Yöntem makalesi

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

7.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53919

⸱

10 Mart 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Pluripotent kök hücrelerden in vitro kardiyomiyositlerin üretilmesi, temel bilim ve klinik uygulamalar için in vitro olarak büyük miktarlarda kalp dokusuna erişim sağlar. Bu protokol, hem elde edilen kardiyomiyositlerin sayısını artırmak hem de atriyal fenotipli kardiyomiyositler oluşturmak için atriyalize edici faktör Grem2'yi kullanır.

Özet

pluripotent kök hücrelerinden kardiyomiyositlerinin popülasyonlarının oluşturmak için protokoller geliştirilmiştir, ancak bunlar genellikle karışık fenotip hücreleri verim. Belirli miyosit alt tiplerinin yer aldığı çalışmalarına devam ilgilenen araştırmacılar, daha yönlendirilmiş farklılaşma yaklaşımı gerektirir. GREM2, in vivo olarak atriyal odacıktan oluşumu için gerekli olan bir eden sekrete edilmiş BMP antagonist fare embriyonik kök (ES) hücreleri tedavi olarak, atriyal fenotip ile kalp hücreleri, çok sayıda üretilebilir. işlenmiş Myh6-DsRed-Nuc pluripotent kök hücre çizgisinin teşhisinde kullanılan, seçim ve kardiyomiyositlerde saflaştırılması için izin verir. Bu protokolde embriyoid organları asılı damla yöntemiyle Myh6-DsRed-Nuc hücrelerinden üretilir ve farklılaşma 4. günde (d4) kadar süspansiyon içinde tutulması. d4 hücre GREM2 ile muamele edilir ve jelatin kaplı plakalara kaplanmıştır. d8-d10 büyük müteahhitlik alanlarında kültürlerde gözlemlenen ve genişletmeye devam m olan ArasındaD14 ile çalıçtırdıgınızda. Moleküler, histolojik ve electrophysiogical analizler GREM2 ile muamele edilmiş hücrelerdeki hücre atriyal kardiyomiyositlerin biyoloji ve çeşitli farmakolojik maddeler tepkilerini üzerinde çalışmak için in vitro bir model sağlayan, atriyal benzeri özellikler elde etmektedir.

Giriş

Pluripotent kök hücreleri oluşturma ve özellikle insanlarda 1-5, Temel araştırma ve ön-klinik çalışmalar için erişim doku zor bir ana hücreleri incelemek için güçlü araçlardır. gelişimsel sinyal yollarının düzgün modülasyon arzu edilen fenotipik kaderine pluripotent kök hücrelerin farklılaşması yönlendirebilirsiniz. Birçok protokol pluripotent kök hücreler 6-14 den kardiyomiyositlerde (CMS) oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu protokoller, genellikle TFGβ süper ailesinin (Aktivin, BMP ve TGFβ) ve Wnt eksojen büyüme faktörleri ve / ya da küçük moleküllerin 10,12-15 zaman ayarlı eklenmesiyle yolları modülasyonunu içerir. Bu protokoller CMS haline hücrelerin yüzdesi artan genellikle etkilidir, ancak atriyal, ventriküler, ve düğüm / iletim sistemi soy temsil hücrelerin oluşan karışık bir nüfus üreten, özgüllük yoksundur. Belirli kardiyak incelemek için bir daha yönlendirilmiş farklılaşma beğenme alt tipleriach gereklidir.

Gremlin2 (Dan ve kısa Cerberus ve PRDC İlişkin GREM2 olarak da adlandırılan protein) zebrabalıkları 16 kardiyak gelişimi sırasında uygun bir kardiyak farklılaşma ve atriyal odacıktan oluşumu için gerekli olan bir eden sekrete edilmiş BMP antagonistidir. Sadece mezodermal belirteçleri T Brachyury ve 1 gibi Cerberus pik ifadesinden sonra, farklılaşma 4. günde GREM2 farklılaşan embriyonik kök hücreleri tedavi CMS verimini artırır ve ağırlıklı olarak atriyal soy 14 hücre havuzu oluşturur.

Rekombinant GREM2 farklılaşan hücrelerin tedavi etmek için kullanılır ve standart bir protein üretim teknikleri 17 kullanılarak yapılabilir veya ticari olarak satın alınabilir. Bu sulu çözeltiler içinde yüksek derecede çözünür olan ve istenen bir zaman noktasında kültürlere eksogen olarak ilave edilebilir.

