Yöntem makalesi

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

DOI:

10.3791/53961

⸱

22 Mayıs 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, GC-MS tarafından tespit edilmek üzere glikanların bileşen bağlarına özgü monosakkaritlere kimyasal olarak parçalanması yoluyla fraksiyonlanmamış biyoakışkanlardaki glikanların havuzlanmış bileşim profilini analiz etmek için tasarlanmış yeni bir aşağıdan yukarıya glikomik tekniğinin geliştirilmiş bir biçimini sunmaktadır. Potansiyel uygulamalar arasında kanser ve diğer glikan-afektif bozuklukların erken tespiti yer alır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikosiltransferazlar adı verilen enzimler tarafından şablon güdümlü olmayan bir süreçte sentezlenen glikanlar, çeşitli önemli hücre içi ve hücre dışı olaylarda anahtar oyunculardır. Başta kanser olmak üzere birçok patolojik durum, gen ekspresyonunu etkiler ve bu da glikozit hidrolaz ve glikosiltransferaz enzimlerinin nispi bolluğunu ve aktivite seviyelerini deregüle edebilir. Deregüle edilmiş glikosiltransferaz(lar)dan kaynaklanan benzersiz anormal bütün glikanlar, genellikle karmaşık biyosıvılar içinde eser miktarlarda bulunur, bu da bunların tespit edilmesini zorlaştırır ve bazen stokastik hale getirir. Bununla birlikte, uygun numune hazırlama ile, kütle spektrometrisinin en eski biçimlerinden biri (gaz kromatografisi-kütle spektrometresi, GC-MS), karmaşık biyoakışkanlarda bulunan dallanma noktası ve bağlantıya özgü monosakkaritlerin ("glikan düğümleri") koleksiyonunu rutin olarak tespit edebilir. Geleneksel yukarıdan aşağıya glikomik tekniklerin tamamlayıcısı olarak, burada tartışılan yaklaşım, bir numunedeki her bir bileşen glikan düğümünün tek bir bağımsız analitik sinyale toplanmasını ve yoğunlaştırılmasını içerir, bu da bir bütün olarak gliskorttaki değişiklikler hakkında ayrıntılı yapısal ve nicel bilgi sağlar ve potansiyel olarak deregüle edilmiş glikosiltransferazları ortaya çıkarır. Burada sağlanan permetilasyon ve müteakip sıvı/sıvı ekstraksiyon aşamalarında yapılan iyileştirmeler, permetillenmiş glikanların alkali sulu koşullara minimum düzeyde maruz kalmasını kolaylaştırarak tekrarlanabilirliği ve genel verimi artırır. Asetilasyon aşamasındaki modifikasyonlar, reaksiyonun derecesini ve toplam verimi daha da arttırır. Tekrarlanabilirliklerine rağmen, N-asetilhekzozamin (HexNAc) kısmen permetillenmiş alditol asetatların (PMAA'lar) genel verimlerinin, heksoz PMAA'lara göre beklenen teorik değerlerinden doğal olarak daha düşük olduğu gösterilmiştir. Her bir heksoz PMAA (veya HexNAc PMAA) için ekstrakte edilen iyon kromatogramı (XIC) altındaki alanın, tüm heksozlar (veya HexNAc'ler) için bu XIC alanlarının toplamına oranının hesaplanması, bir numunedeki tek tek glikan düğümlerinin nispi miktar tayinini kolaylaştıran yeni bir normalizasyon yöntemi sağlar. Şu anda mutlak tespit sınırları açısından kısıtlı olmasına rağmen, bu yöntem klinik biyosıvıların analizini hızlandırır ve geleneksel yukarıdan aşağıya glikomiklere tamamlayıcı bir yaklaşım olarak önemli bir umut vaat eder.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikolipidler, glikoproteinler, proteoglikanlar ve glikozaminoglikanlar topluca glukanlardır olarak bilinen karmaşık, heterojen karbonhidrat dört ana sınıfları oluşturmaktadır. Olarak plazma membranı, glikokaliksin ve hücre dışı matriks ve sıvıların her yerde ve integral parçaları, glukanlardır endositoz, hücre içi kaçakçılığı, hücre motilitesi, sinyal iletimi, moleküler tanıma, reseptör aktivasyonu, hücre yapışması, konak-patojen etkileşimi gibi çeşitli biyokimyasal süreçlerde katılmak hayatın neredeyse her alanında arası iletişim, immünosürveylansında ve immün yanıt inisiyasyon. 1 Present, glikan polimerler inşa glıkosıltransferazlarla olarak bilinen enzimler glikozit oluşturmak için (glıkanları yıkmak da glikozidazlar olarak da bilinir), hidrolaz, şeklini ile birlikte hareket, ve sonuçta glikan polimerler 2 kesinleşmiş üretirler. Her glıkosıltransferaz farklı glycoconjugates üzerinde çalışabilir olsa da, bir glıkosıltransferazgenel nükleofilik alıcılarının belirli bir kategori (örneğin, bir lipid, polipeptit, bir nükleik asit ya da giderek artan belirli bir aktif nukleotıt şeker donörü (örneğin, GDP-fukoz) bir monosakarit kısmını aktarmak bir nokta askı sistemine bağlanan ve anomeri özgü glikosidik bağı yanma oligosakkarit). Protein (özellikle membran ve salgı proteinleri) arasında% 50'den fazla translasyon sonrası glikosilasyon ile modifiye olduğu tahmin edilmiştir 3 Rudimentary kombinasyon hesaplamalar glikosilasyon ile glikoproteinlerin tanınan ölçüde değişkenlik, çok yönlülük ve özgüllük için takdir sağlar.; bir polipeptit alt-tabaka, sadece 10 glikosilasyon sitesi vardır ve her bir sitenin yalnızca 3 farklı azalan monosakkarit'in uçlarının 1 ile glikosidik bağ oluşturabilen, örneğin, daha sonra, teorik olarak, son glikoprotein 3 10 = 59.049 farklı kimliklerinin varsayabiliriz. glikoproteinler olarak, glikozidik bağları genellikle yan zincir nitrojen ile o formuAsn-X-Ser f asparagin artıkları / Thr K O 4 -glycans vermek üzere serin ve treonin kökleri 2 ve yan zincir hidroksilleri -glycans vermek üzere (X, prolin dışında herhangi bir amino asit olabilir). Birkaç istisna dışında, glıkosıltransferaz sıkı donör, alıcı, ve bağlantı özelliği göstermeyen, çünkü bir hücrenin glycome kompozisyonu (yani, glikosilasyon ürünlerinin tamamlayıcısı) eşsiz ve sınırlıdır. 5 Önemli ve bol kan plazma glikoproteinler bir alt sonucu olarak anormal glikosilasyonu acı anormal glikosiltransferaz ve faaliyetinin nedeniyle birçok patolojik koşullarda, özellikle de, kanser ve inflamatuar hastalıklar. 6-24

