında bol iyon sinyalleri şiddetleri yol açan küçük bir alandan yüksek verimli analit çıkarma sağlayan yüzey sıvı mikro-ekstraksiyon (Şekil 1a), mekanizmasını kullanır. Örneğin, 10'dan fazla ⁷ sinyal yoğunlukları bazı bol metabolitleri (Şekil 2a) için elde edilmiştir. ⁺ (725,5575 m / z) [PC (32: metabolitlerin çok sayıda, bir sfingomyelin sayısı (SM) ve fosfatidilkolin (PC) gibi türler [+ Na SM (1 34)] dahil olmak üzere, bu şekilde tespit edilmiştir: 0) + H] ⁺ (734,5700 m / z) [PC (34: 1) + Na] ⁺ (782,5696 m / z), ve [bilgisayar (38: 5 + Na)] ⁺ (814,5726 m / z). t birleştiğinde Bu bileşikler yüksek kütle çözünürlüğü ve kütle doğrulukla tespit edildioa yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi. Örneğin, kimlik (örn, gözlenen ve teorik değerler arasındaki fark) sonuçları, her metabolit için (Şekil 2b) Burada sunulan en az 4 ppm m / z kütle hassasiyeti elde edilmiştir. Buna ek olarak, ikili MS (örneğin, MS / MS) de ilgi türlerinin daha güvenli tespiti için yapılan analizleri. ¹⁵

Nedeniyle küçük bir alanda etkili sıvı mikro-çıkarma gerçekleştirme yeteneği, tek prob cihaz ortam koşulları ¹⁵ altında yüksek uzaysal çözünürlüğü MSI deneyler gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, fare böbrek bölümlerinin ayrıntılı MS görüntüler seçilen metabolitlerin (Şekil 2c) uzamsal dağılımını gösteren elde edilmiştir. MS görüntünün uzaysal çözünürlüğü TRANSITI sahip yaygın olarak kullanılan metrik ardından 8.5 mikron olduğu belirlendi. MS sinyalin bir% 20-80 yoğunluk değişim içinde belirlenen bir keskin özelliği noktasında ¹⁸ fosfolipid durumunda üzerindeki [PC (38: 5 + Na)] ⁺ fare böbrek _{bölümünde,} iç medulla arasındaki özellik geçiş üzerinde ve dış medulla bir yoğunluk bir değişiklik daha büyük% 20-80 aralığını gösteren, zaman çizelgesi içinde bir tarama döngüsü boyunca gerçekleşir. Numune hareket hızı (10.0 mm / sn) ve MS veri toplama hızı (0.85 sn / spektrum), örnek bir MS mesafe döngüsü (8.5 mikron), yani MSI uzaysal çözünürlüğü tarama hareketli, hesaplanabilir (Şekil dayalı 2d). Bu uzamsal çözünürlük henüz biyolojik örnekler üzerinde yapılan ortam MSI teknikleri için elde edilen en yüksek arasındadır.

