Marjinal-hepatik lökositler, diğer lökosit popülasyonlarına kıyasla benzersiz özellikler ve farklı immünolojik işlevler sergiler. Burada, sıçanların veya farelerin karaciğerinin zorla perfüzyonu yoluyla bu spesifik hepatik hücre popülasyonunun seçici olarak toplanması için bir yöntem tarif ediyoruz. Marjinanjik hepatik lökositler, hepatik ilişkili hastalıklara ve metastazlara duyarlılığı belirlemede kritik görünmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Marginating-hepatik lökosit seçici Hasat
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Marjinatif-hepatik (MH) lökositlerin (karaciğerin sinüzoidlerine yapışan lökositler), diğer bağışıklık kompartmanlarının lökositlerine kıyasla benzersiz bileşim ve özellikler sergilediği gösterilmiştir. Spesifik olarak, kanıtlar, MH-lökosit popülasyonunun belirgin bir pro- ve anti-enflamatuar profilini ve hem farelerde hem de sıçanlarda dolaşımdaki veya splenik immünositlere kıyasla karaciğere özgü NK hücrelerinin (yani çukur hücreleri) daha yüksek sitotoksisitesini göstermektedir. Burada sunulan yöntem, farelerde ve sıçanlarda karaciğerin zorla perfüzyonu ile MH lökositlerinin seçici olarak toplanmasını sağlar. Doku öğütme ve biyolojik bozunma dahil olmak üzere karaciğer-lökositleri çıkarmak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, bu yöntem yalnızca diğer karaciğer bölmelerinden gelen hücreler tarafından kontamine olmayan karaciğer sinüzoidlerinden lökositler verir. Ek olarak, perfüzyon tekniği, MH lökositlerinin bütünlüğünü ve fizyolojik ortamını daha iyi koruyarak, doku işlemeye bilinen fizyolojik tepkileri korur. Dolaşımdaki birçok malign hücre ve enfekte hücre, karaciğer sinüzoidlerinden geçerken, endotel hücreleri ve yerleşik lökositlerle fiziksel olarak etkileşime girerken alıkonulduğundan, benzersiz MH lökosit popülasyonu, anormal dolaşımdaki hücrelere karşı etkileşimde bulunmak, tanımlamak ve tepki vermek için stratejik olarak konumlandırılmıştır. Bu nedenle, MH-lökositlerin seçici olarak toplanması ve çeşitli koşullar altında incelenmesi, özellikle dolaşımdaki anormal hücreler ve karaciğerle ilgili hastalıklar ve kanser metastazları ile ilgili olarak, MH lökositlerinin biyolojik ve klinik önemini anlamamızı ilerletebilir.
Giriş
karaciğer sinüsoidlerinden organizma için önemli çeşitli immün faaliyetleri pek çok lökosit alt tipleri içerir. Örneğin, aynı zamanda çukur hücreleri olarak bilinen hepatik marginating (MH), doğal katil (NK) hücreler, özelliği, morfolojik olarak büyük granüler limfositler (LGLs) ve fonksiyonel olarak kan-kurulmasına karşı hepatik-direnç sağlayan kendiliğinden sitotoksik kapasiteli lökositler gibi kaynaklı tümör metastazları. Burada sunulan yöntemin amacı bu önemli ve eşsiz hücre popülasyonu (ve bağışıklık bölmesi) araştırmak için MH lökositlerin selektif hasat, etkinleştirmek için, ve bu spesifik hücreler üzerinde çeşitli manipülasyonlar etkisini (örn bağışıklık aktivasyon) aydınlatmak etmektir.
Gelişmekte olan bir primer tümör ortadan kaldırmak için bağışıklık yetersizliği rağmen, kanser hastaları ve hayvan modellerinde kanıtlar bağışıklık sistemi tümör hücrelerini, mikro-metastazı ve Throu rezidüel hastalık sirkülasyon kontrol edilebileceğini gösterirgh hücre aracılı immünite (CMI). Bununla birlikte, in vivo özellikleri ve insanlarda in vitro çalışmalar, en otolog tümör hücrelerinin, dolaşımdaki veya dalak lökositleri 1,2 ile sitotoksisiteye karşı olduğunu göstermek hayvanlar, bu arasında açık bir tutarsızlık yoktur. Bu tutarsızlık, bir tat lökosit alt popülasyonuna, yani marginating-hepatik (sinüzoidler) lökosit ve aktive NK hücreleri, yani çukur hücre 3 kendi alt popülasyonunda in vivo varlığı, en azından kısmen, bağlı olabilir. Gerçekten de, laboratuar yayınlanmamış veriler F344 sıçanlarda singeneik dolaşan tümör hücrelerinin ve dalak lökositleri dirençli bulunmuştur (MADB106), MH-NK hücrelerinin 4 çözülmüştür göstermiştir. Bu nedenle, dolaşımdaki lökositlerin iddia edilen "NK dirençli" olarak tümör hücrelerinin MH NK hücreleri tarafından kontrol edilebilir. Dikkate değer olarak, farelerde MH-NK geliştirilmiş etkinliği sadece bağışıklık vivo aşağıdaki belirgindir(poli I kullanılarak, örneğin: Cı veya CpG-C) uyarma 5.