Temelde epigenetik faktörler nedeniyle, glycome memeli genomunun yaklaşık% 1'i oluşumu, modifikasyon kodlar iken. Anlamlı 25,26 proteomu ve transcriptome daha, çeşitli dinamik ve karmaşık veGlikanların takımı olmayan bir şablon odaklı şekilde-belirgin bir kontrast 27 glikosilasyon ilerler polipeptidi ve nükleik asit biyosentezi için. Glikozilasyon enzimler ve besin ve öncü durumuna gibi çevresel faktörlerin göreceli miktarı ve etkinliği arasındaki etkileşim nihayetinde glikosilasyon doğasını, hızını ve kapsamını belirler. 5,28 Embriyo (örneğin, kararlılık ve farklılaşma), hücresel aktivasyonu ve ilerlemesi yoluyla hücre döngüsü etkisi gen ifadesi (yani, transkripsiyon ve çeviri) ve kimin aktivite hücrenin glikan profilinin hemen yukarı belirleyicisi olan mevcut glikoziltransferazların kimliğini ve miktarını değiştirebilir. (Bazıları) proliferatif olduğundan, yapıştırıcı ve kanserli hücrelerin bir invaziv sıradan embriyojenik hücreler, glıkan biyosentetik yollar (örneğin, ön-madde birikimi, deregüle sentezleme, aberran belirli değişikliklerin benzemektedir. t modifikasyonu, yapısal kesme veya yeni oluşumu) glikozilasyon açıkça glikozilasyon sadece birkaç değişiklikler karsinogenezini ve metastaz etkinleştirebilirsiniz, oldukça karmaşık olmasına rağmen tümör oluşumu, ilerlemesi, göç ve işgali 29 çeşitli aşamalarında gösterdiği gibi evrensel kanser biyobelirteçlerini hizmet; görünüşe göre, bazı "anormal" glikozilasyon ürünleri gerçekten bağışıklık tanıma kaçmasına ve daralan damar içi ve metastatik ortamlarda göç taleplerini hayatta kalmalarını sağlayarak kanserli hücreleri yarar. 28,30,31 şaşırtıcı değil, deneyler değişmiş kalıplarını bozan veya engelleyen ortaya koymuştur gen ekspresyonu ve anormal glikan oluşumu tümörogenez durdurabilir. 29 Bununla birlikte, bir biyo-sıvı numune (örneğin, idrar, tükürük, kan plazma veya serum) 'de tespit edilen anormal glıkanlar doğrudan kanser göstergeleri (veya başka bir hastalık), daha çok alt olmayabilir ince ama önemli sonuçlarıBağışıklık sistemi veya öngörülemeyen bir organında bir zararlı durumun ölçülebilir yansımaları değişiklikler. 32