Farklılaşma markörleri temsilcisi ekspresyonunu ölçmek için RT-qPCR kullanılarak izlenebilirkardiyovasküler ataları, kalp atalarıdır ve taahhüt CMS. Immünofloresans tespit etmek ve kardiyak hücre tipleri dağılımını görselleştirmek için kullanılabilmektedir.

belirlemek ve CMS izole etmek için bir raportör sistemi kullanırken saf nüfusu gerektiren uygulamalar daha kolay yapılır. Bu amaçla, αMHC-DsRedNuc fare CGR8 ES hücre hattı 14 içine inşa oluşturduk. CGR8 hücreleri genişleme ve farklılaşma deneyleri 18 kolaylaştırılması, büyümeye ve besleyici hücreler olmadan pluripotent kalır. ES hücre soyu gen promoteri (MHC ya Myh6 a) kardiyak spesifik alfa miyozin ağır zincir altında nükleer lokalizasyon sinyali ile DsRed floresan proteini kodlama dizisini içerir. Bu hücreleri kullanılarak, CM'ler kolayca tespit ve ölçümü, hücre sıralama, elektrofizyoloji, ilaç ekranlar ve atriyal farklılaşma mekanizmaları çalışmak için izole edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hücre Kültürü Medya, Çözümler ve Reaktifler 1. hazırlanması.

  1. Fare embriyonik kök hücre, 500 ml (Mesc) karıştırılması ve steril süzme (0.2 um gözenek boyutu) 445 mi Glasgow Minimum Esansiyel Medium (GMEM), 50 mi, ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile ortam hazırlanması 5 mi 100X L- konsantre edildi ml başına 1 x 10 7 birim ve 1.43 ul ß-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 50 uM olan) glutamin yerine, 5 ul rekombinant fare lösemi önleyici faktörü (LİF). Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.
  2. Karıştırma ve steril filtreleme 391 ml embriyoid Gövde (EB) farklılaşma ortam 500 ml Hazırlama Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı (IMDM) FBS, 100 mi, ısı, 5 mi 100X L-Glutamin yerine konsantre edildi, 5 mi 100X olmayan temel amino asitler konsantre edildi (MEM'dir) ve 2.86 ul ß-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 100 uM'dir). hazır olana kadar 4˚ C'de saklayın kullanmak için.
  3. % 0.2 hazırlamasüzüldü, 500 ml 1 g domuz derisi jelatin tozu ile kanştınlarak Jelatin / hac çözeltisi, damıtılmış H2O otoklav sterilize edilir. jelatin, oda sıcaklığında su içinde tamamen çözünür olması unutmayın. jelatin Otoklavlamadan sonra tamamen yok edilmesi gerekir. Kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.
  4. 0.5 ug / ul stok çözelti yapmak için% 0.1 BSA ile takviye edilmiş 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde liyofilize GREM2 50 ug pelet çözülmesiyle GREM2 yeniden birleştirici protein eşit miktarlarda hazırlayın. hazır kadar en -80˚ C Kısım beş steril 1.5 ml'lik santrifüj tüplerine içine bu stok solüsyonu 20 ul ve mağaza kullanmak için.
  5. 10X stok olarak yayınlanmış protokoller veya satın alma uygun PBS hazırlamak ve seyreltme 19 çalışan bir 1X yapmak için süzüldü damıtılmış H2O ile 1:10 oranında seyreltin. Kullanmadan önce otoklav ile PBS sterilize edin. Kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın. Bazı adımlarda, kullanılan 2+ Ca 2 + ve Mg olmadan DPBS. Bu pu1x çözelti olarak rchased. Sipariş bilgileri reaktifler tablosuna dahil edilir.

Jelatin 2. Hazırlık 10 cm'lik doku kültür tabakları Kaplı

  1. steril doku kültürü kaputu kaplama her 10 cm doku kültürü çanağı% 0.2 jelatin çözeltisi 5 ml. En az 30 dakika veya 4 güne kadar 37 ° C'de inkübatör içinde yer yemekler.

Jelatin 3. 6-yuvalı doku kültür plakaları Kaplı

  1. Bir steril doku kültürü başlık bir 6-yuvalı doku kültür plakasının her bir oyuğuna 0.2% jelatin 1 ml. En az 30 dakika veya 4 güne kadar 37 ° C'de inkübatör içinde yer plakalar.

