Yöntem makalesi

Murin Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon ve Kemik İliği İzolasyonu

DOI:

10.3791/53936

⸱

14 Nisan 2016

 ,  , 
1Department of Urology, Johns Hopkins University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, laboratuvar faresinden arka bacak uzun kemiklerinin (femurlar ve tibialar) diseksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, kemik iliğinin kemik iliği boşluğundan çıkarılması için santrifüjlemeyi kullanan, bu kemiklerden kemik iliği izolasyonu için hızlı bir teknik tarif ediyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik ve kemik iliğinin incelenmesi, temel kemik biyolojisi, immünoloji, hematoloji, kanser metastazı, biyomekanik ve kök hücre biyolojisi gibi birçok araştırma alanında kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, kemiğin sağlıklı ve patolojik durumlardaki önemine rağmen, kemik diseksiyonu ve kemik iliği izolasyonu konusunda uzmanlaşmış bilgi eksikliği nedeniyle büyük ölçüde az araştırılmış bir organdır. Fareler, kemik ve kemik iliği üzerindeki etkilerini incelemek için yaygın bir model organizmadır ve büyük deneysel kohortların işlenmesi için uzun kemik diseksiyonu ve kemik iliği izolasyonu için standartlaştırılmış ve etkili bir yöntem gerektirir. Femur ve tibianın çıkarılması için histomorfolojik analiz ve kuvvet testi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere aşağı akış uygulamaları için uygun olan basit bir diseksiyon prosedürünü tarif ediyoruz. Ek olarak, hücre sınıflandırması, birincil hücre kültürü veya DNA, RNA ve protein ekstraksiyonu için ideal olan, sınırlı işlem süresine sahip santrifüjleme yoluyla kemik iliğinin uzun kemiklerden izolasyonu için hızlı bir prosedürün ana hatlarını çiziyoruz. Protokol, deneysel hatayı sınırlamak için örneklerin hızlı bir şekilde işlenmesi için kolaylaştırılmıştır ve kullanıcıdan kullanıcıya değişkenliği en aza indirmek için standartlaştırılmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun kemikler ve kemik iliği hücreleri üzerine yapılan çalışmalar, kemik biyolojisi, kanser biyolojisi, immünoloji, hematoloji ve biyomekanik dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere sayısız araştırma disiplininin merkezinde yer alır. Kemik, kıkırdak ile birlikte iç organların yüklenmesine ve korunmasına karşı mekanik destek sağlamak için iskeleti oluşturan oldukça dinamik bir organdır. Ek olarak, kemiğin mineral bileşenleri, kritik sinyal molekülleri kalsiyum ve fosforun yanı sıra diğer faktörler için bir depolama havuzudur1. Son olarak, kemikler kemik iliğini barındırır ve metabolik olarak aktif kemik oluşturan osteoblastlar ve kemik emici osteoklastlarla birlikte, hematopoietik ve lenfoid hücre popülasyonlarının sürdürülmesi için gerekli kök hücre nişini sağlar.

Kemik ve kemik iliği birçok hastalıktan etkilenir ve sıklıkla kemik iliği disfonksiyonuna, şiddetli kemik ağrısına ve patolojik kırığa yol açar. Kemik, başta meme kanseri ve prostat kanseri olmak üzere birçok katı tümörde yaygın bir metastaz bölgesidir ve tümör hücreleri, kemik metastazı kısır döngüsünü başlatmak ve hematopoietik kök hücrelerin yerini almak için doğrudan kemik iliği nişine girer2,3. Miyelom ve lösemi dahil olmak üzere hematopoietik maligniteler, kemik iliği disfonksiyonunun yanı sıra sağlıklı kemik yeniden şekillenmesinin deregülasyonu ile karakterizedir1. Kötü huylu olmayan diğer iskelet bozuklukları da osteoartrit, osteoporoz, skolyoz ve raşitizm gibi aktif araştırma alanlarıdır. Aksi takdirde sağlıklı bir bireyde bile, bir kemikteki biyomekanik başarısızlık ağrılı bir kırığa yol açar. Bu bozuklukların tümü, morbidite ve mortaliteyi azaltmak için yeni önleyici tedbirler ve tedavi rejimleri belirlemek amacıyla aktif araştırma alanlarını temsil etmektedir.

Hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında kemik ve kemik iliğinin rollerinin bolluğunu araştırmak için, araştırmacıların büyük in vivo deneylerin hızlı bir şekilde işlenmesi için fare uzun kemiklerinin diseksiyonu için basit ve verimli bir standart yönteme sahip olmaları kritik öneme sahiptir. Burada özetlenen diseksiyon protokolü, diğerlerinin yanı sıra ex vivo görüntüleme, histoloji, histomorfometri ve kuvvet testi dahil olmak üzere tüm uzun kemik analizleri için uygundur. Benzer şekilde, yüksek kemik iliği hücresi geri kazanımı ve düşük kullanıcılar arası değişkenliğe sahip standartlaştırılmış bir kemik iliği izolasyon yöntemi, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) veya kantitatif PCR (qPCR) gibi deneysel analizlerin yanı sıra kemik iliği hücrelerinin birincil hücre kültürü gibi aşağı akış uygulamaları için önemlidir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen tavsiyeleri doğrultusunda Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon

  1. kurumsal kurallara uygun olarak fare Euthanize.
  2. Bir yatar pozisyonda fare yerleştirin ve ayak bileği ekleminin altında fare pençe yastıkları sayesinde dört bacağı iğneleyerek yapıştırın.
  3. iyice bacaklarını dousing,% 70 etanol ile fare püskürtün.
  4. Sadece kalça üzerinde, alt karın bölgesinde orta hatta sağa doğru küçük bir kesi yapmak.
  5. bacak aşağıya ve ayak bileği ekleminin geçmiş kesi uzatın.
  6. Cildi geri çekin ve kurulu 45 derecelik bir açıyla pimi yerleştirerek, femur ön tarafını ortaya çıkarmak ve bacak dışarı pin femur proksimal ucuna demirlemiş kuadriseps kas kesti.
  7. blad ilefemur arka tarafına karşı makas e uzak diz ekleminden hamstrings kesti.
  8. kurulu 45 derecelik bir açıyla pimi yerleştirerek, cilt ve femur arka tarafını ortaya çıkarmak ve bacak dışarı pin femur proksimal ucuna demirlemiş hamstring kasları geri çekin.
  9. forseps ile, sadece diz ekleminde üzerinde, femur distal ucunu tutun. femur kendi içine kesmek için dikkatli olmak, kalça ekleminin doğru femur şaft iki tarafında makas bıçakları rehberlik eder.
  10. hafif açarak makas ile gösterilen femur başı, ulaştıktan sonra, femur başı aşağıda kemik snap dikkatli olmak, femur yerinden femur başının üzerine doğrudan hareketli makas üst bıçak ile makas bükün.
  11. , Forseps ile femur şaft üstünü tutun asetabulumun ayırmak için uzak femur başı yumuşak doku kesti.
  12. dahil olmak üzere tüm bacak kemiği çekinfemur, yukarı ve vücuttan uzak diz, ve tibia, özenle bağ dokusu kesip atmak ve kas cilde bacak bağlamak.
  13. tibia yerinden bir büküm hareket makas kullanmak tekrar ayak bileği eklemini overextend ve.
  14. özen, tibia distal ucunu kavrama, tendonları sever yukarı ve vücuttan ve pin kurulu tibia çekmeye değil.
  15. dizden fare uzun kemik takılması kalan Bağ dokusu kesin.
  16. herhangi bir ek kas veya femur tibia ve bağlı bağ dokusu çıkarın.
  17. Kemik gerektiren herhangi bir uygulama bozulmamış (vb histoloji, histomorfometri, biyomekanik test.) Kalması için, (4-7 gibi), standart in-house protokolleri ile devam edin. kemik iliği izole etmek, 2. bölüme geçin.

