Method Article

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

DOI:

10.3791/53924

⸱

May 17th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD, birçok tamamen farklılaşmış kas dışı hücre hattının miyojenik transdiferansiasyonunu indükleme kapasitesine sahip miyojenik bir transkripsiyon faktörüdür. Bu transdiferansiyasyonda yer alan epigenetik mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, MyoD ortaklarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kütle spektrometresi ile takip edilen bir çift afinite saflaştırma yöntemini açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskelet kası terminal farklılaşma iskelet hücreleri pluripotent mezodermal öncü hücrelerin taahhüdü ile başlar. Bu hücreler hala çoğalmaya yeteneğine sahip ya da myofibers oluşturmak için daha olgunlaşmak çok çekirdekli miyotüplerinden, içine ayırt ve sigorta olabilir. İskelet kası terminal farklılaşma özellikle kas Düzenleyici Faktörler veya MRF üyeleri (MyoD, Myogenin, Myf5 ve MRF4), aynı zamanda miyojenik bHLH transkripsiyon faktörleri ailesi olarak adlandırılan, çeşitli transkripsiyon faktörleri koordineli hareket tarafından orkestra edildiği. Bu faktörler iskelet Miyogenesis ulaşmak için ayrıntılı kopyalama düzenleyici ağı içinde kromatin-remodeling kompleksleri ile işbirliği. Bu bağlamda, MyoD kas terminal farklılaşma tetikleme master myojenik transkripsiyon faktörü olarak kabul edilir. Bu kavram iskelet kası hücrelerine olmayan kas hücrelerini dönüştürmek için myod yeteneği ile güçlendirilmiştir. Burada myod tanımlamak için kullanılan bir yaklaşım tanımlamakiskelet kası farklılaşması dahil çeşitli faktörleri aydınlatmak için ayrıntılı bir şekilde protein ortakları. Uzun vadeli amaç iskelet kası genlerin düzenlenmesi, yani., MyoD hedefleri yer alan epigenetik mekanizmalar anlamaktır. MyoD ortakları iskelet kası farklılaşması esnasında ilgili mümkün rolü doğrulama ve ardından kütle spektrometrisi (MS) karakterizasyonu bağlanmış bir heterolog sistemde, Tandem afinite saflaştırma (TAP-Etiketi) kullanılarak tespit edilir. kas rejenerasyon konjenital myastenia, miyotonik distrofi rabdomiyosarkomda ve kusurları: miyojenik faktörler, ya da anormal düzenleme anormal şekilleri, kas bozuklukları sayısı ile ilişkilidir. Bu nedenle, myojenik faktörler hastalığın tedavisini artırabilir hastalığın kendisi ve rejeneratif mekanizmaların neden mekanizmaları ile ilgili hem kas bozukluklarında potansiyel terapötik hedefler havuzu sunmaktadır. Bu nedenle, ayrıntılı understankas kaynaklı faktörler tarafından kontrol edilen moleküller arası etkileşimlerin ve genetik programları Ding etkin terapiler rasyonel tasarımı için gereklidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik çok hücreli organizmalar farklı organ ve dokularda oluşmaktadır. Her işlevsel doku, her farklılaşma adımında belirlenen spesifik bir gen deseni ifade vardır. Hücresel farklılaşma gen bir dizi hücre proliferasyonu ile ilgili olanlar gibi bir susturma, genel olarak özel genlerin aktivasyonu, kendi ifade bakım gerektirir ve. İskelet kası farklılaşma veya Miyogenesis, o miyoblastların içine mezodermal kök hücrelerin belirlenmesi ile başlar, böylece çok adımlı bir süreçtir ve daha sonra ilk mono-çekirdekli ve daha sonra çoklu çekirdekli, myotubes bu miyoblastların terminal farklılaşmasına yol açar . Böylece, miyoblastlar hala çoğalmaya edebiliyoruz hücreleri, "kararlı", ama onlar embriyonik gelişim sırasında veya yetişkin kas rejenerasyonu ya iskelet kas hücrelerine sadece ayırt edebilir, böylece iskelet kası soy taahhüt ve edilir. iskelet kası terminal işlemi farklıdırayırt edilmesi gibi E2F hedef genlerin 1 proliferasyon ilişkili genlerin, kesin bir susturma neden miyoblast öncü hücrelerin hücre döngüsüne kalıcı çıkış ile başlayan belirli bir genetik program tarafından yönetilen bir almaktadır. Gerçekten de, farklılaşması sürecinde, miyoblast proliferasyonu tutmak iskelet kası, belirli genlerin ekspresyonunu ve miyotüplerinin 2'ye miyoblastların füzyon öncesinde çok önemli bir adımdır. Böyle bir program iskelet kası hasarı aşağıdaki rejenerasyon sürecinde ayırt etmek için erişkin kas kök hücrelerini de denilen uydu hücreleri, izin verir.