SCMS için tek prob bireysel canlı HeLa hücrelerinde ¹⁶ analiz elde etmeyi başardı. Tek prob uç boyutu (tipik olarak Şekil 10'un mikronkadar küçük ure 3a), doğrudan bu çapı ekstre ve MS analizi için, ~ 10 um olan ökaryotik hücrelerin, birçok çeşit eklenecek. Bir hücre içine, tek sonda ucunun sokma işlemi görsel olarak, bir dijital stereo mikroskop kullanılarak izlenebilir (Şekil 3b) ve hücre membran penetrasyonu PBS (ya da taze hücre kültüründen kütle spektrumlarının, hızlı ve önemli bir değişiklik ile teyit edilebilir hücre içi bileşikler (Şekil 3C ve 3D) ortamı). Deneyler, moleküler türlerin daha geniş türleri tespit etmek için, pozitif ve negatif iyon modlarında gerçekleştirilebilir. Adenosin fosfatlar (AMP, ADP ve ATP) Negatif iyon modunda (Şekil 3C ve d) 'de tespit edilmiştir, oysa Örneğin 18 farklı lipid türleri, sfingomyelinleri (SM) ve fosfatidilkolinler (PC) içeren, pozitif mod tespit edilmiştir. Tek prob yerleştirme i arasındaki zaman gecikmesibir hücre ve sinyal algılama nBu hücresel metabolitlerin neredeyse gerçek zamanlı tespitine olanak sağlayan, genellikle iki saniyeden daha kısa olmuştur. SCMS, hücrelerin anti-kanser ilaçları (örneğin, OSW-1, paklitaksel, ve doksorubisin) ^19] ile muamele edilmiş deney uygulanmıştır. Karşılık gelen ilaçların konsantrasyonlarda (yani, 10 nM, 100 nM, 1 uM ve 10 uM), DMSO (dimetil sülfoksit), muamele edilmemiş hücreler kullanılarak (DMSO yalnızca ilave bir dizi 4 saatlik tedaviden sonra HeLa hücreleri içinde tespit edilebilir ) kontrol olarak. İlaçların MS sinyalleri hücre PBS ya da kontrol (Şekil 3e) içinde mevcut değildi, ama tek prob MS tekniği (sadece 100 nM tedavi sonuçları Şekil 3F'de gösterilmektedir) kullanılarak, tek hücreler içinde tespit edildi. Hücreler, PBS (ya da taze hücre kültür aracı) durulandı için, endojen metabolitlerin (örneğin, hücre lipidler, bir algılama hücre dışı bileşikler ve kirletmesini kaldırmaD adenosin fosfatlar) ve dış bileşikler (örneğin, anti-kanser ilaçları) Bir prob MS tekniği hücre içi bileşikleri analiz etmek için kullanılabileceğini gösterir.

Şekil 1. Fabrikasyon ve ortam MSI ve SCMS analizi için tek prob kurulumu a.) Tek prob Fabrikasyon prosedürleri. B) cam slayt. C) tek Fotoğraf bağlı bir fabrikasyon tek prob Fotoğraf bir kütle spektrometresi. d bağlı prob kurulumu) bir kütle spektrometresi ile birleştiğinde tek prob kurulum şeması. bir deney sırasında, örnekleme çözücü sürekli şırınga sağlanır, iyonizasyon voltajı kütle spektrometresi iletken birliğe uygulanır, iki dijital mikroskoplar örnek yerleştirme izlemek için kullanılır, motorize XYZ sahne) özelleştirilmiş dijital stereoskop sistemi. f) Fotoğraf optik kurulu aracılığıyla iyon kaynağı arayüzü flanş bağlanan dijital Stereoskop gösteren fotoğraftır sistemi örnek hareketini kontrol etmek için kullanılır, ve bir kütle spektrometresi analizi. e kullanılmaktadır. için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.

Şekil yüksek uzaysal ve kütle çözünürlüğe sahip bir fare böbrek bölümünün bir ortam MSI çalışma 2. Sonuçlar a.) Tek prob MSI bir temsilci kütle spektrumu. 3.39 x 10 ⁷ (keyfi birimleri) ulaşabilir tespit metabolitlerin maksimum yoğunluk. B) tespit metabolitlerin bir seçimi) kitlesel doğruluğu. C sunulanMS görüntüleri [PC (32: 0) + H] ⁺ ve [PC (34: 1) + Na] ⁺ 8,5 mikron mekansal çözünürlükte bir fare böbrek bölümünden alınan. PC: fosfatidilkolin. Ölçek çubuğu: 2 mm; 0.20 mm (ilave) d) uzaysal MS görüntünün çözünürlüğü belirlenmesi. [PC (38: 5) + Na] ⁺ (referans 15 izni ile uyarlanmıştır). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil yüksek kütle çözünürlüğü ile ilaç tedavisi HeLa hücrelerinin bir ortam SCMS analizinden 3. Bulgular a.) Zoomed-çapı <10 mikron tipik bir boyutu gösteren tek prob ucunun fotoğrafının. B) Fotoğraf noktasında alınan bir HeLa hücre içine tek prob yerleştirilmesi. Ölçek çubuğu: 50 mikron.c) PC (fosfatidilkolin) türleri. d) HeLa hücrelerinde pozitif ve negatif iyon modlarında. EF) uygulamaları için kütle spektrumlarının SCMS analizi ile tespit edilen metabolitlerin temsili bir listesini bir dizi kimlik bilgileri ile tipik bir pozitif iyon modu kütle spektrumu kontrolü ve tedavi (100 nM OSW-1) hücreleri (referans 16 izni ile uyarlanmıştır). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil S1. Kütle spektrometresi veri toplamak için kontak kapatma sinyali üretmek için kullanılan elektronik cihazın devre şeması. Görüntülemek veya bu rakamı indirmek için tıklayınız.