Onlar glycome hakkında evrensel bilgi, pek çok moleküler etkileşim tabanlı Glikomik teknikleri (örneğin, lektin / antikor dizileri ve metabolik / kovalent etiketleme) sağlasa da tüm glıkan yapıların tespiti bağlıdır ve bireysel glukanlardır hakkında detaylı yapısal bilgi vermemektedir. belirgin aksine, kütle spektrometresi (MS) tanımlanmasına yardımcı ve bireysel glikan yapıları ölçmek ve polipeptit çekirdeklerine eki siteleri gibi yapısal bilgileri açığa çıkartabilir. Deregüle ifade veya sadece bir glıkosıltransferaz aktivitesi çok glikosilasyon yolakları zararlı moleküler olaylar kaskadını başlatabilir. Her glıkosıltransferaz birden fazla glycoconjugate alt tabaka üzerinde ve farklı büyüyen glikan polimerler arasında çalışabilir, çünkü deregüle biyosentetik kaskadlar dispropor verimarası olarak tek glikan ürünün miktarda ancak hücre içi veya dışı sıvılarda anormal glukanlardır birkaç heterojen sınıflar arttı. 33 Ancak, bu tür eşsiz anormal glukanlardır bazen kanser nedeniyle veya diğer glıkan-duygusal patolojiler için biyomarkerların olarak pratik olarak kabul edilir, büyük havuz ile karşılaştırıldığında ve glikanlar iyi düzenlenmiş, bu anormal glukanlardır olabilir sık ​​sık hatta kütle spektrometresi gibi son derece hassas tekniklerle saptanamaz kalır çok küçük bir bölümünü temsil etmektedir. Örneğin, hücre içi ve hücre dışı vücut sıvılarında (büyüklük sekiz emir açıklıklı) geniş protein konsantrasyonu spektrum daha bol türler tarafından maskelenir kıt glikoproteinler tespiti önleyebilirsiniz. 32 Dahası, glıkosıltransferaz aktivitesinin belirlenmesinde pratik bir hayli kalır ve birçok glıkosıltransferaz klinik Biosıvılar içinde bulunmayan ya da ex vivo inaktif hale çünkü teorik meydan. consisten zorluğuna rağmently tespit ve eşsiz bütün glukanlardır ultra dakika miktarlarda ölçülmesi, kütle spektrometresi uygulayıcıları klinik belirteç olarak bozulmamış glikanları istihdam yönünde büyük atılımlar yaptık. Biz son zamanlarda GC-MS kullanılarak, birlikte her glıkan ve birçok teklik vermek tüm kurucu şube noktası ve bağlantı özgü monosakkaritler ( "glikan düğümler") tespitini kolaylaştırır, bozulmamış glukanlardır analizi için tamamlayıcı bir yaklaşım geliştirdik olgular doğrudan kusurlu glıkosıltransferaz (lar) göreli etkinliğini ölçmek moleküler temsilciler hizmet vermektedir.

İlk 1958 glıkan analizi doğrudan uygulama rapor için, gaz kromatografisi (GC), 34 başına metillenmiş mono- ve disakaritler analiz bunların anomericity ve mutlak konfigürasyonunu belirleyebilir ve daha sonra kütle spektrometrik analizi için ayırmak için güçlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. 35 1984 ve 2007, Ciucanu ve meslektaşları arasındatanıtılan ve 2005 ve 2008 yılları arasında su ve kloroform. 35,36 kullanılarak permetilatlı glukanlardır sıvı / sıvı ekstraksiyon ardından sodyum hidroksit ve iyodometan kullanılan bir katı-faz glikan permethylation tekniği, rafine, Kang ve arkadaşları, bir zaman tasarrufu falso entegre permethylation adımına -Kolon yaklaşım. 2008 37,38, Goetz araştırma grubu karşılaştırarak ihtimali olan ve olmayan ayırt matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisi kullanılarak glıkan-profil yöntemi permethylation kantitatif bir katı-faz icat -invasive meme kanseri hücreleri 39 daha sonra, 2009 yılında, Goetz ekibi kombine enzimatik ve kimyasal salınım teknikleri yüksek alkali katı faz permethylation şemasında o -glycans bozulmamış glikoproteinler gelen ayırmak için 40 Goetz prosedürü eşzamanlı permethylation ve kimyasal salınımını kolaylaştırdı rağmen. o -glycans arasında, sadece önceden izole glikoproteinin uygulandıproteinler. Biz, 2013 yılında bu tekniği değiştirilmiş ve trifloroasetik asit eklenerek bütün bölünmemiş Biofluids ve homojenize doku örnekleri için uyarlanmış (TFA), hidroliz, indirgeme ve asetilleme adımlarını. Ayrıca, glikolipidler ve N'den glikanlar serbest 33 Bu ilave adım glikoproteinlerden glıkanları -bağlı dönüştürmek ayırt edici metilasyon-ve-asetilasyon desenler benzersiz GC-MS tarafından analiz kolaylaştırmak orijinal bozulmamış glikan polimer 41 (Şekil 2) kurucu glıkan düğümleri karakterize kısmen metillenmiş alditol asetatlar (PMAAs, Şekil 1), içine onları. 33 Sonuçta, bu prosedür, "göbek fukosilasyonu", "6-sialilasyon", "GIcNAc'nin" ve "p 1-6 dal" benzersiz glıkan özelliklerin doğrudan görece nicelenmesine dayanan kompleks biyo-sıvı tüm glıkanların bileşik portre üretir - her biri tek bir GC-MS kromatografisi yolu türetilenhic zirve. Bu makalede başka permethylation optimizasyonu, asetilasyonunu, izolasyon ve nispi ölçümü modunda gelişmeler ile birlikte temizlik aşamaları sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dikkat: Bu deneyde kullanılan maddelerinden biriyle cilt / göz temasından kaçının. maruziyet üzerine, su ile iyice etkilenmiş bölgeyi yıkayın ve derhal doktora başvurun.