Memeli Miyogenesis myojenik temel helix-loop-sarmalın bir ailenin kritik bağlıdır (bHLH) transkripsiyon sıklıkla iskelet kası belirleme faktörleri veya MRF (kas Düzenleyici Faktörler) 3 ailesinin olarak anılacaktır myod, Myf5, MRF4 ve Myogenin, faktörler. Bunların her biri tarifnamede ve dif önemli bir rol oynariskelet kası hücreleri ferentiation ve belirli bir sentezleme modelini Nisan 05-07 yer alır. Myf5 ve myod aktivasyonu miyojenik soy hücreleri taahhüt belirleyici bir adım teşkil ve Myogenin sonraki ifadesi gibi MCK (kas Kreatin Kinaz) olarak iskelet kası belirli genlerin aktivasyonu ile Miyogenesis tetikler. Miyojenik bHLH transkripsiyon faktörleri önceden sessiz loci 8 kas genlerin aktivasyonuna MEF2 aile üyeleri ile işbirliği. Ayrıca çeşitli gen düzenleyici bölgeler 8 sözde e-kutuları bağlanan D proteinleri olarak bilinen her yerde bHLH proteinler, E12 ve E47, ile heterodimerler olarak iskelet kası, gen transkripsiyonu teşvik eder. Büküm, Kimliği (farklılaşma inhibitörü) ve diğer faktörler olumsuz 8 bağlayıcı E proteinleri için myod ile rekabet ederek, bu süreci düzenler.

MyoD kas terminal farklılaşma 9 tetikleyen önemli bir oyuncu olarak kabul edilir birçok tamamen farklılaşmış olmayan kas sistemlerinde 10-13 bir myojenik belirleme / farklılaşma (trans-farklılaşma) programı neden kapasitesine sahip çünkü. Nitekim, myod zorla ifadesi farklı hücresel türde başka embriyolojik kökenli 12 türetilmiş hatta trans-farklılaşmasını uyarır. Örneğin, MyoD kas-benzeri hücrelere hepatositler, fibroblastlar, melanosit, neuroblasts ve adipositler dönüştürebilirsiniz. Myod trans-farklılaşma eylem orijinal genetik programı (özellikle, çoğalma genleri) susturulmasına eşlik olmayan bir kas ortamda myojenik genetik programın anormal aktivasyonunu (özellikle hedef genler), içerir.

Miyoblastları çoğalan yılında MyoD ifade ama onların rehberleri 14-16 bağlanır bile hedef genleri aktive edemiyor edilir. Bu nedenle, MyoD sürekli farklılaşmamış miyoblastların ifade edilmesi şartı oldukça ELU kalırsive. MyoD önce kromatin remodeling aktive 14,17 enzimleri yüklenmesiyle miyoblastları çoğalan baskıcı kromatin değiştirici enzimlerin işe nedeniyle hedef genleri bastırmak olabilir. Örneğin, miyoblastlar çoğalan, MyoD histon H3 lizin 9 veya H3K9 ve H3K27 KMTs içeren transkripsiyonel ko-represör KAP-1, histon deasetilaz (HDAC) ve baskı lisin metiltransferaz (KMTs) ile ilişkili ve aktif hedef genlerin ekspresyonunu baskılayan bir bir yerel baskıcı kromatin yapısı 14,17 kurarak. Önemli olarak, yeni bir rapor MyoD kendisi doğrudan H3K9 KMT G9A olan transaktivasyon aktivitesini, 16 inhibisyonu ile sonuçlanan metillenmektedir olduğunu göstermiştir.

MyoD non-kas hücrelerinin, bu şekilde trans-farklılaşmada rol oynayan epigenetik mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, bazı hücre çizgilerinden MyoD kaynaklı trans-farklılaşma dayanıklıdır. Böylece HeLa hücrelerinde, MyoD ya olmayan veyaHatta bağlı kompleks SWI / SNF 18 remodeling kromatin BAF60C alt biriminin ekspresyonu olmaması bastıncısı yerine transkripsiyon aktivatörü olarak işlev olabilir. Bu model, bu şekilde daha iyi bir MyoD kaynaklı geni sentezlenmesi mekanizmalarını tanımlamak için bir seçim olabilir. Ilişkili ortakları ile hedef odakta baskıcı kromatin ortamı teşvik ve bu nedenle terminal farklılaşma ince ayar yapmak için miyoblastları çoğalan olarak MyoD bağımlı baskıcı mekanizmaları ortaya çıkarmak için myod yeteneğini tahlil edilmesi de uygundur.

Burada kütle spektrometrisi (MS) karakterizasyonu bağlanmış Tandem afinite saflaştırma (TAP-Etiketi) kullanılarak MyoD ortaklarının tespiti için protokol açıklar. stabil Bayrak-HA-myod ifade HeLa-S3 hücrelerinin kullanılması fraksiyone nükleer ekstrelerinden MyoD kompleksleri arındırmak için yeterli malzeme almak için izin verdi. heterolog sistemde MyoD ortaklarının tespiti validati izlediilgili bir sistemde üzerinde.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HeLa-S3 Nükleer Tuz ekstrakte ve Kromatin bağlı Kesirler 1. hazırlanması