Tartışma

Tek prob hem MSI ve SCMS deneyleri için kullanılabilecek bir çok fonksiyonlu bir aygıttır. (Çeviri sahne sistemleri, mikroskoplar, iyon kaynağı arayüzü flanş, vb dahil) tek prob kurulumu esnek mevcut kütle spektrometresi adapte edilebilir bir eklenti bileşeni olarak tasarlanmıştır. Tek prob kurulumu ve geleneksel ESI iyon kaynağı arasında hızlı bir değişim bir dakika içinde yapılabilir. Prensip olarak, uygun bir iyon kaynağı arayüzü flanşı kullanılarak tek prob kurulumu başka bir kitle spektrometreleri uyarlanabilir. Buna ek olarak, çok çeşitli reaktif maddeler ihtiva eden numune çözücünün büyük biyomoleküllerin geniş aralıklarının tespiti artırır reaktif MSI ve SCMS deneyleri için tek prob kurulumu ile kullanılabilir. hayvan doku ve hücre hatlarına ek olarak, tek-prob ayrıca bitkiler gibi diğer biyolojik sistemleri analiz edebilir. Bu nedenle, aynı deney düzeneği ilebenzer kullanıcı eğitimi, çeşitli çalışmalarda, tek bir alet kullanılarak yapılabilir ve aynı kullanıcılar tarafından, asgari eğitim süresi ve enstrümantasyon maliyeti ile gerçekleştirilebilir verimli ve çok yönlü deneyler için izin.

Tek prob MS tekniği temel bileşeni sonda kendisidir. Tek prob kalitesini büyük ölçüde hem MSI ve SCMS deneyler kalitesini belirler performansı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Tek problar üretim esnasında, çift delik boru içindeki kılcal damarlar güvenli deneyler sırasında çözücü sızıntı olasılığını ortadan kaldırmak için yapıştırılmış olduğundan emin olun. Menfezler ve kılcal prob imalat sırasında tıkalı değildir, öyle ki, UV sertleştirilebilir epoksi az miktarda kullanımı için çok önemlidir.

Tek prob biyolojik numuneler ¹⁵ yüksek uzaysal ve kütle çözünürlüğü ortam MSI yapmak için kullanılır olmuştur. Ortam MSI en büyük avantajı üzerindeolmayan ortam yöntemleri numune hazırlama örneği yakın bir Yerli durumda ⁸ analiz edilebilir bir vakum numune çevre için ihtiyacı olan minimum tutulur olmasıdır. Diğer birçok ortam MSI tekniği önemli engellerden biri mekansal çözünürlükte ¹ eksikliği olmuştur. tabanlı desorpsiyon ile karşılaştırıldığında MSI, tek prob küçük uç boyutu daha güçlü ve verimli bir yüzey sıvı mikro-ekstraksiyon yüksek uzaysal çözünürlüğü yol açan küçük bir alanın üzerinde gerçekleştirilmesini sağlayan (örneğin Desi ve LAESI gibi) teknikleri ortam MSI teknikleri ¹⁵ kullanılarak elde edilen en yüksek olanlar arasında 8.5 um. Buna ek olarak, örnekleme çözücü bileşenlerini ayarlama deneyler için ekstra esneklik sağlar. Örneğin, reaktif (örn dicationic bileşikleri) ihtiva eden çözücü numune alma metabolitleri PE sayısında önemli bir artış sağlayan reaktif MSI deneyler için kullanılmıştırr deneyi ^20. Tek prob diğer avantajı tüm veri toplama sürecinde çalışma kolaylığı sağlar entegre tasarım vardır. ucu ve doku yüzeyi arasındaki mesafe iyon sinyal yoğunluğu ve istikrar, düz doku bölümü alınması ve mesafe varyansını en aza indirmek için ayarlama düzleştirme yüzey yürütülmesi için çok hassas olduğundan yüksek kaliteli MSI deneyler için bir anahtardır. Tek-prob MSI teknikleri pürüzlü yüzeylerde yüksek uzaysal MS görüntüler elde etmek için uygun olmadığını izler.