1. Permethylation ve Glycan Ekstraksiyon

  1. Sütun Hazırlama
    1. Alınan numuneler tahlil için gibi birçok mikrofuge'ye spin kolon birimleri edinin. Kırmak ve plastik rezervuar tüp kapaklarını çıkarın. Her rezervuar tüp içinde bir mikrofuge'de küçük filtresi yerleştirin. Bir mikrofuge'de tüp rafa (mini filtreler içeren) bir araya mikrofuge'ye dönüş sütunları yerleştirin.
    2. bir sodyum hidroksit stoku (NaOH) boncukları (20-40 gözenekli) elde edilir. nem topaklanma, NaOH çalışan hisse senedi olarak sıcak porselen harcı neden olup olmadığını, bir küçük tartı tekne bazı NaOH aktarın veya. toz / NaOH veya ezilmiş NaOH boncuk öbekler kullanmaktan kaçının.
      Dikkat: NaOH güçlü bir toksin ve korozif temelidir. 15 dakika su ile yıkayın maruz deri / gözler. Thoroughly deneyi tamamladıktan sonra tezgah temizleyin.
    3. Küçük bir kaşık ya da spatula kullanılarak, (~ ağzına altında 5 mm) ilk dış eğim kadar NaOH ile mikrofuge'ye Mini filtreleri doldurmak için çalışan stoktan NaOH boncuk aktarın. / Pack NaOH boncuk yoğunlaşmasına tezgah üstünde dolu mikrofuge'de filtreleri dokunun.
      Not: Bu deney boyunca, higroskopik NaOH boncuklar fazla su adsorpsiyonu en aza indirmek NaOH kolonu ambalaj yüzeyi üzerinde herhangi bir ek sıvı seviyesi (örneğin, asetonitril, dimetil sülfoksit, analit çözelti) korumak ve hava ile doğrudan temas sınırlamak için.
    4. asetonitril (ACN) bir stok alın. Transferi ~ 350 ul her NaOH dolu mikrofuge'ye Mini filtre ACN. ACN altında kalmış NaOH tutun ve bir ipucu kıvrımsız jel yükleme pipet ile karıştırarak büyük hava kabarcıklarını çıkarmak.
      Dikkat: Asetonitri yanıcı tahriş edicidir.
    5. sütun Santrifüj
      1. simetrik bir santrifüj içinde mikrofuge'de sütunları düzenlemek; Gerekirse bir denge tüp kullanın. santrifüj içinde herhangi bir NaOH granülleri dökmekten kaçının. santrifüj kapağını kapatın.
      2. Santrifüj sütunlar ~ 15 sn 2,400 × g için (NaOH ve ACN içeren).
      3. santrifüj tamamlanmasının ardından, santrifüj mikrofuge'de sütunları kaldırmak ve bir tehlikeli atık kabına ACN atın. sağlam ambalaj NaOH sütunu tutun.
    6. Her bir NaOH dolu mikrofüj Mini filtreye ~ 350 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin. DMSO altında kalmış NaOH tutun ve bir pipet ile herhangi bir büyük hava kabarcıkları. Daha önce 2400 x g'de ~ 15 sn, santrifüj sütunlar açıklandığı gibi, bozulmamış ambalaj NaOH tutarken, ve DMSO atın.
      Dikkat: DMSO bir mutajen ve irritan ve kolayca deri yoluyla absorbe edilir.
    7. Spin filtresi dahil fişleri ile tüm mikrofüj Mini filtreleri takınkiti. Her NaOH dolu mikrofuge'ye Mini filtreye ul DMSO ~ 350 aktarın ve DMSO sonra NaOH ambalaj içindeki tüm bölgeleri ulaşır, böylece NaOH ambalaj hava kabarcıklarını çıkarmak için 200 ul pipet kullanın. ezme veya aşırı NaOH boncuk kazıma kaçının; NaOH tozu istenmemektedir. mümkün olduğunca çabuk bu adımı tamamlayın.
  2. Plazma Kalite Kontrol hazırlanması (QC) Örnek (ler)
    Not:     deneysel gruplar arasında tutarlı sonuçlar sağlar her parti analiz edilecek ilgi biyolojik maddenin büyük bir homojen kütle koleksiyonundan alınan bir numunenin en az bir kısım kullanmayı düşünün için. Kan plazma analiz, örneğin, her bir parti QC örnek (ler) olarak, kan plazması bir kütle toplama kısım (lar) kullanın. bilinmeyen numune ile aynı şekilde işlem QC örnekleri.
    1. Santrifüj ~ 10,000 x g'de 4 dakika için kalite kontrol plazma stok örneği. santrifüj sırasında, bazı yüksek yoğunluklu çökelti inci razı olabilire dip ve bazı düşük yoğunluklu çökelti plazma üst şamandıra olabilir. plazma çıkarma kısım (lar) hem de kaçının.
    2. Aşağıdaki "1.3) Numune Hazırlama" geçin. Plazma santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, bu adıma dönün.
    3. santrifüj QC plazma 9 ul çekin ve ek kapatma kapağı ile donatılmış bir şekilde etiketlenmiş 1.5 ml'lik polipropilen bir test tüpüne transfer (bundan sonra "1.5 ml plastik test tüpü" olarak anılacaktır). Her eş payın iyondan arındırılmış su, 1 ul ekle; arzu edildiği takdirde, iç standart (ler) için bir taşıyıcı madde olarak kullanmak.
    4. Bu plazma kontrol 270 ul DMSO ilave. Girdap komple bir erimenin oluşması sağlanmıştır.
  3. Örnek hazırlama
    1. Biyolojik (analit) numune sayısı kadar 1.5 ml plastik test tüpleri elde edilir.
    2. karşılık gelen 1.5 ml plastik test tüpüne her bir biyolojik (analit) örnek devri 9 ul. iyonu giderilmiş su ve 27 transferi 1 ulHer bir numune, bir tüpe 0 ul DMSO ilave edin.
    3. Şiddetle numuneler DMSO içinde tam olarak çözünmesini sağlamak için (aşağı örneğin, girdap ve / veya arka arkaya pipet ve benzeri) karıştırılır.