4. Embriyonik Kök Hücre Kültürü

  1. çözülme mESCs
    1. steril doku kültürü kaputu RT'ye ısıtarak Mesc ortamını hazırlayın. jelatin kaplı 10 cm çanak 10 ml RT ortam ekleyin.
    2. Yaklaşık 1 x 10 6 hücre içeren mESCs 1 şişe çıkarınkriyodepolama. 37 ˚C su banyosunda maşa, yer cryovial tutarak. Hücre süspansiyonu çözülmüş ve sadece küçük bir buz kristali şişenin merkezinde kalana kadar yavaşça girdap. ile şişeyi kapalı kuru atılabilir havsız silin ve% 70 EtOH ile sterilize edin.
    3. Steril doku kültürü kaputu cryovial bir P1000 ucunu kullanarak çözülmüş hücreleri çıkarmak ve 4.1.1 hazırlanan 10 cm çanak) transfer.
    4. Arkaya doğru hafifçe plaka ön hareket ettirerek hücreleri dağıtmak eşit% 5 CO 2 ile 37 ˚C nemlendirilmiş hücre kültürü kuvöz içine 10 cm çanak yerleştirin ve sonra yan yana. Hücreler O / N plaka veya en az 6 saat eklemek için izin ver.
    5. İlk şey parlak bir alan mikroskobu kullanılarak eki için ertesi sabah kontrol hücreleri. Bazı hücre yıkıntıları ve ölü hücreler ortamda gözlenecektir. Bu normal. yemekler aspire medya ve 10 ml taze Mesc medya ile değiştirin.
    6. farklılaşma önlemek için her gün hücreleri üzerinde ortamı değiştirmek devam ediyor.
  2. Pasajlanması mESCs
    1. Passage hücreleri zaman% 60-70 konfluent. Medya aspirasyon ve MgCl2 ve CaCl2 olmadan 5 ml steril 1X DPBS ile durulama geçiş için hücreleri hazırlayın. 2 mi% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde yerleştirin.
    2. Hücreler inkübe edilirken, jelatin solüsyonu aspire RT Mesc ortam 10 ml ekleyerek yeni 10 cm tabak hazırlar. 5 dakika sonra dekolmanı hücreleri kontrol edin. Hücreler bağlı kalır ise tamamen müstakil kadar bir seferde 2 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe devam etmektedir.
    3. Mesc ortam 3 ml ekleyerek tripsin-EDTA söndürün. pelet 5 dakika 200 x g'de 15 ml santrifüj tüpüne ve spin hücre süspansiyonu aktarın. pelet aspire medya ve 10 ml Mesc medyada askıya yeniden.
    4. İstenen bölme oranına bağlı olarak, aşama 4.2.2'de hazırlanan her bir çanak) hücre süspansiyonu, 0.5-1.0 ilave edin. sonra yavaşça öne geri yan yana hareket ettirerek hücreleri dağıtmak eşit inkübatör çanak yerleştirin ve. tümakış hücreleri O / N ya da en az 12 saat süre ile birleştirebilir.
      NOT: 1:10 Bölünmüş oranı - 01:20 çoğu Mesc hatları için yaygındır. Bu oran, yeni bir çanak kullanılan çizgi, kanal adedi ve istenen izdiham bağlı olarak değişebilir. yeni hazırlanmış jelatin-kaplı 10 cm'lik bir tabakta 1:10 bölünme oranı 9 mi Mesc ortam içine 1 ml hücre süspansiyonu transferi ve plaka için.

Embriyoid Cisimlerin 5. Hazırlık

Not: santrifüj dışında tüm adımlar steril doku kültürü kaputu gerçekleştirilir.