Yüksek kaliteli bir sondasının imal ek olarak, dikkatli bir şekilde aleti ayarlama başarılı MSI deney için gereklidir. Tüm ayar adımlar arasında, doku bölümü yüzeyi üzerinde tek prob ucunun yüksekliğini ayarlamak en kritik biridir. Prob yüksekliğini ayarlarken, numune çözücü pompalamak ve sadece çözücü arka plan iyonu sinyalleri Observ olabilir, böylece, iyonlaşma gerilimine çevirmekEd. dikkatlice doku bölümünde güçlü ve istikrarlı bir iyon sinyalleri görülebilir kadar motorlu Z-sahne kaldırarak prob yüzeyi mesafeyi azaltırken daha sonra kütle spektrumu değişikliği izlemek; Bu sonda yüksekliği deney sırasında MSI veri toplama için kullanılacaktır. Buna ek olarak, optimize edilmiş bir solvent akış hızı MSI deneyleri için gereklidir. Optimize edilmiş prob yüksekliği ile akış hızını ayarlayın. Doku yüzeyine hiçbir çözücü yayılmış olduğundan emin olun (yani, akış hızı çok yüksek) veya nano-ESI yayıcı (yani, hızı çok düşük akış) içindeki kabarcık oluşumu.

Tek prob biyo analizler için çok fonksiyonlu bir cihazdır. MSI deneylerinde ek olarak, bu SCMS diğer vakum ile karşılaştırıldığında önemli bir avantaj, canlı ökaryotik hücreler ¹⁶ detaylı kimyasal bilgiler, aydınlatmak için in-situ gerçeğe yakın zamanlı yapma yeteneğine sahip olacak şekilde MALDI ¹⁰ ve Sims şekilde göre SCMS teknikleri ( ²¹ ). Sonda ucunun küçük boyutlu yeteneği canlı bir ökaryotik hücre içine sokulabilir ve ayıklamak ve anında MS analizi için hücre içi bileşikler iyonize içerir. Benzer bir şekilde, reaktifler (örneğin, dicationic bileşikleri) ihtiva eden numune çözücüler SCMS deneylerinde kullanılabilir ve hücresel bileşenler geniş bir aralık her zamankinden daha canlı bir tek hücre içinde tespit edilebilir (devam eden bir araştırma, verilerin gösterilmemiştir). gerçek zamanlı analiz sonucu membran ve hücresel içeriği çıkarıldığı hücre penetrasyonu canlı tek hücre kimyasal profilleri, sağlayacak olsa da, soruşturma kapsamında hücre tek prob SCMS tekniği hala ima, deney sonra öldürüldü olacak yıkıcı bir metot. Buna ek olarak, tek prob prob ucu ve nano-ESI yayıcı kolayca deneyimsiz kullanıcılar için tıkanmış olabilir. Cihaz tıkanma olasılığını azaltmak için, bir cel içine tek prob ucu takarken çekirdeğini dokunmamak sağlamakl. Tıkanma meydana gelirse, cihaz tıkanmış prob ucu veya bir homebuilt ısıtma bobini ¹⁶ ile yayıcı nano-ESI ısınma ile rejenere edilebilir. Tek prob SCMS tekniğin başka bir sınırlama sadece yapıştırıcı hücreleri (yani, hücreler yüzeylere tutturulur) geçerli kurulumu kullanarak analiz edilebilir olmasıdır. Bununla birlikte, tek prob MS aparatına hücre manipülasyonu sistemi içeren, hücre geniş türleri gelecek incelenebilir.

