Yöntem makalesi

Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

DOI:

10.3791/53917

⸱

19 Nisan 2016

 , 
1Department of Cellular & Molecular Physiology, Yale University, 2Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organa özgü duyusal nöronların tanımlanması zordur. Hızlı Mavi izleme, hücre sıralaması için hava yollarını innerve eden nodoz nöronlarını tanımlamak için kullanılır. Sıralanmış nodoz nöronları, dizileme için yüksek kaliteli ribonükleik asidi (RNA) çıkarmak için kullanılır. Bu protokol kullanılarak, hava yoluna özgü nöronların gen ekspresyonu belirlenir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent nöronların hücre gövdeleri duyusal ganglionlar içinde yer almaktadır. Duyu ganglion vücudun belirli bir organ veya bir kısmını innerve. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve vücutta ve bacaklarda boyunca süreçleri uzatmak. trigeminal ganglion kafatası bulunan ve yüz innerve ve üst solunum yolları vardır. boğumlu ganglionlar vagal afferentler bağırsak, kalp, akciğerler ve boyunca uzanır. solunum hızı, solunum yolu tahrişi ve öksürük reflekslerinin: boğumlu nöronlar gibi fonksiyonların çeşitli bir dizi kontrol eder. Bu durumda, anlaşılması ve işlevini değiştirmek için, hava yolu spesifik nöronal alt popülasyonlarının belirlenmesi ve izole edilmesi için çok önemlidir. Fare, hava yolları havayolu özgü boğumlu nöronun retrograd takibi için bir floresan tracer boya, Hızlı Mavi, maruzs. nodoz gangliyon parçalanır ve flöresanla aktive edilen hücre (FAC) ayırma boyası pozitif hücrelerin toplanması için kullanılır. Daha sonra, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) yeni nesil dizileme için boya pozitif hücreler elde edilir. spesifik nöronal gen ifadesi belirlenir bu yöntem havayolunu kullanarak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent sinirlerin hücre gövdeleri arka kök, trigeminal veya nodoz gangliyon olarak, duyusal ganglia yer almaktadır. Her duyu ganglion vücudun belirli bölgeleri innervates ve o bölgedeki ayrı organ ve dokuları innerve hücreler içerir. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve trigeminal ganglion kafatası yer alırken hava yolları 1 üst yüz, gözler, meninksler veya innerve nöron içeren, gövde ve uzuvların boyunca süreçleri uzatmak, 2. Vagus sinirinin boğumlu ganglion alt solunum yolları ve akciğerleri 3 kafatası altındaki boyunda bulunan ve gastrointestinal sistem, kalp boyunca sinir liflerini uzatmak hücre gövdeleri içerir ve. İnsanlarda boğumlu ganglion, ancak fare birleştirildiği, tek başına duruyorAyrıca akciğerleri 4 innervates juguler gangliyon ile. Bu erimiş ganglion genellikle / juguler boğumlu karmaşık, vagus ganglion denilen, ya da sadece boğumlu ganglion 5 edilir. Burada, boğumlu gangliyon olarak adlandırılır.

boğumlu afferent lifler beyin sapındaki yalnız yolu (NTS) çekirdeğine iç organlardan gelen bilgi aktarmak. Bu eşsiz ganglion duyusal girdi böyle gut hareketindeki 6, kalp hızı 7, solunum 8,9 ve tahriş aktive solunum tepkiler 10,11 gibi işlevleri, çeşitli bir dizi kontrol eder. fonksiyonları ve innerve organların bu çeşitliliği sayesinde, hedef ve bireysel nöronal yolları araştırmak için boğumlu ganglion organ spesifik alt popülasyonlar ayırmak için kritik öneme sahiptir. Ancak, boğumlu küçük boyutu ve bu önemsiz bir görev değildir içeren nöronların sınırlı sayıda verilen. Ganglion nodoz Her fare yaklaşık 5.000 nöronlar 12 içerirUydu hücreleri destekleyici geniş bir nüfusa ek olarak. % 5 innervate solunum yollarında - 5000 boğumlu nöronlar, sadece 3. Dolayısıyla, solunum uyarılması veya patolojilere havayolu-innerve nöronların içinde herhangi bir fonksiyonel morfolojik veya moleküler değişiklikler, yoğun dolu boğumlu ganglion kaybolur.