  1. Hücreleri Toplama
    1. % 10 fetal dana serumu, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin (büyüme ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 'de HeLa-S3 Flag-HA-MyoD ve HeLa-S3 Flag-HA (kontrol hücre soyu) büyütün nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de, orta) ve% 5 CO2.
      Not: kararlı bir şekilde Flag-HA-MyoD ve HeLa-S3 boş vektör (HeLa-S3 Flag-Ha) ile transduse hücreleri eksprese eden HeLa-S3 hücreleri anlatılan protokol kullanılarak kurulabilir ya: 19,20 ya da yazarlar tarafından sağlanır.
    2. Her bir hücre hattı (HeLa-S3 Bayrak-HA-MyoD ve HeLa-S3 Bayrak-HA hücreleri) 10 tam konfluent 150 mm yemekleri hücreleri kadar yükseltin.
    3. 5 L spinner içine süpernatant (yapışmayan ICSI'nin içerirler) toplayın.
    4. Oda tem 1 dakika için hücreler trypsinize, 150 mm tabak başına 10 ml PBS ile yapışık alt popülasyonu yıkayınsıcaklık (% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi, 15 cm'lik bir tabak 2 mi).
    5. 150 mm tabak başına ortam 4 ml ilave edilir ve 50 ml tüpler içinde hücreleri toplamak.
    6. (5 L spinner) aşama 1.1.3 ve aşama 1.1.5 hücreleri süpernatant birleşerek hücre hattı için, taze, önceden ısıtılmış büyüme ortamı 500 ml ekle.
    7. 5 L'lik spinere hücre süspansiyonu aktarın ve nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde en az 60 saat boyunca hücrelerin büyür.
    8. Taze büyüme ortamı 500 ml ilave edilir ve 24 saat boyunca hücrelerin büyür.
    9. Taze büyüme ortamı 1 L ilave edin ve 24 saat boyunca hücrelerin büyür.
    10. hücrelerin sayısı ve hücre canlılığı kontrol etmek için hücre süspansiyonu 1 ml çıkar. Renk hemasitometre kullanarak mikroskop altında 30 mavi% 0.4 tripan ul ve saymak canlı (mavi değil) hücreleri ile hücre süspansiyonu 30 ul.
    11. ; Günlük taze büyüme ortamı eklenerek 6 x 10 5 hücre / ml - 2 hücre yoğunluğu tutmak 1 x 10 6 hücre / ml aşmamaktadır. Maksimumbir 5 L eğiren hacim L. 2.5
      Not: Aşağıdaki adımlar için, 2 toplu tarafından devam - bir yoğunlukta 1 x 10 6 hücre / ml kültür 2.5 L. yaklaşık 20 L toplamak için 1.1.14 - Tekrar 1.1.12 adımları bir sonraki aşamaya geçmeden önce, her bir hücre hattı (kuru pelet ≈ 20 g) eklenmiştir.
    12. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri 4 ° C'de ve supernatant atın.
    13. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de pipetleme ve santrifüj ile buz soğukluğunda PBS, 100 ml içinde süspanse pelet hücreleri yıkamak için kullanılır.
    14. Buz soğukluğunda PBS, 25 ml hücrelerin tekrar asılı tutulmasından 50 ml tüp içine süspansiyon aktarma ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yıkama tekrarlayın.
      Not: Hücre peletleri hemen kullanılmıştır veya sıvı azot içinde dondurulmuş ve birkaç gün -80 ° C de muhafaza edilebilir ya da.
  2. Çekirdeklerin izolasyonu
    Not: adımları 1.2.1 gerçekleştirin - soğuk oda 1.4.3.
    1. Ön soğutma büfers ve homojenizatörler.
    2. donmuş malzemenin kullanılması durumunda, hızlı bir şekilde 37 ° C'de su banyosu içinde hücre pelletleri eritin.
    3. Yeniden süspanse 20 g, 20 ml hücre (≈ 20 mi), daha sonra 5 ml ekleyerek, ilk tampon, 10 ml kullanılarak eklenerek hipotonik tampon A (Tablo 3) (hücre peleti boyutuna eşit olan bir hacim) başka bir 5 ml. Hücrelerin tam verim alabilmek için taze tamponu ile de pipetler yıkayın.