Karaciğer spesifik NK hücrelerinin (MH-NK) endotel hücreleri ve Kupffer hücreleri bağlı kalarak, sinüzoidal lümen içinde yer almaktadır. MH-NK hücreleri, sadece biyolojik olarak aktif madde 7,8 olarak lizozomal enzimler ve perforin ve granzymes gibi asit fosfataz içeren küresel yoğun granüller ve çubuk özlü veziküllerin 6, ile karakterize edilir. NK hücrelerini dolaşımdaki ile karşılaştırıldığında, MH-NK hücreleri granüller ve veziküller 9-11 daha yüksek bir sayı ve boyut sergilerler. NK hücrelerini dolaşım ile karşılaştırıldığında, inflamatuar koşullar altında, MH-NK hücreleri, LFA-1 12 daha yüksek ifadesini gösterir gösterildi. Bu geliştirilmiş ekspresyon MH-NK hücreleri, NK hücreleri 13,14 dolaşımdaki daha bazı tümör hücrelerine karşı daha fazla sitotoksik olan bir mekanizma oluşturabilir. nterestingly, interlökin (IL) -2 ile in vitro inkübasyondan sonra MH-NK hücrelerinin büyütülmüş hale gelir vebunların sayısı ve granül boyutu pro fi lenfokin ile aktive edilen katil (LAK) hücreler, 15 ile uyumlu olan, her biri, artar.
Aktif MH lökositler özel öğütme ve dokunun biyolojik bozunma göre standart karaciğer lökosit hasat yöntemleri ile elde edilemez. Burada tarif edilen Bizim perfüzyon yaklaşım standart yöntemlere göre iki önemli avantaja sahiptir. İlk olarak, perfüzyon yaklaşımı seçici diğer karaciğer bölmeleri diğer lökositler tarafından kirlenmeyi önleyerek, MH lökositleri hasadın. Doku işleme hasar hücreler yaklaşımların ya da morfolojisi değiştirmek ve doku hasarına bağlı, belirgin bağışıklık modüle çeşitli faktörlerin salınımını teşvik aksine İkincisi, daha iyi perfüzyon tekniği, bütünlük, aktivite ve MH lökositlerin fizyolojik ortamını korur aktivite.
karaciğer kanseri metastazı a için önemli bir hedef organdırnd çeşitli enfeksiyonlara 16. MH hücreleri benzersiz özelliklere sergilerler olarak patolojiler açısından çeşitli koşullar altında bu özel nüfus incelemek önemlidir. Örneğin, çeşitli BRM göre sistemik immün aktivasyon dikkat çekicidir (örneğin poli I: C veya CpG-C) lökosit 5 dolaşımdaki daha MH-lökositler fazla aktif olduğu gösterilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Tel-Aviv Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Sıçanlar Protokol
- hazırlıklar
- heparinize PBS (30 birim / ml) çözeltisi hazırlayın fosfat ml'si başına koruyucu serbest heparinin 30 adet ekleyerek, oda sıcaklığında (RT) kullanılmak üzere tuzlu su (PBS) ile 1 x çözeltisi tamponlu. hayvan başına 35 ml hesaplayın.
- Hava kabarcıklarını yok etmek için peristaltik pompa hatları ve kelebek iğne yoluyla heparinize PBS geçirin.
- (Yerçekimi (kuru) ayarında en az 30 dakika süreyle 121 ° C'de otoklav) makas 2 çift, körelmiş kenarlı forseps, 2 hemostat ve diş doku forseps - cerrahi aletler sterilize edin.
- MH-lökositlerin Karaciğer ve Toplama perfüzyon
- % 8 izofluran aşırı dozda ile hayvan Euthanize. Önlem olarak, bir izofluran içeren 50 ml'lik bir tüp yerleştirmekonun göğüs boşluğunu açarak kadar sıçan başının etrafında -soaked ped.