Yüksek kaliteli bir sonda ve optimize edilmiş bir solvent akış hızını elde etmek MSI deneye benzer SCMS çalışmaları için önemlidir. Solvent akış hızı ayarlama yaparken, tek prob ucu (yani, hücre ya da kültür ortamı ile hiç temas) numunenin üzerine yerleştirilen ve nano-ESI içinde prob ucu veya kabarcık oluşumu hiçbir çözücü damlama olduğundan emin olun olduğunu yayıcı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tek problu fabrikasyon
Çift delikli kuvars boru, 1.120' ’ &zamanlar; 0,005 inç &zamanlar; 12 inç	Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ	MBT-005-020-2Q
Mikropipet lazer çektirme	Sutter Enstrüman A.Ş., Novato, CA	Model P-2000
Sigortalı silika kılcal, ID: 40  &mikro; m, OD: 110  &mikro; m	Molex, Lisle, IL	TSP040105
UV kürleme reçinesi	Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, ABD	Ürün No. 006.030
LED UV lambası	Foshan Liang Ya Diş Ekipmanları, Guangdong, Çin	LY-C240
Epoksi reçine	Devcon, Danvers, MA	Parça No. 20945
Inline MicroFilter	IDEX Sağlık & Bilim LLC, Göl Ormanı, IL	M-520
Microunion	IDEX Sağlık & Science LLC, Lake Forest, IL	M-539
Mikroskop lamı (cam)	C & Bilimsel - Prömiyer, Manassas, VA	9105
Şırınga	Hamilton, Reno, NV	1725LTN 250UL
Kütle spektrometresi
LTQ Orbitrap Kütle spreksenometresi	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	LTQ Orbitrap XL
Xcalibur 2.1 Yazılımı	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA
Fance Sahne Kontrolü	Pasifik Kuzeybatı Ulusal Laboratuvarı, Richland, WA
MSI Hızlı Görünüm	Pasifik Kuzeybatı Ulusal Laboratuvarı, Richland, WA
Kontak kapatma cihazı
USB-6009 Çok İşlevli DAQ	Ulusal Aletleri, Austin, TX	779026-01
DR-5V SDS Röle	Panasonic, Kadoma, Japonya	DR-SDS-5
Mantık Kapıları 50 Ohm Hat Sürücüsü	Texas Instruments, Dallas, TX	SN74128N
Tek problu kurulum
Motorlu lineer kademe ve kontrolör (3 set)	Newport, Irvine, CA	Conex-MFACC
Minyatür XYZ aşaması	Newport, Irvine, CA	MT-XYZ
Çeviri XY aşaması	ThorLab, Newton, NJ	PT1 ve PT102
Thermo LTQ XL iyon kaynağı arayüz flanşı	Yeni Amaç, Woburn, MA	PV5500
Dijital stereo mikroskop, 250X - 2.000X	Shenzhen D& F Co., Shenzhen, Çin	Supereyes T004
USB Dijital Fotoğraf Mikroskobu	DX.com, HongKong, Çin	S02 25 ~ 500X & nbsp;
Şırınga pompası	Chemyx Inc., Stafford, TX	Nexus 3000
Katı Alüminyum Optik Breadboard, 8" x 8" x 1/2"	Thorlabs, Newton, NJ	MB810
Esnek kelepçe tutucu	Siskiyou, Grants Pass, VEYA	MXB-3h
Solvents
Methol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	34860 Chromasolv
Su	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	W4502
Asetonitril	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	34967 Chromasolv
Hücre kültürü
>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)	Cellgro, Manasas, VA	10-013-CV
10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS)	Gibco/Life Technologies, Long Island, NY	10100-139
Penisilin/Streptomisin	Cellgro, Manasas, VA	30-002-CI
10 mM HEPES (pH 7.4)	Cellgro, Manasas, VA	25-060-CI
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Cellgro, Manasas, VA	46-013-CM
TripLE Ekspres	Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA	12604-013
12 oyuklu plakalar	Corning Inc., Corning, NY	Falcon 351143
T25 şişesi	Corning Inc., Corning, NY	Falcon 3055
Mikro Kapaklı Gözlükler, Yuvarlak, No. 1	VWR International, Radnor, PA	48380-046
DMSO (Dimetil Sülfoksit)	VWR Uluslararası, Radnor, PA	BDH1115-1LP
Doku görüntüleme
Cyro-Cut Microtome	American Optical Coporation
Tissue-Tek, Optimum kesme sıcaklığı (OCT)	Sakura Finetek Inc., Torrance, CA	4583
Mikroskop lam (polikarbonat)	Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL	P11011P