    4. Bir dar havaneli ile önceden soğutulmuş homojenleştirici içine aktarın 40 ml hücre süspansiyonu.
    5. Bir homojenleştirici 20 vuruş (ve hareketler dışında 20) ile hücrelerin homojenize ve 50 ml tüp içine hücre süspansiyonu aktarın.
    6. Hücrelerin maksimum geri sakaroz tampon (ilk hücre hacminin 1/3, Tablo 3) 7 ml homojenleştirici yıkayın. çekirdekleri korumak ve sızıntıyı sınırlamak için adım 1.2.5 50 ml tüp içine hızlı bir şekilde bu süspansiyon aktarın.
    7. % 0.4 TR'nin 30 ul ile 30 ul kısım Leke(Lizis başarılı olursa, tüm çekirdekler mavi olmalı) lizis etkinliğini kontrol etmek mikroskop altında analiz mavi ypan. Gerekirse, homojenleştirme adımı tekrarlanır.
    8. 10,000 x g'de, 7 dakika ve 4 ° C'de santrifüj çekirdekleri pelet. Sitoplazmik fraksiyon olarak süpernatant kaydedin.
  3. Nükleer Tuz ekstrakte (SE) Kesir hazırlanması
    1. sukroz tamponu (çekirdekler pelet boyutuna eşit bir hacim) 8 ml çekirdekleri pelletini. Bir girdap yüksek tuz tamponu (1 çekirdek topağı hacmi, Tablo 3), 8 ml ile iyice karıştırılması, 300 mM NaCI nihai konsantrasyon elde etmek için ise damla damla ekleyin. 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya bırakılır ve her 5 dakikada karıştırılır.
    2. sukroz tamponu 8 ml (toplam hacmin 1/3) eklenerek 150 mM NaCI konsantrasyonunu azaltır. 13.000 x g'de 10 dakika 4 ° C'de santrifüj. süpernatant (nükleer tuz ekstrakte fraksiyon, SE) toplayın.
      Not: Ya SE 1.3.3 adıma ya da ayrılmak geçinkromatin bağlı fraksiyonu ve her iki fraksiyonlar aynı anda daha sonra ultra santrifüj hazırlanması sırasında buz üzerinde kesir.
    3. 4 ° C'de 85,000 x g'de 30 dakika için ultra-santrifüj GD. süpernatant (≈ 26 ml) atın.
    4. sıvı nitrojen içinde 100 ul tablet dondurun. ekstresinin kalanını kullanarak, 2 "Protein kompleksi saflaştırma" adıma geçin.
      Not: kısım aşama 5.1.1 içinde bir giriş kontrol olarak kullanılmak üzere.
  4. Kromatin bağlı Fraksiyon hazırlanması
    1. pelletini (Adım 1.3.5 den.) titizlikle 7 ml sakaroz tampon (pelet boyutuna eşit bir hacim).
    2. MNase (aşama 1.4.4) aktif hale getirmek ve karıştırmak için 1 mM arasındaki nihai bir konsantrasyonda (süspansiyon 14 ml, 0.5 M CaCI2 28 ul) ile CaCl2 ekleyin.
    3. 37 ° C'de 1 dakika süre ile ön ısıtma süspansiyon.
    4. 0.5 ila 0.0025 U / ul (1/200 seyreltme nihai konsantrasyonu elde etmek için 70 uL mikrokok nükleaz (MNase) ekleyinU / ul stok) ve karıştırın.
    5. 37 ° C'de tam olarak 12 dakika inkübe edin. her 4 dakikada bir karıştırın.
    6. Hemen buz üzerinde reaksiyon yerleştirin.
    7. , MNase etkinliğini durdurmak 4 mM nihai bir konsantrasyona kadar, 0.5 M EDTA pH 8.0 (1/125 seyreltme) 112 ul ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
    8. Sonikasyon iki sonikasyon arasında yüksek genlikte 1 dakika için 5 kez, 1 dakika boyunca (toplam 10 dakika) bir ara verir.
    9. 85.000 x g'de 30 dakika 4 ° C ultrasantrifüjdeki.
    10. süpernatant (nucleosome zenginleştirilmiş fraksiyon, NE, ≈ 12 ml) toplayın.
    11. sıvı nitrojen içinde 50 ul bir kısım dondurun. ekstresinin kalanını kullanarak, 2 "Protein kompleksi saflaştırma" adıma geçin.
      Not: kısım aşama 5.1.1 içinde bir giriş kontrol olarak kullanılmak üzere.