- Solunumun durması üzerine hemen karaciğer ve kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için periton ve göğüs boşlukları açın. Bu süreçte kanama kaçının.
- Özellikle, üst göğüs boşluğu seviyelere içlerinden kesme, kaburga doğru çapraz her iki taraf için zarar iç organlara olmadan alt karın orta hat noktasında kesi, ve ilerleme başlayın.
- yaklaşık dakika içinde, (~ 250 g hayvan 6 mi) mümkün olduğu kadar kan toplamak bir şırınga içine sağ ventrikül.
- perfüzat toplanmasını sağlamak için, kalp mümkün olduğunca yakın bir hemostatla kaudal vena kava kelepçe.
- portal ven ortaya çıkarmak için, deneycinin sağa hayvan dışında bağırsak ve yeri çekin.
- mümkün olduğunca kaudal olarak, portal ven içine peristaltik pompaya bağlı 25 G IV kateter, insert,ancak dalak ven rostralinde.
- Hemostata kaudal vena kava inferior içine 5 ml şırınga bağlı 25 G kelebek iğne,, yerleştirin.
- yaklaşık olarak 3 ml / dakika bir hızda peristaltik pompa açın ve yavaşça şırıngaya kan ile kirlenmiş olan perfüzat ilk ml toplar. perfüzat renk dönüşler (yaklaşık 3-5 ml) soluk kırmızı olana kadar devam edin. Karaciğer rengi açık kahverengi doğru değişiyor dikkat edin.
- peristaltik pompa durmadan 20 mi hasat şırınga ile 5 mi hasat şırınga yerine ve perfüzyon daha yüksek bir hızda (kadar 4 mL / dak) kullanılarak karaciğer perfüzat en az 20 ml toplar. Sürekli toplama şırıngaya perfüzyon akışını izlemek, ve (vena kava duvarları çöken yoluyla iğne tıkayabilir olan) çok güçlü vakum kaçının.
- Karaciğer rengi açık kahverengi döndüğünde perfüzyon sonlandırın.
- lökositler Ekstraksiyon
- 24 400 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj perfüzat ° C.
- süpernatantı aspire
- 10 dakika boyunca 400 x g'de 10 ml PBS, santrifüj ekleyin ve süpernatant aspire. Çalışma hedeflerinize dayalı olarak, olduğu gibi hazırlık kullanın veya ek saflaştırma (örneğin, yoğunluk-gradyan ayırma) yürütmek.
- Spesifik olarak, tabaka, 50 cc'lik bir polipropilen santrifüj tüpüne yoğunluk gradyanlı ayrıştırma kütlesinin 4 ml üzerinde perfüzat 4 mi. Devre dışı ile 30 dakika boyunca, 754 x g'de oda sıcaklığında tüpler dönerler.
- Manuel pipetleme yoğunluk-gradyan ayırma-süpernatant arayüzünde tek çekirdekli katmanları elde PBS içinde yıkayın ve 5 ml'lik bir tüp içine yerleştirin.
2. Fare Protokolü
- hazırlıklar
- Fosfat ml'si başına koruyucu serbest heparinin 30 adet ekleyerek, oda sıcaklığında (RT) kullanılmak üzere, heparinize PBS (30 birim / ml) çözeltisi hazırlayın tuz (PBS) 1 x eriyik tamponlun. hayvan başına 20 ml hesaplayın.
- Hava kabarcıklarını yok etmek için peristaltik pompa hatları ve kelebek iğne yoluyla heparinize PBS geçirin.
- (Yerçekimi (kuru) ayarında en az 30 dakika süreyle 121 ° C'de otoklav) makas 2 çift, körelmiş kenarlı forseps, 2 hemostat ve diş doku forseps - cerrahi aletler sterilize edin.
- MH-lökosit Karaciğer ve Toplama perfüzyon
- % 8 izofluran aşırı dozda ile hayvan Euthanize. Önlem olarak, onun göğüs boşluğunu açarak kadar fare başının etrafında bir izofluran batırılmış pedi içeren 15 ml tüp yerleştirin.
- Bir yatağa fare uzuvlarını sabitleyin.
- bozulmamış diyaframın alt yönü tutarak, karaciğer ve solunum kesilmesi üzerine hemen kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için periton ve göğüs boşlukları açın (bir boşaltma göğüs boşluğu havuzu oluşturmak için). Bu süreçte kanama kaçının.