      Dikkat: Davlumbaz içinde aşağıdaki adımları uygulayın. Plastik belirli türleri çözebilen uçucu sıvı, aşağıdaki adımları, iyodometan (CH3 I) 'e, diklorometan (2 CI2 CH metilen klorür olarak da bilinir), ve kloroform (CHCI3, triklorometan) olan ikinci (örneğin, nitril eldiven) . solvent dirençli eldiven kullandığınızdan emin olun. Nedeniyle düşük viskoziteli ve yüksek buhar basıncına, bu reaktifler transferi sırasında bir pipet damlayabilir yapabilirsiniz. Alıcı kabına bitişik stok solüsyonu tutarak reaktif kaybı ve potansiyel maruziyeti en aza indirmek.
    4. Bir küçük, temiz tüpe iyodometan yeterli toplam hacmi aktarın. Her analit numunesi 105 ul iyodometan gerektirecektir. anoth içine Transferi ~ 500 ul diklorometantemiz tüp er. şırınga tıkanmasını önlemek için, hemen iodometan transferinden sonra diklorometan ile şırınga durulayın.
      Dikkat: İyodometan, ışığa uçucu ve merkezi sinir sistemine zarar veya solunması ya da yutulması halinde ölüme neden güçlü toksin yetenekli. Diklorometan potansiyel kanserojen, üreme mutajen ve birkaç organların zarar veya ölüme neden güçlü tahriş edici yeteneğine sahiptir.
    5. her analit numunesi 105 ul iyodometan eklemek için analitik bir şırınga kullanın. Cap analit tüpleri hemen iyodometan buharlaşmasını en aza indirmek için. Gerektiğinde, kısaca santrifüj tüm örneklerin hiçbir sıvı kapağı kalmasını sağlamak için ise iyice vorteks ve. (Kahverengi, mor veya sarı örneğin,) herhangi bir renk değişimi aşağıdaki permethylation reaksiyonu tehlikeye atabilir iyodometan bozulmasını, sinyalleri.
    6. diklorometan ile en az 3 kez iyodometan aktarmak için kullanılan analitik şırınga durulayın. Bu sağa sola bunu önlemek olacaktırm tıkanma. organik tehlikeli atık kabına ilave iyodometan ve diklorometan ile birlikte, bu durulama bertaraf edin. tehlikeli atık kabına kullanılan test tüpleri yerleştirin.
    7. 2-ml plastik rezervuar tüpler yeni bir dizi elde etmek. istenirse ek kapaklarını çıkartın.
    8. mikrofuge'ye Mini filtreleri çekin. Santrifüj sonra 15 2,400 x g'de saniye ve için takılı sütunlar DMSO atık ile birlikte rezervuar tüpleri atın.
    9. santrifüj sıkma sütunları yeniden takın ve yeni rezervuar tüpler içinde koyun. Sayı her spin kolon ve aynı örnek numarası ile karşılık gelen rezervuar tüpü. Mini filtre fişler sıkı olduğundan emin olun; Potansiyel sızıntı sonraki adımı etkileyebilir. Spin sütunlarından DMSO kaldırma ve döndürme sütunları üzerine analit örnekleri aktarılması arasındaki süreyi en aza indirir.
    10. Permethylation
      1. Kantitatif karşılık gelen NaOH-boncuk dolu mikrofuge'ye sıkma co her örnek çözümü transferilumn. Bu adım için 1.000 ul pipet kullanın. taşınmasının ardından, 200 ul ucu sonu ~ 2 mm kıvrım ve bir karıştırıcı olarak kullanmak için sütun içeriğini bırakın. Tüm numuneler için tekrarlayın.
        Not: analit çözüm transferi sırasında pipet gelen damla çünkü iyodometan düşük viskoziteli örnek kaybına neden olabilir. örnek tüp ve bir elle birbirine bitişik spin kolon tutun ve hızlı bir şekilde, diğer taraftan numune çözeltisi aktarın.
      2. permethylation Reaksiyon 11 dakika devam etmesine izin verir. Bu dönemde her bir numune en az 4-5 kez karıştırın. karıştırıcılar hafifçe sütun içeriğini karıştırmak için NaOH boncuk yüzeyinde meydana verimli permethylation kolaylaştırmak için, uç kıvrılmış jel yükleme pipet uçları kullanın. Agresif karıştırma, spin filtre delinme pulverize ve (daha sonraki sıvı / sıvı ekstraksiyon etkinliğini azaltabilir) NaOH boncuk askıya ve / veya sa olarak (örnek kaybına neden olabilirNaOH granül) sütundan taşabilir mple batırılmış.
      3. daha sonra, sıvı / sıvı ekstraksiyon adımı için hazırlık olarak, 0.2 M sodyum fosfat tampon maddesi (pH 7.0) içinde 0.5 M sodyum klorür (NaCI) çözeltisi yeterli miktarda hazırlanması Oda sıcaklığında saklanır. Her bir numune, sıvı / sıvı ekstraksiyon üç döngü için 12 ml NaCl çözeltisi aralığında bir toplam gerektirecektir.
      4. 11 dakikalık permethylation süresinin tamamlanmasından sonra, hemen henüz dikkatle sütunları çıkarın ve 2.400 x g'de 15 saniye boyunca onları santrifüj. tapaları atın.
    11. Hemen santrifüj sıkma sütunları kaldırmak ve arkasında taze permetilatlı glikanları ihtiva akış çözümü bırakarak, boş sıkma haznesi tüplerin yeni bir dizi içine koyun. bir şey atmayın.
    12. En kısa sürede, kuru, NaOH dolu sıkma filtrelere 300 ul asetonitril (ACN) ekleyin. 9600 x g'de 30 saniye boyunca sıkma filtreleri santrifüj.