2. Protein Kompleksi saflaştırma

Not: Her bir hücre hattı (HeLa-S3 Bayrak-HA-myod ve kontrol, Hel Paralel özleri de devam edina-S3 Bayrak-HA).

  1. FLAG- bazlı saflaştırma
    1. Ön yıkama Bayrak reçine. Her deneysel nokta (her hücre hattı için GD ve KD kesirler) için (ticari% 50 stoktan) Bayrak reçine 600 ul kullanın.
    2. 15 ml tüp içine Aktarım reçinesi, 1.000 x g'de 2 dakika boyunca soğuk Tegn adlı (Tablo 3), santrifüj 13 ml tekrar süspansiyon ve supernatant çıkarın. 5 kez tekrarlayın. Tegn adlı eşit hacimde (her deneysel noktası için 300 ul) içine son yıkama tekrar süspansiyon Bayrak reçine sonra.
    3. Her bir deney noktası için, 600 yıkanmış Bayrak reçine ul ve karşılık gelen protein ekstreleri (26 mi SE fraksiyonları 12 mi NE için 15 ml'lik bir tüp içinde ve 50 ml tüp içinde, sırası ile) karıştırılır. 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde gece boyunca inkübe edin.
    4. 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika süreyle santrifüj, bir kenara süpernatant koymak ve arıtma verimi testi (2.2) sonucu kadar 4 ° C'de tutun.
    5. SE numuneler için, Bayrak reçine tekrar süspansiyon15 ml'lik bir tüpe transfer Tegn adlı 4 ml. Bu adımı 3 kez tekrarlayın, aynı 15 ml tüp transfer her zaman boncuk kaybetmemek için. 1000 xg ve 4 ° C ve süpernatant kaldırmak Santrifüj 2 dak.
    6. Yıkama Flag Reçine Tegn adlı 13 ml kullanılarak 1000 x g ve 4 ° C'de 2 dakika santrifüj 15 ml bir tüp içinde 7 kez.
    7. 1.5 ml son 1 ml Tegn adlı de yıkama, tekrar süspansiyon ve transfer sonrası tüp düşük bağlayıcı. 1000 xg ve 4 ° C ve süpernatant kaldırmak Santrifüj 2 dak.
    8. Her bir deney noktası için pH'sı 7.8 olan, 4 mg / ml'de Bayrak peptid çözeltisinin 200 ul süspanse edin. boncuk ve peptid karıştırın. Tegn adlı tampon 200 ul ilave edin ve en az 4 saat ya da bağlı proteinler elüte etmek için gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    9. 4 ° C'de 1,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj ve reçine ve süpernatan (Bayrak eluat) 2 ml'lik bir tüp içine yerleştirildi boş döndürme kolonuna transfer.
    10. Santrifüj kolon, toplamak sol üzerinde 2 ml tüp süpernatant.
    11. sütununa Tegn adlı tamponu eklenerek Bayrak reçine toplayın ve her bir deney noktası için gece boyunca 4 ° C 'de Bayrak peptid solüsyonu, 200 ul (4 mg / ml) ile, ikinci Bayrak elüsyon geçin.
    12. İkinci elüsyon toplamak için 2.1.10 - Tekrar 2.1.9 adımları. Birinci ve ikinci eluatları birleştirin.
  2. Arıtma Etkinliğinin Testi
    Not: Adım 2.1.11 sırasında - 2.1.12, SDS-PAGE ve gümüş lekeleme (- 2,2,2 2.2.1) gerçekleştirmek.
    1. , Yıkama sıvılarından 15 ul alır 4x yükleme tamponu, 5 ul 10x ve indirgeyici madde 2 ul, 96 ° C'de 5 dakika boyunca kaynar ve SDS-poliakrilamit 4 çalıştırmak - Üreticinin talimatlarına göre% 12 jel.
    2. gümüş boyama kiti kullanılarak jel Leke (üreticinin talimatlarına uyun). Bayrak-HA-myod ve Bayrak-HA arasındaki protein desen belirgin farklılıklar sahte eluates Bayrak-HA myod özellikle bant varsa (50 kDa, Şekil 1A civarında), bir sonraki ste geçins.
  3. Hemagglutinin (HA) tabanlı Arıtma
    1. 15 ml tüp içine transfer Tegn adlı 13 ml yeniden süspanse edildi ve 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika santrifüj edilerek yıkama HA reçinesi. Tekrarlayın yıkama aşaması 5 kez. Tegn adlı tampon eşit hacimde son yıkama tekrar süspansiyon boncuk sonra.
      Not: hacim Flag-bazlı saflaştırma verimliliğine göre ayarlanması gerekir. Her bir deney noktası için ticari bir% 50 stok 300 ul başla.
    2. 1.5 ml düşük bir bağlanma tüp içine her bir deney noktası için HA reçine aktarın. Santrifüj 2 dakika, 4 ° C 'de 1000 xg'de, yıkama tamponu (Tablo 3) maksimum ortadan kaldırmak ve HA reçinesine Flag-bazlı saflaştırma elde edilen yıkama sıvıları ekleyin.
    3. 4 ° C'de dönen tekerlek üzerinde gece boyunca inkübe edin.
    4. 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika süreyle santrifüj, bir kenara süpernatant koymak ve arıtma verimi testi sonucunda kadar 4 ° C'de tutmak (2.3.12.).
    5. Yeniden, Tegn adlı 0.5 ml HA reçine askıya 1.5 ml tüp bağlama, yeni bir düşük transfer. 1000 xg ve 4 ° C'de boncuk ve santrifüj 2 dakika kaybetmemek için bir kez aynı 1.5 ml tüp ekleyerek tabanda tekrarlayın. süpernatantı.
    6. (Kaybetme boncuk kaçının) süpernatant Tegn adlı 1 mi, her zaman kullanılarak 1000 x g'de 2 dakika ve 4 ° C'de santrifüj ve kaldırarak boncuk 8 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 0.5 ml tüpler içinde boncuk aktarın.
    7. Mümkün olduğunca fazla süpernatantı. bağlı proteinler elüt edilmesi için boncuk pH 7.8 HA serbest peptid solüsyonu (4 mg / ml) 100 ul ekle. 4 ° C'de gece boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
      Not: HA-peptid miktarı kompleksleri çokluğuna bağlı olarak ayarlanması gerekmektedir.
    8. 4 ° C'de 1,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj ve 2 ml'lik bir tüp yerleştirilir boş döndürme kolonuna reçine ve süpernatan (HA eluat) aktarın.
    9. 2 ml tüp sol-over süpernatant toplamak için sütun santrifüjleyin.
    10. Her bir deney noktası için HA peptit 100 | il (4 mg / ml) ile, ikinci bir elüsyon gerçekleştirin. 4 ° C'de gece boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Adımı tekrarlayın 2.3.8 - 2.3.9 ikinci elüsyon toplamak için.
    11. Birinci ve ikinci eluatları birleştirin.
    12. SDS-PAGE ve gümüş boyama ile test arıtma verimi (adım 2.2.) (Şekil 1A).
    13. üreticinin talimatlarına göre 10 kDa kesme (nominal moleküler ağırlık limiti, NMWL) santrifüj filtre üniteleri kullanılarak 30 ul HA eluat konsantre edilir.
    14. 22.5 (3/4) ve 7.5 (1/4) ul: ikiye konsantre örnekleri bölün. Ek bileşen -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza örnekleri 1/4 dondurma. Adım 3 3/4 bölümünü kullanın.
      Not: 1/4 Dondurulmuş kısmı western blot ile kütle spektrometresi sonuçları teyit kullanılacak olan (adım 5.1).

3. Kütle Spektrometresi Analizi

Not: Aşağıdaki adımlar analizi gerçekleştirecek Kütle Spektrometre tesisi ile ele alınmalıdır.