2. Uzun Kemik Hazırlık Kemik İliği İzolasyon

  1. forseps kullanarak, patella uzak bir bakacak femur kavramaknd proksimal ucu (femur başı) aşağı.
  2. Diz eklemini overextend ve tibia yerinden ve femur bir büküm hareket makas kullanın.
  3. Birlikte femur ve tibia tutan herhangi bir bağ dokusu kesti.
  4. forseps kullanarak dönük ön tarafında proksimal ucunda (femoral baş ucu) aşağı femur kavramak.
  5. kondillerin femoral şaft makas yukarı Kılavuzu.
  6. Yavaşça kondilleri, patellanın kaldırmak için ileri ve geri makas döndürmek ve epifiz metafizi ortaya çıkarmak.
  7. herhangi bir ek kas veya forseps, makas, ve Kimwipes kullanarak femur bağlı bağ dokusu çıkarın.
  8. forseps kullanarak dönük ön tarafı ve distal ucu (ayak bileği sonu) aşağı kaval kavramak.
  9. tibia epifiz sağlam ise, kondillerin için tibia şaft kadar makas rehberlik.
  10. Yavaşça kondilleri kaldırmak için ileri ve geri makas döndürmek ve epifiz metaph maruzSalman kararı.
  11. herhangi bir ek kas veya forseps, makas, ve Kimwipes kullanarak tibia bağlı bağ dokusu çıkarın.

3. Kemik iliği İzolasyonu

  1. 0.5 ml mikrosantrifüj tüp altından geçerek 18 G iğne itin.
  2. tüpe (2 femur ve 2 tibia'daki maksimum) uzun kemikleri koyun, diz sonu down bitirmek ve kapağı kapatın.
  3. Yuva, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü.
  4. 15 saniye boyunca bir mikrosantrifüj içinde ≥10,000 xg'de iç içe geçmiş tüpler santrifüjleyin.
  5. Kemik iliği görsel muayene ile kemiklerin dışarı bükülmüş olduğunu doğrulayın. kemikler, beyaz görünmelidir ve büyük tüp büyük bir görsel pelet olmalıdır.
  6. kemiklerle 0.5 ml'lik ependorf tüp atın.
  7. Uygun çözelti içinde kemik iliği (örneğin, PBS, kültür ortamı, FACS tamponu) ve deneysel protokol (DNA RNA ya da protein izolasyon devam AskıyaFACS analizi veya birincil hücre kültürü).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol kemik dokusunun zarar minimum fare femur ve tibia hızlı diseksiyon için optimize edilmiştir. Ve histoloji (Şekil 1C) 4,7 - Bu teknik biyomekanik çalışmaları, histomorfometri (B Şekil 1 A) dahil olmak üzere alt analiz, bir dizi için uygundur. Örnek histomophometric micoCT 3D rekonstrüksiyonu (Şekil 1A - Oda) süngerimsi kemik ve kortikal kabuk hem trabeküler sayı, kalınlık ve boşluk da dahil olmak üzere, kemik histomorfometrisi için standart yapısal parametrelerin doğru sayılmasını sağlayan ileri sürmüştür olduğunu göstermektedir; kemik hacmi; diğer önlemler 8 arasında ve kortikal kalınlık. Temsilcisi histolojik bölüm, bir H & E lekeli formalin ile fikse ve dekalsifiye tibia (Şekil 1C) gösterir. Görüntü kalsifiye b hem bütünlüğünü göstermektediron ve histolojik analiz için hücresel kemik iliği.

kemik iliği izolasyon prosedürü, kemik iliği alanı sterilite koruyan kirlenmeyi azaltmak için düşük bir işleme sahiptir ve bu nedenle, kemik iliği verim kaybının azaltılması, uzun bir kemik kesimi gerektirmez. Bu kemik iliği 5 ve PCR analizleri akış sitometrisi dahil olmak üzere birçok alt uygulamalar için uygundur. 4,6 - Buna ek olarak, bu işlem osteoklastlar ve osteoblastlar (B Şekil 2A) gibi kemik iliği hücreleri, primer hücre kültürü için, kemik iliği ayırmak için kullanılabilir.

