Yöntem makalesi

Normal Farelerde% 70 hepatektomi sonrası Vasküler ve Parankimal Rejenerasyon görselleştirme

DOI:

10.3791/53935

⸱

13 Eylül 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 3Fraunhofer Institute for Medical Image Computing MEVIS, 4Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz gGmbH

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasküler rejenerasyonu görselleştirmek için kullanılan aletler, vasküler ağaçları kontrastlamak için yöntemler gerektirir. Bu film, vasküler ağaçların optimal kontrastını elde etmek için kullanılan hassas bir enjeksiyon tekniğini gösterdi ve elde edilen örneğin μCT ve histolojik seri kesitler kullanılarak ayrıntılı bir analizinden kaynaklanan potansiyel faydaları gösterdi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir modifiye silikon enjeksiyon prosedürü hepatik vasküler ağacın görüntülenmesi için kullanıldı. Bu prosedür, portal veya hepatik ven içine, bir 26 G kateter vasıtasıyla, bir silikon bileşiği, in vivo olarak enjekte oluşuyordu. Silikon enjeksiyonundan sonra, organlar eksplante ve ex-vivo mikro-BT (uCT) Tarama için hazırladı. silikon enjeksiyon işlemi teknik olarak zordur. Başarılı bir sonuç elde cerrah kapsamlı mikrocerrahi tecrübe gerektirir. Bu prosedürün zorluklardan biri silikon bileşiği için yeterli perfüzyon oranının belirlenmesini içerir. Silikon bileşiği için perfüzyon oranı ilgi damar sisteminin hemodinamik göre tarif edilmesi gerekmektedir. Uygunsuz perfüzyon oranı vasküler ağaçların tamamlanmamış bir perfüzyon, yapay dilatasyon ve kopması yol açabilir.

vasküler sistem 3D rekonstrüksiyon BT'de dayanıyordu ve kullanılarak elde edilmiştirBöyle HepaVision olarak klinik öncesi yazılımı. yeniden vasküler ağacın kalitesini doğrudan silikon perfüzyon kalitesi ile ilgilidir. Bu, toplam damar hacminin vasküler büyüme göstergesi sonra hesaplanan vasküler parametreler, vasküler rekonstrüksiyonlar göre hesaplanmıştır. uCT taramadan sonra numunenin sonraki histolojik çalışma-up için izin verilen silikon ile damar ağacı Zıt. numune seri kesit, histolojik analiz ve tüm slayt tarama tabi, ve bundan sonra histolojik görüntüleri dayalı damar ağaçların 3D rekonstrüksiyon için yapılabilir. Bu moleküler olayların saptanması ve damar ağacı ile ilgili olarak kendi dağıtım için ön koşuldur. Bu modifiye silikon enjeksiyon prosedürü de görselleştirmek ve diğer organlarda damar sistemlerini yeniden kullanılabilir. Bu teknik potansiyeli kapsamlı çeşitli hayvan a vasküler anatomi ve büyümeyi ilişkin çalışmalara uygulanmalıdırnd hastalık modelleri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karaciğer yenilenmesi sıkça, karaciğer ağırlık ve hacim artışı ölçerek hepatosit çoğalma hızı 16 değerlendirilerek belirlenir. Ancak, karaciğer rejenerasyonu parankimal rejenerasyonu değil, aynı zamanda vasküler yenilenmesi 6 indükleyici tesis edilir. Bu nedenle, vasküler büyüme daha da karaciğer rejenerasyonu ilerlemesinde rolü açısından araştırılmalıdır. hepatik vasküler sistemin görselleştirme vasküler rejenerasyon anlayışımızı ilerleyen için kritik öneme sahiptir. Çok sayıda dolaylı yöntemler hepatik vasküler rejenerasyon altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için geliştirilmiştir. Geleneksel olarak, sitokin tespiti (VEGF vasküler endotel büyüme faktörü) 14, kemokinler ve bunların reseptörleri (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 vasküler rejenerasyon çalışmak için dayanak noktası olmuştur. Ancak, damarsal kantitatif analizi ile birlikte bir 3D modeli kritik anatomik eklersinizbilgi hepatik parankimal ve vasküler rejenerasyon arasında önemli bir ilişki daha iyi anlamak için.