Bu sorunu çözmek için, bir yöntem belirlemek ve hava yollarını innerve nöronlar izole etmek için geliştirilmiştir. üst solunum yolları takip eden innerve nodoz nöronların tespit etmek, bir floresanlı işaretleyici boya maruz bırakılmıştır. Hızlı Mavi nöronlar tarafından yakalandı ve en fazla sekiz hafta 13 korunur hücre gövdeleri hızla yolculuk oldu - 15. Bir kez nazik, henüz etkili, ayrışma protokol floresan aktif hücre (FAC) sıralamak için boya etiketleme ve hücre canlılığını korumak için kullanılan belirlendi. Kriteri hücrelerinin gen ekspresyonunu veya f belirlemek için, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) elde etmek için kullanılırveya diğer alt moleküler analizi. Bu protokol, ilgi konusu bir dokuda innerve duyusal nöronlar izole etmek için kullanışlı ve güçlü bir teknik sağlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan denekleri Prosedürleri Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Hızlı Mavi 1. Burun İdaresi

Hızlı Blue, en az 2 gün fare ötenazi önce boya yönetmek. boya sekiz hafta boyunca devam edecektir.

  1. yavaş başlar nefes kadar hafif inhalasyon anestezisi (% 2.5 sevofluran) ile fare anestezisi.
  2. Fareyi sağlamak için zaman zaman duraklayarak, yavaş yavaş burun deliğine boya solüsyonu 40 ul (0.4 mM Hızlı Mavi,% 1 dimetil sülfoksit, DMSO, fosfat tamponlu tuz, PBS) aşılamak için filtrelenmiş ipuçları ile 200 ul pipet kullanın çözümü aspire edilir (Şekil 1A).
  3. Dikey fare tuşunu basılı tutun başkanlık ve yavaşça boya akciğerlere yayılır sağlamak için göğüs masaj yapın.

Diseksiyon ve Analiz gününde 2. Hazırlıklar

  1. 10 ml hazırlayın0, tablo 1 'de belirtildiği gibi bileşenleri karıştırarak Ganglion ayrışma çözeltisi (GADS).
  2. özel bir laboratuvar alanında RNA çekimini gerçekleştirebilecek. deney,% 70 etanol,% 10 çamaşır suyu ve RNaz dekontaminasyon reaktifi ile temiz yüzeyler başlamadan önce. Bu RNA santrifüj, herhangi bir tüp rafları ve pipet içermektedir. RNA kullanım için özel filtre ucu kutuları vardır emin olun. Bu örnekler kontamine olarak, DNA hazırlığı için bu ekipmanı ve bölgeyi kullanmayın.
  3. RNaz içermeyen su ile, taze% 70 ve% 80 etanol karıştırın. örnek başına 1 mi, RNA ekstraksiyonu kullanılmak üzere hazırlanır.
Bileşen miktar
Gelişmiş DMEM / F12 9.5 mi
glutamin 100 ul
HEPES (10 mM) 100 ul
N2 takviyesi 100 ul
B27 (vitamin A) 200 ul
NGF (50 ug / ml) 10 ul

Ganglion Ayrılma Çözüm (GADS'nin) Tablo 1. Reaktif Karışımı.

3. Diseksiyon Prosedürü

  1. 500 ul GADS, her bir deney numunesi için bir pozitif ayıklama kontrol için bir ve negatif ayıklama kontrol için bir tane olan 1.5 ml tüpler doldurun. diseksiyon boyunca buz üzerinde saklayın tüpleri.
  2. boğumlu ganglion inceleyin ve ayrışma kolaylaştırmak için iki kısmi kesimler yapmak, daha sonra deneysel örnek tüpüne koyun. Boğumlu ganglionlar 16 ve DRG 17 diseksiyon için aşağıdaki vallahi protokolü bakınız.
  3. sıralama kontrolleri için, incelemek ve kısmen böyle dorsal kök gangliyon (DRG) olarak etiketli olmayan ganliyonunu kesti. Pozitif kontrol ve iki Gangli için iki ganglionlar kullanınNegatif kontrol için, bir.
  4. Başarılı sıralama için yeterli boğumlu nöronlar elde etmek için, bir deney örnek tüpü içeren GADS'yi içine 5 farelerden alınan ganglionlar birleştirir.