  1. 4x yükleme tamponu 7.5 ul ve 10x indirgeyici madde 3.3 ul numune 3/4 (22.5 ul) Ek 96 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatılır.
  2. % 12 jel - Bir SDS-poliakrilamit 4 Numuneleri. 150 V sabit 5 dakika süreyle çalıştırın jel tüm proteinler ayrılık olmadan jel girmesine izin vermek için.
  3. su ile yıkayın jel; Daha sonra ultra temiz su sabit jele 5 kez yıkayın fiksatif solüsyonu (% 10 asetik asit,% 50 metanol,% 40 ultra temiz su) ile 30 dakika - 20 sabitleyin.
  4. 1.5 ml bir tüp içinde 1 ml su içinde protein, mağaza ihtiva eden bantlar kesin ve kütle spektrometrisi imkan gönder.

4. Veri Analizi

Not: Bu analiz için genel bir yol göstericidir. Kesin adımlar MS tesis tarafından verilen verilerin belirli moduna bağlı olacaktıranaliz gerçekleştirmek için kullanılan (örneğin, 21,22).

  1. Negatif kontrol hazırlık karşılık elde edilen liste ile "MyoD" elüsyonların tanımlanan proteinlerin listesini karşılaştırın. analizden her iki listede bulunan proteinleri hariç.
  2. Kalan listeden belirlenen peptidler ≤2 toplam sayıda proteinleri çıkarın.
  3. Erişim fonksiyonel açıklama ve DAVID Biyoinformatik Kaynakları kullanarak proteinlerin elde edilen listenin fonksiyonel sınıflandırma (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) ve proteinlerin 23,24 listesini sınıflandırır.
  4. (İsteğe bağlı) negatif DNA 25 ücret bağlanma güçlü tesadüfi olmayan nükleer proteinler ücret listesi "hitchhikers", kaldır. Bunlar hücre iskeleti, sitoplazmik, mitokondrial membran ve reseptör proteinler içerir (Protein katlanması, Tablo 1 Sitoiskelet ve Muhtelif grup proteinleri ve 2).
  5. Her fraksiyonun (Şekil 2) için spesifik ortak proteinleri ve proteinleri tespit etmek GD ve KD fraksiyonlardan MyoD interactors elde listeleri karşılaştırmak.