Vasküler ağaçları zıt gerektirir hepatik vasküler sistemi, görselleştirmek için, fareler doğrudan portal veya hepatik venöz damar ağaca radyoopak silikon kauçuk kontrast madde enjekte edildi. Silikon ve organ eksplantasyonunun Polimerizasyondan sonra karaciğer örnekleri BT tarayıcısı kullanarak uCT tarama tabi tutuldu. taramalar voksel görüntü temsilleri sonuçlandı silikon enjeksiyon 9 numune.

kalite kontrolü için, damar sistemi ilk olarak klinik öncesi yazılımı kullanarak 3D görüntülendi. Bölümleme yumuşak doku yoğunluğu ve kap yoğunluğu arasında bir eşik ayarı yapıldı. Ortaya çıkan damar maskesi yüzey render kullanılarak görüntülendi. Yazılım, aynı zamanda vascul iki parametre el belirlenmesi için izinar büyüme: maksimal damar uzunluğu ve yarıçapı.

Bir preklinik yazılım sonra 3D vasküler ağaçların yeniden yapılanma ve tedarik veya drenaj damar toprakları 13 sonraki hesaplanması için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu yazılım otomatik olarak bu zamanda toplam kenar uzunluğu veya toplam sıvı hacmi olarak bilinen tüm görünür vasküler yapıların toplam uzunluğunun damar büyüme belirli parametreleri belirlenmiştir.

Silikon perfüzyon işlemi naif farelerde ve% 70 hepatektomiden (PH) uygulanan farelerde gerçekleştirilmiştir. Karaciğerleri Anılan görselleştirme ve miktar tekniği kullanılarak damar ve parankimal karaciğer rejenerasyonu analiz etmek için rezeksiyonu sonrası farklı gözlem zaman noktalarında toplandı.

(1) optimum kontrast ve (2) potansiyel yarar elde edilen fr göstermek elde etmek için gerekli hassas enjeksiyon tekniği göstermek: Bu filmin ana hedefleri şunlardıruCT ve histolojik seri bölümleri kullanarak elde edilen numunenin om detaylı bir analiz. Bu filmi izledikten sonra, okuyucu belirli bir damar sistemi içine ve tekniğin yararlılığı ve uygulanabilirliği silikon bileşiği enjekte etmek için nasıl daha iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan denekleri Prosedürleri Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Almanya tarafından onaylanmıştır. Portal venöz sistem hepatik venöz sistemden ayrı olarak görüntülendi Çünkü, ayrı hayvanlar farklı vasküler ağaçlar için ihtiyaç vardı.

1. Reaktifler Hazırlık

  1. Heparin-tuzlu su çözeltisi
    1. 10 mi tuzlu su (5 U / ml) içine 0.1 ml heparin ekleyin.
  2. Silikon bileşik karışımı
    1. Bir 5 ml tüp içinde 2 mi MV-120 ekleyin. % 40 çözelti elde 3 mi OG seyreltici eklenerek PD-120 seyreltilir.

2. Portal Venöz Sistem Silikon Enjeksiyon

  1. laparotomi
    1. Anestezi indüksiyon odasında fare yerleştirin ve% 2 izofluran ve 0.3 L / dk oksijen ile uyuşturan.
    2. % 2 sürekli solunması ile bant kullanarak ameliyat masasında anestezi fare Fixoflurane ve 0.3 L / dk oksijen. fare ayak-tutam çekilme refleksi kontrol edin ve refleks devamsızlık ise çalışmaya başlayacaktır.
    3. deri tabakasının ve kas tabakası için elektrikli pıhtılaştırıcı için makas kullanarak karın üzerinde enine bir kesi yapmak. Pamuk ipuçlarını kullanarak sol tarafına bağırsakları dışarı taşımak ve tuzlu batırılmış gazlı bez ile bağırsakları kapsamaktadır.
  2. kateter ekleme
    1. Mikro forseps kullanarak mikroskop altında portal ven incelemek. onun çatallanma yaklaşık 1 mm mesafeden, ekstrahepatik portal ven altına bir 6-0 ipek dikiş yerleştirin ve daha sonra kullanılmak üzere gevşek kravat.
    2. 5 dakika boyunca sistemik heparin için penil ven (erkek) üzerinden hazırlanmış heparin tuzlu su çözeltisi ya da (kadın) inferior vena kava enjekte edilir.
    3. portal ven içine 26-gauge iğne ile (26 G) kateter takın ve bir kelepçe ile sabitleyin
  3. Heparin-tuzlu su çözeltisi ve silikon bileşik perfüzyon
    1. Yük heparin tuz Sol5 ml şırınga içinde Katkı ve perfüzyon aygıtı açın. Hava kabarcıklarını önlemek için heparin tuz çözeltisi ile tam kateter doldurun.
    2. katetere uzatma borusunu bağlayın ve sıkıca sabitleyin. / Dakika 0.4 ml'lik bir perfüzyon oranı ile heparin tuz perfüzyon başlatın.
    3. çift ​​kateter sabitleme ve dalak ven ve mezenterik ven kan akışını bloke etmek için ligate önceden yerleştirilmiş 6-0 ipek sütür. anestezi altında perfüzyon yoluyla, kanları tümüyle alınarak fare Euthanatize.
    4. nemli tutmak için tüm perfüzyon işlemi sırasında tuz kullanarak karaciğer durulayın.
    5. PD-120 tüpüne sertleştirme maddesi 0.1 ml ilave edilir. Silikon şırıngaya heparin tuzlu şırınga değiştirin.
    6. Kateter sistemi önceden doldurmak için ve portal damar sisteminin doldurmak için yaklaşık olarak 1 dakika boyunca 0.2 ml / dk'lık bir perfüzyon oranında silikon perfüzyon başlatın. yüzeyde damarlar mavi açtığınızda silikon perfüzyon durdurun.
  4. Örnekleme
    1. In-situ unt karaciğer tutmakIL silikon tamamen sonra yaklaşık 15 ila 30 dakika polimerize edilir. sağlam karaciğer tutmak için dikkatle karaciğer ve bitişik organlara bağlayan bağlar teşrih. karaciğer Eksplantasyona ve sabitleme için formalin koydu.