4. Duyu Ganglion Ayrılma

  1. tüp içinde ganglionlar bırakarak, 500 ul GADS'yi dışarı pipetle. ganglionlar sonra, tüpün dibine yerleşmek PBS dışarı pipetle için 1 ml PBS ekleyerek bir kez ganglionlar yıkayın, bekleyin.
  2. 1 mi GADS ve sindirim enzimi 22 ul (kolajenaz I / II ve proteaz karışımı, 2.5 mg / ml H2O) için her bir tüp ekleme.
  3. Pozitif kontrol tüpüne 20 ul Hızlı Mavi (5.26 mM) eklenir.
  4. daha önce 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu ya da ısıtma bloğunda tüpleri koyun.
    Not: ganglion sindirim zaman sindirim enzimi yaşına bağlıdır. 6 ay 45 dakika süreyle sindirmek - 2 içinde sindirim enzimi çözülmesi 1 ay içinde, 30 dakika boyunca sindirmek. Enzim 6 aydan eski ise, gangliyon f sindirmekya da 60 dakika.
  5. Her 15 dk sallamak tüpleri kısaca ve ganglionlar sağlamak için onları fiske çözümü ile kaplıdır.
  6. gangliyon dijeste edilir ve bu esnada bir partikül (polivinilpirolidon ile kaplanmış koloidal silis parçacıkları) kullanılarak yoğunluk gradyanları hazırlar.
    1. GADS'de% 12 parçacık çözümü, numune başına 500 ul karıştırın.
    2. GADS'de% 28 parçacık çözümü, numune başına 500 ul karıştırın.
    3. Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde, her bir numune için yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içinde 400 | il% 28 yoğunlukta çözeltisi üzerine 400 ul% 12 yoğunlukta çözeltisi ilave edilir. iki kat karıştırmak için izin vermeyin. İki farklı katmanlar tüp içinde görünür olmalıdır; Diğer daha koyu bir.
  7. ganglion sindirilir edilirken, (sıralama numune başına bir Hızlı pozitif Mavi ve bir Hızlı Mavi negatif tüp) sıralama için yeni 1.5 ml toplama tüpleri etiket. interfer etmeyecek şekilde sıralama tesis gereksinimlerine bağlı olarak, bu tüpler sökülebilir kapaklar olmalıdırhücre sıralayıcı ile e.
  8. Uygun sindirim süresinden sonra, sindirim enzimi ile GADS çıkarın ve 1 ml PBS ile iki kez ganglionlar yıkayın. Her tüpe taze GADS'nin 200 ul ekleyin.
  9. ayrı hücreler kırmak için yukarı ve aşağı birkaç kez 100 ul hacme ayarlanmış 200 ul pipet, ve pipet ganglion kullanın. doku bozulmamış bir parça görülmektedir kadar tekrarlayın. çözeltide kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
  10. 70 mikron hücre süzgecinden ayrışmış hücrelere geçerler.
  11. Sol kalan sokak hücreleri pick up ve hücre süzgecinden ek çözüm geçmek için orijinal ayrışma tüpüne başka bir 100 ul GADS'yi ekleyin. Yeni bir pipet ucu kullanarak, süzgecinden geçirildi ve örgü sarıldı herhangi bir kalan hücre ihtiva eden sıvı toplanması. GADS'de asılı hücrelerin son hacim 300 ul olduğunu.
  12. Dikkatle önce yapılmış yoğunluk gradyanı üstünde hücrelerinin 300 ul katman. kabarcıkları önlemek ve c karıştırmayoğunluklu tabakalar arşın.
  13. RT'de 2,900 x g'de 10 dakika süre ile santrifüjlenir.
  14. Hücreler santrifüj iken aşağıdaki gibi lizis tamponu (deneysel örnek başına 1 mi) karışımı: 10 ul 2-merkaptoetanol (RNA ekstraksiyon kiti), 1 ml tampon RLT bölgesindeki.
    1. Hızlı Mavi pozitif toplama tüpüne 300 ul lizis tamponu ve Hızlı Mavi negatif toplama tüpüne (adım 4.7 etiketli tüpler) 600 ul ekleyin. Bu hacim, tahsil edilmesi beklenen hücre sayısına bağlıdır. 7.000 hücreleri 600 ul için <2.000 hücreleri, 300 ul ekleyin>. Bu anlamlı lizis tamponu sulandırmak değil sıralama kılıf sıvısı sağlayacaktır.
  15. Santrifüj tamamlandıktan sonra, dikkatlice çıkarın ve üst 700 ul katmanı atın. Bu katman, aksi takdirde hücre sıralama engel olacak hücre enkaz çoğunluğunu içerir.
  16. çözümü ve pipet içeren kalan hücreye 700 ul taze GADS'yi eklete yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırın.
  17. pelet hücreleri 2.900 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
  18. Hücreler santrifüj iken, 1 mi GADS 5 ul DNase (10 mg / ml) eklenerek GADS (numune başına 500 ul) sıralama karıştırın.
  19. santrifüj yapıldıktan sonra, dikkatli bir şekilde hücre pelet bırakarak kaldırmak ve supernatant atın.
  20. Yeniden askıya 200 hücre pelletini - yukarı pipetleme ve 200 ul birkaç kez ayarlanmış bir 1000 ul pipet yardımıyla aşağı 300 ul sıralama GADS'yi. buz üzerinde örnekleri koyun. Hücreler artık sıralanması için hazırız.