  1. EB Medya Hücre süspansiyonunun hazırlanması
    1. % 70 confluency (genellikle 24-48 saat sonrası geçiş) sonra, EB oluşumu için hücreleri kullanın. 4.2.3) - sökülmesi ve bölümlere 4.2.1) göre taneleştirilerek EB oluşumu için hücreleri hazırlayın.
      Not: (. Örneğin, çok az hücre ölümü, kontaminasyon, uygun morfoloji) en az bir kez post-çözülme geçiş hücrelerine en iyi ve sağlığı için kontrol edin ve güçlü büyüme (e.g., önce her 24-48 saat meydana gelen nüfus çiftlenmeler) EBS yapmak için kullanılacak.
    2. 5 ml EB medya pelet yeniden askıya. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacını kullanarak hücreleri saymak.
    3. / Ul 25 hücre (veya 2.5 x 10 3 hücre / mi) içindeki bir nihai konsantrasyon yapmak EB ortamının gerekli hacimde bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir. bir petri kabı, her kapak 60 EBS tutan ve hücre süspansiyonu, yaklaşık 1.3 ml gerektirdiğini not edin. Bu adımda, EBS istenen bir sayı üretmek için, hücre süspansiyonunun yeterli hacmi hazırlar. 240 EBS deney için gerekli olan, örneğin, 2.5 x 10 3 hücre / ml'de 5.2 ml hazırlar.
      Not: EB formasyonu için kullanılmayan mESCs Mesc ortam içinde yeniden süspansiyon haline ve Bölüm 4.2'de tarif edildiği gibi kaplama, aşağı iplik gelecekteki deneyler için de kullanılabilir.
  2. Embriyoid Kuruluşlarının Yaratılış
    1. e altına 1X PBS 2 ml ekleyerek steril 10 cm tanecik oluşumu asılı bakteriyel petri yemekler hazırlamakach.
    2. steril bir çözelti havzasına adım 5.1 EB süspansiyon) aktarın.
    3. Hazırlanan petri kapağını kaldırın ve dikkatlice iç yüzeyi üzerine EB süspansiyon altmış, 20 ul damla yatırmak. etkin bir şekilde 6 uçları ile donatılmış çok kanallı bir pipet kullanılarak bunu. Her 20 ul damla şimdi 500 hücreleri vardır.
    4. Yavaşça damla asılı çıkarmak için dikkatli olmak, bakteriyel petri yemek alt yarısında üzerine kapağı değiştirin. 2 gün sonra 37˚ C'de hücre kültürü kuvöz içine yemekleri yerleştirin hücreleri) 5.3 anlatıldığı gibi yıkamak için hazırız.
  3. Embriyoid Cisimlerin Yıkama-down
    Not: Tüm yıkama-aşağı adımlar steril doku kültürü kaputu yapılmaktadır.
    1. 2 gün sonra EB aşağı yıkamak için hazır ve 6 cm bakteriyel petri kaplarına transfer. RT'ye petri başına EB medya Pre-sıcak 3 ml. Her 6 cm bakteriyel petri etkin bir damla asılı değerinde 2 kapakları tutabilir.
      Not: olmayan bir kaplı petri f kullandığınızdan emin olunveya bu adım (malzeme tabloya bakınız). Bir doku kültürü çanak veya hücre yapışmasını teşvik başka bir yüzeye kullanmayın. Bölüm 6'da tarif edildiği gibi EBS hazır olana kadar ortamda kaplanmıştır için askıda kalır gerekir.
    2. kuluçka 10 cm petri kapları çıkarın ve steril doku kültür davlumbaz içine yerleştirin. Dikkatle EBS ile kapağı çıkarın ve 45 derecelik açıyla eğin.
    3. RT EB ortam 3 ml ihtiva eden bir 5 ml serolojik pipeti kullanarak, yavaşça kapak altındaki bir havuza EBS yıkayın. Dikkatle yüzeye yapışmış ve gerekirse-durulama yeniden EBS için kapağı kontrol edin.
    4. 6 cm'lik petri tüm EBS transferi yıkadıktan sonra.
    5. Tümünü tekrarla EBS için) -5.3.4) 5.3.2 yineleyin. Her 6 cm petri iki 10 cm kapaklar gelen EBS içermelidir. İki gün daha 37 ˚C geri kuvöz içine tüm yemekleri yerleştirin.
      NOT: Çok süspansiyonda birbirine yakın EBS birbirine yapışmasına ve büyük agrega oluşabilir. Bu olumsuz kalp farklılaşma verimliliği etkileyebiliryanı sıra önemli ölçüde mevcut EBS sayısını azaltmak. toplanmasını önlemek için, EBS, her gün kontrol ve yavaşça ileri geri hareket ettirerek ayrılmalıdır, daha sonra yan yana. Erken farklılaşma adımda bakteriyel yemekler kullanımı çanak EB bağlanmayı önleyen ve EBS süspansiyon içinde büyümeye izin vermek için gerekli olan.