    13. immediatelY daha sonra, (örneğin, daha sonra önceden önceki adımda ACN 300 ul ilave bir santrifüj tüpüne eğirme filtresi içinden ip 11 dakika boyunca NaOH boncuklarla inkübe edildi çözelti) 13 x silanize ana permethylation çözeltisini 100 mm cam test tüpleri 42 3.5 mi hemen 0.2 M sodyum fosfat, 0.5 M NaCl, pH 7.0 içeren bir tampon madde ve karıştırın (vorteks) arasında ihtiva etmektedir. Bu adımı sırasında herhangi bir katı, beyaz kalıntı transfer kaçının. Bir sonraki adıma geçmeden önce her bir numune için bunu yapın.
    14. gecikmeksizin, transferi (kombine) (ile), ilgili Silanlanmış cam tüp içinde sıvı numune dinlenme ve hemen (vorteks) karıştırmak için her rezervuar tüp içinde ACN Spin-through. Yine bu aşama sırasında bir beyaz katı bir tortu geçişini engelleyecek. Cap, sallamak, ve vorteks cam tüp. her numune için tekrarlayın. Uygun çöp konteynerleri NaOH sütunları ve Pasteur pipetler atın.
  4. Sıvı / sıvı Ekstraction ve Glycan Arıtma
    1. Davlumbaz içinde, her bir örnek için 1.2 ml kloroform ekleyin. Bundan hemen sonra, silanize cam tüpler kapağı ve kuvvetli bir şekilde karıştırın.
    2. bir buharlaştırma manifoldu yaklaşık 75 ° C'ye kadar ön ısıtma metal bloklar. 100 mm cam tüpler × 13 mm ağırlayacak kuyuları ile ısıtma blokları kullanın.
    3. Silanlanmış Pasteur pipetleri, olmayan Silanlanmış Pasteur pipetleri ve kapakları Silanlanmış cam test tüpleri yeni bir dizi elde etmek.
      Dikkat: Kloroform (CHCl3) eldiven bazı türleri ile nüfuz edebilen bir tahriş edici, mutajen ve potansiyel kanserojendir.
    4. Kısaca santrifüjü (~ 3.000 x g) bir numunesi içeren cam tüpler, sulu ve organik tabakaların ayrılması için.
    5. Sulu tabakanın ~ 3 mm alt organik tabaka üzerinde kalacak şekilde En Sulu tabakanın kadar çıkarmak için olmayan bir silanize Pasteur pipet kullanın.
    6. 0.5 M Na 3.5 ml ilave edilirher bir cam tüpe 0.2 M sodyum fosfat tamponu içinde Cı çözeltisi (pH 7), kuvvetli bir şekilde karıştırın ve kısa bir süre için santrifüj (~ 3.000 x g). Önceki adımda (1.4.3) 'de olduğu gibi, sulu katmanın özü olmayan bir silanize Pasteur pipet kullanın.
    7. önceki adımı (1.4.4) tekrarlayın, ancak ~ sulu tabakanın 1 ml bırakın.
    8. Temiz ve uygun biçimde etiketlenmiş Silanlanmış 13 × 100 mm cam test tüpüne Organik tabakayı aktarmak için temiz bir Silanlanmış Pasteur pipet kullanın. şu şekilde ayıklayarak sulu kirlenmesini önlemek:
      1. Bir yandan birbirine bitişik mevcut ve yeni silanize cam test tüpleri hem tutun. Diğer elinizle, sulu tabakanın aşağı pipet takarken kabarcıkları oluşturmak için pipet ampul basın.
      2. Bir kez organik tabaka içinde, hava kabarcıkları oluşturarak durdurmak ve organik ve sulu tabakalar stabilize ve tekrar ayrılması için izin sabit pipet ampul tutun. Sonra, yavaş yavaş Kurumu'nun yayınladığı kadar çekilme ampulü bırakınherhangi bir sulu kontaminasyon olmadan mümkün olduğunca c tabakası.
      3. Hızla sulu katmanı üzerinden pipet ucu yükseltmek ve tüpün dışına pipet yükselterek biraz (bazı sulu kontaminasyonu çekilmesi ile sonuçlanan) Ampulü bırakmadan doğal refleksi karşı.
      4. Hızla bitişik yeni bir tüpe, düşük viskoziteli organik tabaka aktarın. Herhangi bir sulu kirlilik yeni bir cam tüplerde ekstre Organik tabakanın en küçük sıvı damlacıkları olarak görünür olacaktır. Sulu / NaCI kirlenme görünüyorsa, bir pipet ile çıkarın; Tek bir damlacık içine sulu damlacıkları havuz için gerekirse santrifüj.
    9. Düzgün eski cam tüpler, pipetler ve sulu ve organik atık çözümleri atmayın. Yıkayın ve cam tüp kapaklarını geri dönüşüm.
    10. Bir çeker ocak içinde ~ 5 dakika boyunca 75 ° C'de önceden ısıtılmış bir buharlaştırma manifoldunda hafif bir azot ve sürekli akışı altında tüm örnekler kurutun. tüm kuru aşağı ste sırasında evaporatif soğutma sağlamak içinPS, hafif bir azot ve sabit akış sıçramasına veya sıvı sıçrayan olmadan sıvı yüzeyini rahatsız gerekir. Nihai numunenin tam kuruduktan sonra buharlaşma manifoldu örnekler çıkarın. bir kuru cam tüplerin alt kısmında beyaz lekeler tampon / NaCI kontaminasyonu göstermektedir.
    11. TFA hidroliz adımı tamamlamak için gün içinde kalan yeterli zaman yoksa burada prosedürü Pause. Geçici bir süre için (örneğin, gece boyunca), -20 ° C'de, kuru numune depolamak. , Depolamadan sonra prosedüre devam -20 ° C derin dondurucuda örnekleri kaldırmak ve onları Kapaklar açılmadan önce tamamen ısınmasını bekleyin.
    12. Numuneler, sıcak, trifluoroasetik asit (TFA) hidroliz (bir sonraki aşama) için hazırlık, ısıtma mantosu set ederken, sıvı tüp içeriğinin sıcaklığı 121 ° C'ye ulaşması. TFA stoktan TFA çözeltisi hazırlayın (aşağıda Adım 2.1 bakınız).