5. Floresan Aktif Hücre (FAC) Sıralama

Not: Bu bölümde operasyonel FACS sıralayıcı bilgi ya da kalifiye personel yardım gerektirir.

  1. hücre canlılığı test etmek için her bir örnek için 1 ul propidyum iyodür (PI) stok solüsyonu (50 ug / ml) eklenir. 2 tüpler, PI ile diğeri olmadan içine negatif kontrol Böl. PI sadece ölü hücreleri DNA bağlar. Eğerİlk birkaç türlü sonra, PI kullanımı gerekli değildir etiketlemek için hiçbir ölü hücreler vardır.
  2. Ulaştırma hücreleri buz üzerinde örneğin., BD FACS AriaII Diva 8 yazılımını çalıştıran, enstrüman akış sitometri.
  3. Hücre boyutu, bu popülasyonda, değişken olduğu için, ayırma için büyük bir ağızlık (100 um) kullanın. stres hücreleri deneyimi miktarını azaltmak ve hücre canlılığı düşük basınç (20 psi) kullanmak artırmak.
  4. Analiz araziler, gerektiğinde ileri dağılım, yan dağılım (SSC), Hızlı Mavi ve PI, kurmak için FACS sıralayıcı yazılımını kullanın.
  5. hücrelerin yeniden askıya yavaşça sıralayıcı yerleştirmeden önce örnek kısaca vorteks.
  6. Kapı eşiği (Şekil 2A) ayarlamak için, negatif kontrol, hiçbir Hızlı Mavi veya PI ile başlayın. Bu hücre popülasyonunun otofloresan miktarını belirler. İsteğe bağlı: Ölü hücrelerden oluşan bir nüfus var olup olmadığını belirlemek için PI negatif örnek çalıştırın.
  7. (Inc pozitif kontrol örneği sıralamaktazminat parametrelerini ayarlamak için,) Hızlı Blue ile ubated.
  8. kapılar ve parametreler ayarlandıktan sonra, deneysel örnekleri sıralama başlar. Örnekler RNA lizis tampon içeren hazır toplama tüpleri içine sıralanır.
  9. Hücre sıralama tamamlanana kadar buz üzerinde sıralanan örnekler tutun.
  10. Hücreler sıralanır hemen sonra RNA ekstraksiyon adımını başlayın.