GREM2 ile EBS 6. Kaplama ve Tedavi

  1. 1-5 mg / ml bir nihai seyreltme için GREM2 RT EB ortamına stoklar yeterli hacmi (0.5 ug / ml) ilave edilerek GREM2 işleme ortamı hazırlayın.
    Not: EBS tedavisi için etkili konsantrasyon hücre hattı ve GREM2 mevcut çok spesifik aktivitesine bağlı olarak değişir. Dozu kullanmadan önce maksimum etkinliği bulmak için titre edilmesi tavsiye edilir. CGR8 Mesc hattı için rutin GREM2 3-5 ug / ml kullanmak. arasında hızla daralan hücreler üretecek atriyal miyosit üretimi için GREM2 etkin yoğunluktaher iyi genelinde yaygın olan günler 7-8. sözleşme fenotipi işlenen kültürlerde gözlenen değilse GREM2 belirtilen aralık içinde titre edilebilir doz tavsiye edilir.
  2. her bir jelatin kaplama çözeltisi aspire RT GREM2 işleme ortamının 2 ml eklenerek 6-yuvalı doku kültürü plakaları hazırlayın. Inkübatör EBS çıkarın ve steril doku kültürü kaputu içine yerleştirin.
  3. her kuyuya 6 cm petri 100 ul transferi 30 EBS ayarlanmış bir P1000 kullanma. Yeri EBS kuvöz içine ve eşit yan sonra ön arka tarafını plakasını hareket hafifçe tarafından dağıtmak.
    1. EBS jelatin kaplı kuyulara bağlı sonra, sağlıklı hücreleri korumak için her iki günde bir, taze EB medya günden 10 güne sonra 10 kadar GREM2 tedavinin kesilmesine iki günde GREM2 ortamını değiştirin ve ekleyin.
      NOT: taktıktan sonra, EBS kaplı plaka yüzeyi boyunca dışarı dümdüz olacak.

RT-qPCR Analy 7. hücre ayrışmaabla

  1. Tripsin-EDTA ile hücre ayrışma
    1. Her bir aspire ortam ve steril DPBS eksi Ca + 2 ve Mg + 2 oyuk başına 1 ml ile iki kez yıkayın.
    2. her bir hücre elde edilecek olan 0.5 ml% 0.25 steril Tripsin-EDTA solüsyonu ekleyin.
    3. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde plaka koyun.
    4. ayrılması için 5 dakika kontrol hücreleri sonra. Hücreler yine de musluğun altına takılı kalırsa yavaşça gevşetin. dokunarak hücrelerinin gevşetmek etmezse, geri kuvöz içine yerleştirin ve hücreler tamamen müstakil kadar her 2 dakikada bir monitör.
    5. her oyuğa 0.5 ml EB ortamı eklenerek tripsin-EDTA çözeltisi nötralize.
    6. 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu tüm 1 ml aktarın.
    7. 300 x g'de 5 dakika boyunca bir masa üstü santrifüj iplik Pelet hücreleri.
    8. Aspire pelet medya ve lizis için hazır olana kadar -70 ° C'de hemen lizis veya mağaza pelet geçmek. Uzun terBu RNA bozunmasına yol gibi pelet m saklanması tavsiye edilmez.
  2. Hücre parçalama ve moleküler analizi
    1. Bu noktada hücreler (malzemelerin tabloya bakınız) ticari bir kolon ekstre etme kiti kullanılarak ve üretici tarafından sağlanan protokollere göre, bir RNA özütleme reaktif kullanılarak RNA izolasyonu için hazırdır. Bir kez izole, transkripsiyonu RNA ters ve 21 standart teknikler 20 kullanılarak RT-qPCR analizi için cDNA kullanın.
      NOT: RT-qPCR için bu laboratuvarı tarafından kullanılan primerler Tablo 1'de Atriyal kimlik listelenen kayıt aksiyon potansiyeli süresi (bakınız bölüm 8) atriyal ve ventriküler genlerin ifadesi ve elektrofizyoloji bakmak için RT-qPCR bir arada kullanarak teyit edilir. bir gen seçimi, güvenilir atriyal ve ventriküler markerlerinin bir örnek olarak, bu protokolde yer almaktadır. Pluripotent kök hücre farklılaşması bağlamında atriyal ve ventriküler gen ekspresyonu ile ilgili daha fazla bilgi referans 14'de bulunmaktadır.