Western Blot ile tanımlanır interactors 5. Onay

  1. HeLa-S3 Bayrak-HA-myod ve HeLa-S3 Bayrağı-HA Onay
    1. Çözülme Eluat numuneler buz üzerinde adım 2.3.14 (7.5 ul) de elde edilmiştir. Tegn adlı tamponu 12 ul 4x yükleme tamponu 10 ul ve indirgeme maddesi 10x 3 ul ekle. 96 ° C de 5 dakika süreyle kaynatılır örnekleri.
    2. batı blot giriş örnekleri hazırlayın.
      1. adımlar 1.3.9 ve 1.4.11 gelen hacimde çözülme ve BCA kiti (üreticinin talimatlarına uyun) kullanılarak, örneğin, protein konsantrasyonu ölçmek.
      2. şerit başına proteinin 15 ug kullanın. ekstresinin uygun miktarda ölçün ve Tegn adlı tamponu ile 15 ul örnek sesini ayarlayın.
      3. 5 ul 4x yükleme tamponu ekleyin ve1.5 ul 10 x indirgeme maddesi. 96 ° C de 5 dakika süreyle kaynatılır örnekleri.
    3. Eluat numunelerin 15 ul kullanarak (MS analizi sırasında tespit edilen iş ortağı aday için spesifik) ilgi antikorları ile bir western blot analizi yapın. Endojen protein seviyeleri (Şekil 3A) bir kontrol olarak, giriş özleri kullanın.
  2. İlgili Hücresel Sistemde Onay
    1. C2C12 fare miyoblastların toplam nükleer özü hazırlanması.
      1. Nemli bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde 15% fetal buzağı serumu ile takviye edilmiş DMEM ortamında, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin içinde C2C12 fare miyoblastlar büyütün. Asla proliferatif devlet hücreleri korumak için% 80 hücre izdiham aşmaktadır.
      2. immüno bir alanına (bir antikor gibi) için (PPI) C2C12 en az iki 150 mm tabaklar büyütün. , Orta aspire 10 ml PBS ile iki kez yıkama hücreleri.
      3. hücreleri kazıyın ve 15 ml'lik bir tüp içine toplar. Ce4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de ntrifuge. Süpernatantı atın.
      4. Hücre topağı (= V hücresi) hacmini belirleyin. Yavaşça sitoplazmik membran (Tablo 3) bozmaya hipotonik tampon B 3 hacim V hücrede pelletini.
      5. % 10, 0.44 x D hücre hacmi ekleme NP-40,% 1 nihai konsantrasyona ulaşmak için (hac / hac). Yavaşça karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
      6. Çekirdek bütünlüğünü korumak için SR (Tablo 3) 0.89 x V hücre hacmi ekleyin. Yavaşça çekirdekleri pelet 2,000 xg'de 5 dakika boyunca bir süspansiyon ve santrifüj homojenize etmek içi tüpü birkaç kez ters çevirin.
      7. süpernatant (sitozolik fraksiyonu) sökün. Çekirdek pelet (= V MBK) hacmini belirleyin. Sakaroz tampon bir hacim V MBK içinde süspanse çekirdekler pelet.
      8. Yüksek tuzlu tampon vorteks bir hacım V MBK ile iyice karıştırılarak 300 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için ise damla damla eklemeNaCI ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir. her 5 dakikada karıştırılır.
      9. Sükroz tamponun bir hacim V Nük ekleyin ve CaCl2 (nihai konsantrasyon 1 mM) (150 mM NaCI konsantrasyonunu azaltmak için). Karıştırın.
      10. Ön ısıtma karışım 37 ° C'de 1 dakika süre ile, konsantrasyon 0.0025 U / ul (0.5 U / ul stok 1/200) nihai için mikrokok nükleaz ekleyin. Karıştırın.
      11. 37 ° C'de tam olarak 12 dakika inkübe edin. her 3 dakikada karıştırın.
      12. Hemen buz üzerinde reaksiyon yerleştirin ve MNase etkinliğini durdurmak için EDTA (nihai konsantrasyon, 4 mM) ilave edin. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
      13. Sonikasyon yüksek genlikli 0.5 dakika her biri için 5 kez. İki sonikasyon arasında, 0.5 dakika (toplam 5 dakika) bir ara verir.
      14. 85.000 x g'de 30 dakika ve 4 ° C'de için ultra-santrifüj. süpernatant (toplam nukleer extract) toplayın.
      15. (Üreticinin talimatlarına uyun) BCA kiti kullanılarak, örneğin, toplam nükleer özü protein konsantrasyonu ölçmek ve immediyat devamely 5.2.2 adıma.
    2. Endojen MyoD imüno (IP).
      1. Özü açık-öncesi her IP noktası için protein G agaroz boncuk 10 ul yıkayın.
        1. 1.800 x g'de 2 dakika süre ile, soğuk Tegn adlı, santrifüj 1.4 ml 1.5 ml tüp, tekrar süspansiyon haline protein G agaroz boncuklar gerekli hacim transferi ve supernatant çıkarın. 3 kez tekrarlayın.
      2. Toplam nükleer ekstre uygun miktarda önceden yıkanmış protein G agaroz boncuklar karıştırın. IP noktası başına toplam nükleer ekstre protein 500 mikrogram kullanın.
      3. özleri pre-temizlemek için 2 saat boyunca 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
      4. 4 ° C'de 1,800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. süpernatant tutun.
      5. 1.5 ml düşük bağlanma tüplerde 500 ug önceden temizlenmiş toplam nükleer özleri ile tavşan IgG 5 MyoD Ab ug veya 5 ug karıştırın. Tegn adlı 1 ml tampon kadar ekleyin. gece boyunca 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
        Not: f gerçekleştirAdım 5.2.2.3 sırasında adımları ollowing.
      6. IP noktası başına ön yıkama 7,5 ul protein A / G stok boncuk çözüm.
        1. 2 dakika boyunca 4 ° C'de 1800 x g'de santrifüj Tegn adlı 1 ml, 1.5 ml tüp içine yeniden süspanse boncuk tanelerin gerekli hacmi aktarın. süpernatantı. 3 kez tekrarlayın.
      7. Gece boyunca 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde çözeltisi (Tablo 3) ve inkübe bloke 1.5 ml içinde süspanse protein A / G boncuklar.
      8. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 xg'de Abs (aşama 5.2.2.5) ile inkübe Santrifüj toplam çekirdek ekstreleri. süpernatant tutun.
      9. Santrifüj, 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1800 x g'de protein A / G reçinesi (adım 5.2.2.7) bloke etti. Tegn adlı tamponu 1 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon atın. Yeniden santrifüj 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1800 x g'de bloklama tamponu yıkayın.
      10. Süspanse bloke protein A / G 7.5 ul Blo elde etmek için yeni bir düşük protein-bağlayıcı bir tüp içine Tegn adlı tamponu ve kısım 1 ml reçineIP noktası başına cked protein A / G reçinesi. 2 dakika boyunca 4 ° C'de 1800 x g'de santrifüj ve çok süpernatan mümkün çıkarın.