3. Karaciğer Venöz Sistem Silikon Enjeksiyon

  1. Adım 2.1 gerçekleştirilen şekilde laparotomi gerçekleştirin ve tam ameliyat alanını maruz kalmaktadır.
  2. kateter ekleme
    1. Mikro forseps kullanarak mikroskop altında portal ven incelemek. onun çatallanma yaklaşık 1 mm mesafeden, ekstrahepatik portal ven altına bir 6-0 ipek dikiş yerleştirin ve daha sonra kullanılmak üzere gevşek kravat.
    2. 5 dakika boyunca sistemik heparin için penil ven (erkek) üzerinden hazırlanmış heparin tuzlu su çözeltisi ya da (kadın) inferior vena kava enjekte edilir.
    3. portal ven içine iğne ile bir 26 G kateter (sonda 1) takın ve bir kelepçe ile sabitleyin. inferior vena kava içine iğne ile başka bir 26 G kateter (sonda 2) takın ve bir kelepçe ile sabitleyin.
    4. 6-0 sentetik, monofilament, emilmeyen polipropilen sütür kullanılarak (sol ve sağ renal venlerin dahil) inferior vena kava ve distal ucunun dalları bağlayan.
  3. Heparin-tuzlu su çözeltisi ve silikon bileşik perfüzyon
    1. 5 ml şırınga içinde heparin tuzlu su çözeltisi yükleyin ve perfüzyon aygıtı açın. Hava kabarcıklarını önlemek için heparin tuz çözeltisi ile tam olarak kateter 1 doldurun. kateter 1'e uzatma borusunu bağlayın ve sıkıca sabitleyin. / Dakika 0.4 ml'lik bir oranda heparin tuz perfüzyon başlatın.
    2. çift ​​kateter sabitleme ve dalak ven ve mezenterik ven kan akışını bloke etmek için ligate önceden yerleştirilmiş 6-0 ipek sütür. anestezi altında perfüzyon yoluyla, kanları tümüyle alınarak fare Euthanatize.
    3. nemli tutmak için tüm perfüzyon işlemi sırasında tuz kullanarak karaciğer durulayın. PD-120 tüpüne sertleştirme maddesi 0.1 ml ilave edilir. Değişim heparin tuzlu silikon şırınga ile şırınga.
    4. suprahepat bir kelepçe yerleştirinic inferior vena kava karaciğerin çıkışı engellemek için.
    5. 2 kateter ve rapor edildiği gibi objektif hepatik vasküler hacme ulaşmak için yaklaşık 2 dakika boyunca 0.2 ml / dk'lık bir perfüzyon oranında silikon perfüzyon başlatmak için uzatma borusu bağlayın. yüzeyde damarlar mavi açtığınızda silikon perfüzyon durdurun.
  4. Örnekleme
    1. karaciğere herhangi bir yaralanma kaçınarak karaciğer ligament teşrih. karaciğer Eksplantasyona ve sabitleme için formalin koydu.

4. Mikro-BT (uCT) Tarama

uCT kullanarak Eksplante karaciğer örneği taramak için, aşağıdaki adımlar gereklidir.

  1. sabitleme çözeltisi dışarı karaciğer örnek almak. uCT yatağa karaciğer yerleştirin. uCT içine karaciğer örneği ile uCT yatak koymak.
  2. Taramaya başlamadan önce Topogram kazanır. Küçük karaciğer örnek için bir subscan ve büyük numune için iki subscans kullanın.
  3. seçin81; yüksek çözünürlüklü BT protokolü (örneğin, HQD-6565-390-90). Bu protokol alt tarama başına 90 sn tarama süresi ile bir tam dönüşü sırasında 1032 x 1012 piksel 720 projeksiyonları kazanır. uCT taramayı başlatın.