6. RNA Ekstraksiyonu

  1. 1 dakika süre ile liziz tamponunda Vortex kriteri hücreler homojenleştirin.
  2. Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme tarafından% 70 etanol ve karışımı 1 hacim ekleyin.
  3. spin kolona numunenin 700 ul kadar aktarın. 8000 x g'de 15 saniye boyunca santrifüj. flow-through atın.
    1. Numunenin toplam hacmi eğirme kolonundan geçirildi kadar tekrar edin.
  4. üreticinin Protoco göre DNaz aşaması da dahil, 350 ul Tampon RW1 ekleyin ve RNA saflaştırma işlemine devamhücreler l.
  5. RNA ekstre edildikten sonra, üreticinin talimatlarına göre bir mikroakışkan elektroforez sistemi kullanılarak RNA kalitesini test.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem kullanılarak, hava yolu innerve nöronlar intranazal Fast Blue (Şekil 1A) aşılamak ile etiketlenir. İki gün sonra, Fast Blue etiketli hücreler nodoz gangliyon (Şekil 1C) görünür. boğumlu ganglionlar toplam nöronal nüfusun% 5'i - Bu hücreler 3 oluşturuyor. Bu amaç için kullanılan diğer retrograd boyalar DII (1,1'-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat) ve Fluorogold bulunmaktadır. nöronlar boğumlu DII etiket...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, vagus sinirinin nodoz ganglionlarda hava yolu innerve nöronların hedeflemek için bir yöntemi anlatmaktadır. Bir kez etiketlenmiş, ganglionlar yavaşça optimum hücre sayıları ve canlılığı korumak için ayrışmış. Bu nöronlar FAC lizis tamponu doğrudan sıralanır ve RNA ayıklanır daha sonra. Bu protokolün önemi, hedef izole ve belirli duyusal hücre popülasyonunun kalitesini korumak için yeteneğidir. Gen ekspresyonu nöronların bu küçük nüfus anlatılan ve organa özel fonksiyonları ve sinir ağları tanımlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH tarafından desteklenen sej için R01HL105635 verin. Yazarlar teknik danışmanlık için Diego V. Bohórquez teşekkür etmek istiyorum. Biz de teknik yardım için R. Ian Cumming teşekkür ve Duke İnsan Aşı Enstitüsü Araştırma Sitometrisi Paylaşımlı Kaynak Tesisi (Durham, NC) flow sitometri gerçekleştirmek. sitometri Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (adet UC6-AI058607) dan yapımı için kısmi destek aldı Duke Bölgesel biyosınırlılık Laboratuarında gerçekleştirilmiştir Akış.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hızlı MaviPolysciences, Inc.17740-2stok 2 mg / ml su
NeuroTrace 530/615 kırmızı Nissle lekesiYaşam TeknolojileriN21482
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (PBS) Ca ve Mg içermeyenGibco14190-144
Gelişmiş DMEM / F12Gibco12634-010
glutamin ( Glutamax)Gibco35050-061
HEPE'lerGibco, 15630-080
N2Gibco17502-048
B27 (A vitamini yok)Gibco, 12587-010
Sinir Büyüme Faktörü (NGF)SigmaN6009stok 50 ve mikro; PBS /% 10 FBS
sindirim enziminde g / ml, Liberaz DH Araştırma SınıfıRoche54010540012.5 mg / ml stok (
Percoll)SigmaP1644-25ML
Isıtma bloğuLabNet
70 & mikro; m hücre süzgeciFalcon352350
Mutlak Etanol (200 kanıt)Fisher ScientificBP2818-500
RNaz içermeyen suFisher ScientificBP2484-100
RNase dekontaminasyon reaktifi, RNase AWAYinvitrogen10328-011
2-merkaptoetanolVWREM-6010
RNA ekstraksiyon kiti, RNeasy Plus Mikro KitQiagen74034
DNase kiti, RNase İçermeyen DNase Seti,Qiagen79254
DNaseSigma, D5025-15KUstok, 0.15 M NaCl
Promidyum İyodürSigmaP4170-10MGstok, 10 ve mikro; PBS
Mikroakışkan elektroforez sisteminde g/ml (TapeStation 2200)Agilent
, , , , , , , , , su partikül çözeltisinde : , , , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
  2. Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21(2013).
  3. Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
  4. Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
  5. Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
  6. Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
  7. Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
  8. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
  9. Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
  10. Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
  11. Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
  12. Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
  13. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
  14. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  15. Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
  16. Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
  17. Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782(2013).
  18. Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
  19. Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
  20. Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
  21. Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
  22. Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
  23. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
  24. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hava Yolu nnerve Eden N ronlarNodoz Ganglion zolasyonuFast Blue zlemeFloresan Aktive H cre Ay klamaGanglion z nmesiYo unluk Gradyanl Santrif jlemeRNA Ekstraksiyon ProtokolMikroak kan ElektroforezVagal Afferent N ronlarPeriferik N robiyoloji

İlgili makaleler