      11. Abs ile kuluçkaya toplam nükleer özleri ekleyin (ya da kontrol IgG) A / G reçine. Karıştırın ve dönen bir tekerlek üzerinde, oda sıcaklığında (rt) 2 saat boyunca inkübe edilir.
      12. Santrifüj süspansiyon 2 dakika boyunca oda sıcaklığında 1800 x g. Yeni düşük bağlanma tüplere yıkama tamponu ve transfer süspansiyon 1 ml süpernatant, tekrar süspansiyon atın. 5 dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde, oda sıcaklığında inkübe edin.
      13. Yıkama tamponu 1 ml 2 dakika boyunca oda sıcaklığında 1800 x g'de, tekrar süspansiyon santrifüjleyin süspansiyonu ve 5 dakika için bir döner tekerlek üzerine, oda sıcaklığında inkübe edilir. 4 kez tekrarlayın. yeni bir düşük bağlayıcı tüp son yıkama transferi için.
      14. yüzer maksimum çıkarın. Yıkama tamponu 7 ul 4x yükleme tamponu 7 ul boncuk indirgeme maddesi 10x 3 ul ekle karıştırın ve 96 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatılır.
      15. Int antikorlar ile Western blot analizini gerçekleştirmekerest (immün için ortak aday için özel protein çöktürülmüş). Endojen protein seviyeleri (Şekil 3B), bir kontrol olarak, giriş özler,% 1 (5 ug) kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD etkinliğinin düzenlenmesini anlamak için, kütle spektrometrisi (MS) ile ve ardından MyoD bir çift etiketli formda imüno göre, biyokimyasal saflaştırma ile MyoD komplekslerinin ayrıntılı karakterizasyon üstlenmiştir. Bayrak-HA-etiketli myod ve Bayrak-HA izinleri ifade eden bir kontrol hücre hattı ifade HeLa-S3 hücre hattının kullanılması Bayrağı-HA-myod çift-afinite saflaştırma gerçekleştirerek MyoD kompleksi arındırmak için yeterli malzeme elde etmek için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sunulan yöntem, bir transkripsiyon faktörü, myod ortaklarından ayrıntılı tanımlanmasına izin verir. Bu MyoD kaynaklı farklılaşması, yani HeLa-S3 hücreleri dirençli bir heterolog sistemde MyoD ortakları saptandı. Böylece, tanımı gereği, belirlenen MyoD ortakları yayg ifade edilmiştir. Bu genel sekansa özel kopyalama faktörleri, kromatin değiştirici enzimler, RNA işleme proteinleri kinazlar (Tablo 1 ve 2) içerir. HeLa-S3 hücreleri MyoD kaynaklı trans-farklılaşma dirençli olduğu için, MyoD...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ait-Si-Ali laboratuvarındaki çalışma, Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon) tarafından desteklenmiştir; Ulusal Kanser Enstitüsü (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot ve ''Ben Kimim?'' Mükemmeliyet Laboratuvarı #ANR-11- LABX-0071, Fransız Hükümeti tarafından #ANR-11-IDEX-0005-01 hibesi kapsamında ANR tarafından yürütülen "Geleceğe Yatırımlar" programı aracılığıyla finanse edilmiştir. EB, bir INCa hibesi ile desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hücre hatları< / güçlü >
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
< güçlü > Ekipman< / güçlü >
SpinnerCorning778531
Homojenizatör:   Dounce homojenizatör Wheaton432-1273 ve 432-1271
İplikçiler için çalkalama cihazıBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
HemositometreMarienfeld Superior 640610
Düşük bağlayıcı tüplerSorenson27210
Boş spin sütunuBio-Rad7326204
Reaktifler
SDS-poliakrilamid %4-12  jelYaşam teknolojileriNP0336BOX
4x yükleme tamponu Yaşam teknolojileriNP0007
10x indirgeyici ajanYaşam teknolojileriNP0004
Gümüş boyama kitiYaşam teknolojileriA8592
Santrifüj filtre üniteleri, 10KMillipore UFC501024
Protein G agaroz boncuklarıSigma-AldrichP4691
Protein A/G  ReçineThermo Scientific53132
Bayrak reçinesi (anti-Flag M2-agaroz afinite jeli)Sigma-AldrichA2220
HA reçinesi (monoklonal Anti-HA agaroz)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Bayraksız peptit (DYKDDDDK)Ansynth Service BVÖzel sentez50 mM'de 4 mg / ml'ye kadar yeniden askıya alın Tris-HCl, pH 7.8
HA serbest peptit (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVÖzel sentez50 mM'de 4 mg / ml'ye kadar yeniden süspansiyon Tris-HCl, pH 7.8
Bikinkoninik asit bazlı protein tahlil kiti: BCA kitiThermo Scientific23225
Proteaz inhibitörleriSigma-AldrichS8830
Luminol bazlı geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) HRP substratıYaşam teknolojileri34075
BSASigma-AldrichA9647
Kesilmiş somon sperm DNA'sı (somon testislerinden elde edilen deoksiribonükleik asit sodyum tuzu)Sigma-AldrichD1626
Spermin tetrahidroklorürSigma-AldrichS1141
SpermidinSigma-AldrichS0266
GliserolSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS çalışan tamponYaşam teknolojileriNP0001
DMEM (yüksek glikoz)Sigma-AldrichD0822Ön ısıtma  37 ° C'de; C kullanmadan önce
Tripsin-EDTA (% 0.05 fenol kırmızısıYaşam teknolojileri25300-054
SerumGE sağlık yaşam bilimleri PAA A15-102Her serum lotu önce hücreleriniz için test edilmelidir.
Penisilin ve Streptomisin Yaşam teknolojileri15140-122
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4Yaşamteknolojileri15250-061
Su (steril filtreli)Sigma-AldrichW3500
Antikorlar
sıçanlardan (12CA5)Roche11583816001
ŞikayetSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758Batı lekeleme için kullanmak için
MyoDSanta CruzSC-760İmmünopresipitasyon ve batı lekeleme için kullanmak için
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
TubulinSigma-AldrichT9026
AktinSigma-AldrichA5441
IgG FareSanta CruzSC-2025
IgG TavşanSanta CruzSC-2027
Keçi anti-sıçan -HRPSigma-AldrichA9037
Keçi anti-tavşan -HRPSigma-AldrichA6154 
Keçi anti-fare -HRPSigma-AldrichA4416

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270(2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858(2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MyoD InteractomeTandem Affinity PurificationMass SpectrometrySkeletal Muscle DifferentiationTranscription Factor PartnersCell FractionationFLAG Tag PurificationNuclear Extract AnalysisWestern Blot ValidationProtein Complex Isolation

Related Articles