2. trifluoroasetik asit (TFA) hidrolizi

Dikkat: Trifloroasetik asit (TFA), aşındırıcı bir organik asit ve toksik tahriş edicidir.

  1. iyonu giderilmiş su içinde 2.0 M TFA çözeltisi yeterli miktarda hazırlanır. Her analit numune 2.0 M TFA çözeltisi 325 ul gerektirir. Konsantre TFA 13.0 M olduğu
  2. her analit numune 2.0 M TFA 325 ul ekle. takip eden bir kurutma işlemi (aşağıda 2.3) içinde TFA buharlaştırma ve örnek kaybını önlemek için, sıkı bir şekilde TFA ilave edildikten sonra hemen her bir örnek tüp kap. Tüm cam tüplerde çözüm seviyesini işaretleyiniz. Bir sonraki adımda evvel her örnek Vortex.
  3. Uygun önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğu içinde 2 saat sıkıca kapatılmış bir numune tüpleri inkübe ya da içerisinde 121 ° C'lik bir sıcaklığa ulaşması şekilde fırın. bir ısıtma bloğu yerine bir fırın kullanılması durumunda, alüminyum folyo ile kapak Örnek tüpleri tüpün alt tüp ve örnek kalıntı kısmi kurutma üstünde TFA yoğunlaşmayı önlemek için. 20-30 dakika sonra örnek çözüm seviyelerini kontrol edin.Minimal TFA buharlaşmasını sağlamak. Gerekirse, daha fazla kapaklarını sıkın ya da bir sıkı oturması için kapaklar değiştirin.
  4. 2 saatlik bekleme sırasında, bir sonraki adıma (aşağıya bakınız 2.4) 75 ° C'ye kadar başka bir buharlaştırma manifoldu ayarlayın.
  5. 2 saatlik ısıtma süresi 15 dakika ~ azot gazı hafif bir akımı altında 75 ° C'de, tam kuru örnekleri ise. fazla 15 dakika gözetimsiz örnekleri bırakmayın. Sık kez tüm numuneler kuru örnekleri kontrol ve ısıtma ve kurutma durdurma.
  6. indirgeme adımı tamamlamak için gün içinde kalan yeterli zaman yoksa burada prosedürü Pause. -80 ° C geçici olarak (yani, bir gecede) mağaza örnekleri. , Depolamadan sonra prosedüre devam -80 ° C derin dondurucuda örnekler kaldırmak ve onları Kapaklar açılmadan önce tamamen ısınmasını bekleyin.