5. Histolojik Seri Bölümler

  1. uCT taramadan sonra bir bütün olarak parafin karaciğer örneği gömün. 2.000 ila 2.500 bir seri bölüme sonuçlanan 4μm bölüme bütün parafin örnek kesin.
  2. Uygun boyama tekniği ile leke bölümleri gibi iskemik hasarın belirteci olarak proliferasyon markeri ve HMGB1 olarak Ki-67 gibi ilgi moleküler olayları görselleştirmek için. bilimsel soruya bakımından boyama sırasını belirleyin.
  3. lekeli bölümleri dijitalleşmeye için bütün slayt tarayıcı kullanın.
  4. (Zaten mümkün) damar ağacı (ler) 3D-rekonstrüksiyon gerçekleştirin ve damar ağacı (devam araştırma) göre moleküler olayların 3D-dağılımını görselleştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kalite Kriterleri

silikon enjeksiyon kalitesi işlemi sırasında çıplak gözle yargılanabilir. Karaciğer yüzeyinde küçük damarlar mavi bileşik ile yavaş yavaş doldurun. normal vasküler yapı karaciğer yüzeyinde gözlenmiştir ise, silikon kauçuk enjeksiyon kalitesi iyi. perfüzyon hacmi yetersiz olsaydı, karaciğer yüzeyinde küçük damarlar tamamen dolu değildi. organın yüzeyinde düzensiz mavi lekeler belirtildiği gibi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Silikon enjeksiyonu ve uCT tarayarak vasküler ağaç zıt anjiyojenik ilerlemesini 5,7,8,10 incelemek için sık sık tümör modellerinde ve nörolojik hastalık modellerinde girmiştir. silikon enjeksiyon metodolojisi gelişmeler görselleştirilmesi ve farelerde hepatektomiden sonra damar büyümesi miktarının belirlenmesi için, bu çalışma yapıldı.

İyi perfüzyon kalitesi elde etmek için dikkat gerektiren kritik adımlar vardır. Her şeyden önce, sistemik heparinizasyon yüksek karaciğer içinde ka...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Alman Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) tarafından sistem biyolojisi ağı "Virtual Liver" aracılığıyla fon sağlandığını, 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS) hibe numaralarını kabul ediyor. Yazarlar ayrıca teknik destek için Frank Schubert'e teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PERFUSOR® VIB.BRAUN87 222/0
Pipetus®-akkuHirschmann9907200
PipetlerGreiner606180
mikro makasGüzel Bilim Araçları (F· S· L)No. 14058-09
mikro serrefineGüzel Bilim Araçları (F & middot; S· L)No.18055-05
Mikro kelepçeler aplikatörGüzel Bilim Araçları (F & middot; S· L)No. 18057-14
Düz mikro forsepsGüzel Bilim Araçları (F & middot; S· L)No. 00632-11
Kavisli mikro forsepsGüzel Bilim Araçları (F & middot; S· L)No. 00649-11
iğne tutucuGüzel Bilim Araçları (F & middot; S· L)No. 12061-01
1 ml şırıngaB.Braun9161406V
5 ml şırıngaB.Braun4606051V
uzatma ve bağlantı hatlarıB.Braun425600030 cm, iç & oyulma; 1,2 mm
6-0 ipek (Perma-El Seide)Ethicon639H
6-0 proleneEthicon8711H
Mikrofil® OG seyrelticiAKIŞ TEKNOLOJİSİ, Inc
Microfil® MV - 120FLOW TECH, INCMV - 120 (mavi)
MV kürleme maddesiFLOW TECH, INC
Heparin 2500 IE/5 mlRotexmedicaETI3L318-15
SalineFresenius Kabi Deutschland GmbHE15117/D DE
Imalytics Preklinik yazılımDeneysel Moleküler Görüntüleme, RWTH Aachen Üniversitesi, Almanya
HepaVisionFraunhofer MEVIS, Bremen, Almanya
NanoZoomer 2.0-HT  Dijital slayt tarayıcıHamamatsu Electronic Press, Japonya C9600
Tomoskop İkilisi CT CT Imaging GmbH, Erlangen, AlmanyaTomoScope®   Sinerji

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685(2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Vascular RegenerationHepatectomy ModelSilicone InjectionMicroCT Scanning3D Vascular ReconstructionPortal Vein InjectionHepatic Vein PerfusionWhole Slide ScannerKi 67 MarkerHepaVision Software

İlgili makaleler