8. Elektrofizyolojik Analizi

  1. Kollajenazının ile hücre Ayrışma
    1. her bir ve steril PBS göz başına 1 ml ile iki kez yıkayın aspire ortam.
    2. Her / ml kolagenaz çözelti, 1 mg, 0.5 mi de ekleyin.
    3. 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde plaka koyun.
    4. ayrılması için 5 dakika kontrol hücreleri sonra. hücreler hala birbirlerine ya da musluğun altına takılı kalırsa yavaşça gevşetin. Dahası, bir P1000 nazik toz haline getirilerek hücreleri ayırmak.
      NOT: Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar yama kelepçe kayıtları hücreleri kolaylaştırmak için toz haline edilmelidir.
    5. her kuyuya 0.5 ml EB medya ekleyin ve pipetleme karıştırın.
    6. 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu tüm 1 ml aktarın.
    7. 300 x g'de 5 dakika boyunca bir masa üstü santrifüj iplik Pelet hücreleri.
    8. Hücre pelet aspire medya.
    9. 500 hücreleri yeniden askıyatek bir hücre süspansiyonu içine çiğnemek için emin olmak,% 10 FBS ile PBS mcL.
  2. Elektrofizyolojik Karakterizasyonu.
    NOT: Birçok mükemmel protokolleri hücre zarı potansiyellerini ölçmek için tek bir hücre yama kelepçe kullanarak bu dergide yayınlandı. Tek hücreli yama acemi okuyucu kelepçe nasıl gerçekleştirileceği hakkında ayrıntılı bilgi için bu protokollerin 21-24 denir. Aşağıdaki deneyimli elektrofizyolog hazırlamak ve Mesc alt tipi karakterizasyonu için CMS türetilmiş idare yardımcı olacaktır bu protokol için özel bilgileri içerir.
    1. 10 mM HEPES tamponu, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM potasyum glutamat, 10 mM KCI ve 10 mM NaCI: Aşağıdakilerden oluşan hücre içi kayıt çözeltisi hazırlayın. NaOH ile 7.2 arasında bir pH değerine çözelti ayarlayın.
    2. Hücre dışı kayıt (banyo) aşağıdakilerden oluşan çözelti hazırlayın: 2 mM HEPES, 10 mM glükoz, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5.4 mM KCI, 137mM NaCI. NaOH ile 7.4 arasında bir pH değerine çözelti ayarlayın.
    3. Filament standart borosilikat camını kullanarak kayıt çözümü ile geri dolduruldu zaman 2-5 MQ direncini ölçen bir cam pipet hazırlayın.
    4. Transfer P200 kullanılarak hücre dışı kayıt solüsyonu içeren bir kayıt odasına süspansiyon 100 ul hücre.
      Not: Hücreler, kullanımı kolaylaştırmak ve ilaç tedavisi ve / veya perfüzyon deneyleri için kullanılacak, süspansiyon içinde yama ya edilebilir 8.2.5 belirtildiği gibi bir jelatin kaplı lamel) üzerinde tohumlanabilir.
    5. 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna 10 mm çapında bir cam lamel yerleştirerek ve bu protokol) Bölüm 3.1 de tarif edildiği gibi bir jelatin çözeltisi ile kaplayarak jelatin kaplamalı cam lamel hazırlayın.
      1. En az 30 dakika aspire jelatin solüsyonu sonra ve kapak ve en az 2 saat boyunca ya da hücre eklenmiş kadar inkübatör içine bütün 6-plaka doğrudan süspansiyon 100 ul hücre ilave edin. Hücreler ekledikten sonra, Rekstrasellüler kayıt çözümü ile odasına kayıt olarak aldır kapak kayma ve yer.
        Not: αMHC-DsRed flüoresan kardiyak raportör Mesc hattı kullanıldığında, CM'ler kendi kırmızı flüoresan çekirdekleri tarafından tanımlanabilir. Kalp muhabir hattı kullanarak değilse, kendiliğinden sözleşme hücreleri görülebilir ve ölçümler için izole edilmiştir. Pluripotent kök hücre tam olarak oluşmuş yetişkin kardiyak miyositler karakteristik dikdörtgen morfolojisi eksik, CM'ler genellikle daha küçük ve daha yuvarlak türetilmiş.
    6. 37 ˚C tüm kayıtları yapın. 2-5 MQ direnci borosilikat cam pipet ile akım kelepçe modunda tüm hücre kelepçe kullanarak tek hücre yama. tüm hücre erişmesini önce gigaohm mühür elde etmek için hafif negatif basınç kullanın. membran rüptürü ve membran potansiyelleri kaydetmeden önce tam hücre erişmek için hızlı negatif basınç uygulayın.
    7. Geçerli enjeksiyonları depolarizan 4 msn kullanarak aksiyon potansiyelleri uyandırmak.
      NOT:PSC türetilmiş CM'ler için akım miktarı tekrarlanabilir aksiyon potansiyelleri değişebilir tetiklemek için gereken. tekrarlanabilir aksiyon potansiyelleri elde edilene kadar uygun eşik akımını bulmak için, kademeli bir şekilde nispeten düşük akım ve artış tetikleme akım genliği başlar.
      Not: GREM2 kaynaklı atriyal miyositlerde için hareket potansiyeli sürelerine sahiptir 20-40 ms aralığında genellikle bir plato fazı (Şekil 6B) sahip değildirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Önce farklılaşma, pluripotent kök hücreler kompakt ve spontan farklılaşma arındırılmış olmalıdır. Şekil 1A'da gösterilen hücrelerin singularized ve protokol bölümünün 5.1 de tarif edildiği gibi damla asılı kullanılmak üzere hazırdır. Şekil 1B de gösterilen hücrelerin spontan ayırt edilir ve asma damlaların hazırlanmasında kullanılan kullanılmamalıdır.