figure-results-1
(A) dış kortikal kabuk ve gösteren bir fare tibia Şekil 1. Histomorfolojik ve Fare Uzun Kemik histolojik Analizleri. Üç boyutlu MikroBT'lerin rekonstrüksiyon (B trong>) trabeküler kemik (Ölçek çubuğu = 0.5 mm). Bir sertliği alınmış ve kesitli tibia (4x) (C) histolojik H & E boyama. Görüntüler Katherine Weilbaecher Tıp, ABD Washington Üniversitesi nezaket. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Osteoklast ve osteoblastlar Ayrımında için Şekil 2. Primer Kemik İliği hücre kültürü. Osteoclastogenic medya (4x) 'de 7 günden sonra çok çekirdekli osteoklastlar için (A) TRAP boyaması. (B) osteoblast ve osteojenik medyada 21 gün sonra mineralizasyonu için alizarin kırmızı (kırmızı renk) leke Alkali fosfataz (mor renk). Katherine Weilbaecher görüntüleri nezaket Tıp, ABD Washington Üniversitesi.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare arka uzun kemiklerinin çıkarılması ve ardından kemik iliği izolasyonu için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, kemiklerin ve kemik iliğinin yüksek yapısal ve hücresel bütünlüğünü korur ve düşük kullanım süresine sahip olup, aşağı akış analizlerini etkileyebilecek kullanıcı kaynaklı kırık veya kemik skorlaması olasılığını en aza indirir. Ek olarak, kemik iliğini izole etmek için santrifüjleme yöntemi, kemik iliği boşluğunu veya kemik iliğini temizlemek için sıvıyı açığa çıkarmak için kemiğin kesilmesini gerektirmez, bu da potansiyel kontaminasyon noktalarını azaltır. Üstelik santrifüj tekniği, diğer yöntemlere göre daha düşük uygulama süresiyle nispeten yüksek verimlidir, dolayısıyla işlem süresini azaltır.

Yüksek varyasyon, yüksek fareden fareye fenotipik varyasyon nedeniyle in vivo fare çalışmalarının doğasında vardır. Pahalı ve emek yoğun fare çalışmalarının araştırma etkisini en üst düzeye çıkarmak için, teknik deneysel hatayı9,10 en aza indirmek çok önemlidir. Hayvan kurban etmesinden aşağı akış analizine veya doku fiksasyonuna kadar geçen süre, ince değişikliklerin üstesinden gelebilecek ve gruplar arasındaki büyük farklılıkları azaltabilecek deneysel varyasyonları ortaya çıkarır. Bu nedenle, doğru veri analizi için numunelerin hızlı işlenmesi şarttır. Burada açıklanan uzun kemik diseksiyonu ve kemik iliği izolasyon teknikleri, teknik varyasyonu azaltmak için hayvanların ve numunelerin hızlı işlenmesi için optimize edilmiştir.

Bu protokol, kemik dokusunun kendisinin araştırılması veya kemik iliği hücrelerinin sorgulanması dahil olmak üzere birçok araştırma alanına yaygın olarak uygulanabilir. Ek olarak, uzun kemik diseksiyonuna yönelik bu basit yaklaşım, ilgili alanlardaki araştırmacıların, aksi takdirde yeterince çalışılmamış patolojilerde kemik iliği disfonksiyonu hakkındaki bilgimizi genişletmek için kemik katkılarını doğrudan sorgulamalarını sağlayacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, K.J.P.'ye U54CA143803, CA163124, CA093900 ve CA143055 numaralı NCI hibeleri tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Weilbaecher laboratuvarının mevcut ve geçmiş üyelerine, özellikle Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla ve Hongju Deng'e ve Brady Üroloji Enstitüsü üyelerine, özellikle de Pienta laboratuvarı üyelerine el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Pano
Pimleri
% 70 Etanol
Diseksiyon makası 
Diseksiyon forseps
KimwipesKimberly-Clark34120
16 G iğne
1.5 ml Mikrosantrifüj tüpü
0.5 ml Mikrosantrifüj tüpü
Mikrosantrifüj

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
  2. Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
  3. Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
  4. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
  5. Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
  6. Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755(2010).
  7. Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
  8. Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
  9. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
  10. Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Santrif jleme ProtokolHistomorfometrik AnalizH cre K lt r Haz rlamaMikrocentrif j T pFemur Tibia kar mKemik li i HasadAlt Uygulamalar

İlgili makaleler