- Özellikle, düşük kesi başlatmakÜst göğüs boşluğu seviyelere içlerinden kesme çapraz kaburga doğru her iki taraf için karın orta hat zarar iç organları olmadan nokta, ve ilerleme.
- portal ven ortaya çıkarmak için, deneycinin sağa hayvan dışında bağırsak ve yeri çekilme.
- dalak damara portal ven rostral bir peristaltik pompaya bağlı bir 30 g iğne, yerleştirin.
- göğüs boşluğundan perfüzat drenaj ve toplama izin diyafram yukarıda inferior vena kava kesti.
- yaklaşık olarak 3 ml / dakika bir hızda peristaltik pompa açın ve yavaşça göğüs boşluğu havuzundan kan ile kirlenmiş olan perfüzat ilk 3 ml toplar.
- Bu perfüzat atın. Gerekirse tuz kullanılarak, yine böyle bir yıkama tekrarlayın ve ancak ondan sonra karaciğer perfüzyon toplamaya başlar.
- Yeniden başlatma kadar ml / dakika ila 4 arasında bir hızla perfüzyon ve kullanılarak göğüs boşluğundan perfüzat 10 ml toplarbir şırıngaya bağlanmış bir kelebek.
- Karaciğer rengi açık kahverengi döndüğünde perfüzyon sonlandırın.
- lökositler Ekstraksiyon
- Santrifüj 400 x g'de 10 dakika boyunca perfüze.
- süpernatant aspire.
- 10 dakika boyunca 400 x g'de 10 ml PBS, santrifüj ekleyin ve çalışma hedefleri dayanarak süpernatant aspire, olduğu gibi hazırlık kullanın veya ek saflaştırma (örneğin, yoğunluk-gradyan ayırma) yürütmek.
- Spesifik olarak, tabaka, 50 cc'lik bir polipropilen santrifüj tüpüne yoğunluk gradyanlı ayrıştırma kütlesinin 4 ml üzerinde perfüzat her 4 mi. Devre dışı ile 30 dakika boyunca, 754 x g'de oda sıcaklığında tüpler dönerler.
- Manuel pipetleme yoğunluk-gradyan ayırma-süpernatant arayüzünde tek çekirdekli katmanları elde PBS içinde yıkayın ve 5 ml'lik bir tüp içine yerleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
F344 sıçanlarda karaciğer dokusunun mekanik taşlama aşağıdaki tüm karaciğer hücre popülasyonunun sitotoksisite (zorla karaciğer perfüzyon ile karaciğer sinüsoidlerinden toplanan) MH-NK hücrelerinin sitotoksisitesini karşılaştırıldı ve lökosit dolaşan sitotoksisite. Tüm hücre preparatları imünolojik deneylerde rutin olarak, en az 3 kez yıkandı ve hedef hücre çizgileri gibi allojenik YAC-1 veya singeneik MADB106 hedef hücre çizgileri kullanılır. Şekil 1'de gösterildiği...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan karaciğer perfüzyon yöntemi seçici bir hasat sağlar ve hepatik lökosit marginating benzersiz nüfusun incelenmesi. Ayrıca çukur hücreleri 3 olarak adlandırılan Karaciğer NK hücreleri, hepatik sinüzoitlerde ikamet farklı bir NK hücre popülasyonunu oluşturmaktadır. Bunlar, sıçanlar, fareler 17 ve insanlarda 18,19 bulunmaktadır. Izole edilmiş periferal NK hücreleri ile karşılaştırıldığında, çukur hücreleri küçük sitoplazmik granüllerin 20 daha yüksek bir sayı ve bu ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar ve bu çalışma NIH/NCI hibesi # R01CA172138 (SBE'ye) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Autoclud Peristaltik pompa | |||
| Kelebek iğne | OMG | 26 G | |
| Kelebek iğne | OMG | 21 G * 3/4 " | |
| Şırınga | Pic çözeltisi | 1 ml | |
| Şırınga | Pic çözeltisi | 2.5 ml | |
| Şırınga | Pic çözeltisi | 5 ml | |
| Şırınga | Pic solüsyonu | 10 ml | |
| Şırınga | Pic solüsyonu | 25 ml | |
| kenarlı forseps | |||
| Makas | |||
| kanama durdurucu | |||
| Doku forseps | |||
| 22 W Floresan Gün Işığı Büyüteç Lambası |
Kaynaklar
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis? Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