Paneller 2 gösteri ba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol rutin atriyal soyunun karakteristik CM'ler yüksek bir yüzde ile kültürleri üretmektedir. herhangi bir farklılaşma protokolü ile olduğu gibi, farklılaşma öncesi mESCs kalitesi özellikle önem verilmelidir. mESCs rutin uygun morfoloji (Şekil 1A) için izlenmelidir. Önce EBS oluşumuna oluşan herhangi bir spontan farklılaşma ciddi cardiogenesis etkinliğini sınırlamak ve (Şekil 1B) Pasajlanması önce çıkarılmalıdır. EB boyutu da cardiogenesis etkiler. 200 ve EB başına 1.000 aras...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bu makalenin yazarlarının birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibe HL083958 ve HL100398 (AKH) ve 2T32HL007411-33 tarafından desteklenen "Kardiyovasküler Mekanizmaları Programı: Soruşturmasında Eğitimi" (JB).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GMEMYaşam Teknolojileri11710
FBSYaşam Teknolojileri10082
GlutamaxYaşam Teknolojileri35050
LIFEMD MilliporeESG1107
ß-MerkaptoetanolSigmaM3148
IMDMSigmaI3390
Esansiyel Olmayan Amino AsitlerSigmaM7145
10 cm Doku KültürüPlakaları Sarstedt83.3902
10 cm Bakteriyel Petri KaplarıVWR25384-342
6 cm Bakteriyel Petri KaplarıVWR25384-092
6 oyuklu doku kültürü plakalarıSarstedt83.3920
Gremlin 2 rekombinant proteinR & Amp; D Systems2069-PR-050
Steril filtre üniteleriThermo Fisher09-741-02
Jelatin (domuz derisinden)SigmaG1890
10X PBS, SterilSigmaP5493
BSA Sigma5470
%0,05 Tripsin-EDTA çözümüYaşam Teknolojileri25300054
DPBS, Kalsiyum yok, Magnezyum yokYaşam Teknolojileri14200

Kaynaklar

  1. Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
  2. Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
  3. Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  4. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  5. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
  6. Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  8. Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
  9. Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).
  10. Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
  11. Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  12. Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  13. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  14. Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
  15. Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  16. Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
  17. Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
  18. Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).
  19. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
  22. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  23. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  24. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  25. Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  26. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
  27. Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
  28. Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  29. Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
  30. Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Grem2 UygulamasEmbriyoid Cisim Olu umuAsk l Damla Y ntemiJelatin KaplamaMyh6 DSRed Nuc HattKardiyak DiferansiyasyonAtriyal FenotipElektrofizyoloji Analizi

İlgili makaleler