3. Azaltma

  1. Bir çeker ocak içinde 1 M ammoni bir 10 g / L sodyum borohidrid yeterli miktarda (NaBH4) çözeltisi hazırlayınum hidroksit (NH4OH). Her numune Bu çözümün 475 ul gerektirir. Numunelerin her parti için yeni bir çözüm olun. Konsantre amonyum hidroksit yaklaşık M. 14.5 olan (NH3 ağ / ağ 27-30%)
    Dikkat: Sodyum borohidrid (NaBH4) higroskopik, su-reaktif toksin ve güçlü tahriş olduğunu bültenleri-upon soluma, yutma veya göz / cilt teması üzerine ciddi yanıklara neden su son derece yanıcı buharları ile temas.
    Dikkat: Amonyum hidroksit (NH 4 OH) ciddi yanıklara ve soluma, yutma veya göz / cilt teması üzerine geri dönüşsüz organ hasarına yol açabilecek bir aşındırıcı tahriş edici ve toksin olduğunu. 30 dakika boyunca su ile etkilenen bölgeyi yıkayın ve sürtme ya da etkilenen alanlar çizilmeye kurbanı engeller.
  2. Her numune için, 1 M NH4OH 10 g / L NaBH4 475 ul ekle. Mix numunelerin iyice herhangi bir kalıntı eritmek için. Cap test tüpleri veindirgeme reaksiyonu 1 saat süreyle devam etmesine izin.
  3. 1 saatlik bekleme sırasında 75 ° C'ye kadar ısıtıldı buharlaştırma manifoldu ayarlayın. cam tüpler için uygun kuyulara (aşağıda 3.4 bakınız) bir ısıtma bloğu kullanın.
  4. 1 saatlik reaksiyon süresinin tamamlandığında, her bir örnek için 63 ul metanol (MeOH) ekleyin. 68 ° C'de kaynar, nispeten uçucu sıvı - Bu adım ve şu adımı trimetil borat gibi artık bor çıkarın.
  5. 15 dakika ~ azot gazı hafif bir akımı altında 75 ° C'de (önceden ısıtılmış manifoldunda) Kuru örnekleri. Sıkça örnekleri kontrol ve sahipsiz onları bırakmayın. cam tüpler altındaki küçük sıvı damlacıkları örnek henüz kuru olmadığını gösterir.
    Not: sıvı damlacıkların hava kabarcıklarını ayırmak deney tüpünü yatırın. Sadece sıvı damlacıkları devirme sonra hareket edecek, ancak bunun tersi her zaman doğru değildir: bir baloncuk hareket etmezse, yine de bir (çok küçük) sıvı damlacığı olabilir.
  6. sampl kezmetanol (MeOH) ve asetik asit (AcOH) içinde 1 (hac / hac) çözeltisi: ES 9 hazırlama tamamen kurudur. Her bir örnek için AcOH çözeltisi: Bu, MeOH 125 ul ekle.
  7. bir azot gazı akımı altında yumuşak bir 75 ° C 'de (önceden ısıtılmış bir manifoldunda) Kuru örnekleri.
  8. örnekler tamamen kuru olan, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca numune vakumlu kuru (örneğin FoodSaver tarafından satılanlar gibi), bir plastik vakum küvet içine Örnekleri vakum kapağını kapatın "vakum" bağlanmak için elektrik kadranını vakum vakum hortumu ve dönüş. Vakum sökmek için aşağıdaki adımları ters. tamamen vakum kapağını açmak için denemeden önce basıncı azaltmak için sistemin bekleyin.
  9. indirgeme adımı tamamlamak için gün içinde kalan yeterli zaman yoksa burada prosedürü Pause. -80 ° C geçici olarak (yani, bir gecede) mağaza örnekleri. -80 ° C derin dondurucuda örnekler kaldırmak, depolamadan sonra prosedür devam ediyor ve onları uncappin önce tamamen ısınmasını sağlamak içinörn.
  10. örnekler vakum kuru için (ya da sıcak, depolama sonrası) beklerken, bir sonraki aşama için reaktifler hazırlar. Elde ve her numune için numarası (kapaklı) bir Silanlanmış konik tabanlı otomatik örnekleyici (AS) 'flakon. Ayrıca, ön ısıtma sığ sıra-vial ısıtma bloğu ve derin oyuklu cam boru bloğu her iki cam tüp içerikleri, 50 ° C'lik bir sıcaklığa erişir şekilde.

4. Asetilasyon (a Çeker Hood Yapılan)

  1. Her bir örnek için deiyonize su 18 ul ekle. Cap ve iyice tamamen herhangi çökeltilerin çözünmesi tüm vorteks tüpleri.
  2. her bir cam tüpe 250 ul asetik anhidrit ekleyin. 2 dakika için bir su banyosu içinde kap, iyice vorteks ve sonikasyon, kalıntı ve çökeltileri tamamen çözülmesini sağlamak için.
  3. Alüminyum folyo ile cam tüpler Kapak ve 10 dakika boyunca 50 ° C'lik bir iç sıcaklıkta inkübe edilir.
  4. Her bir örnek için 230 ul konsantre edildi, trifloroasetik asit (TFA) ekleyin. Hemen kap birnumune karışımı d. Daha sonra, kuluçkaya örnekler kaplı alüminyum folyo 50 ° C'lik bir iç sıcaklıkta 10 dakika.
  5. İnkübasyondan sonra, her bir örnek için, 1.8 ml diklorometan (CH2C! 2) ekleyin. Cap ve iyice karıştırın.
  6. Her bir örnek için deiyonize su 2.0 ml ilave edilir. Cap ve iyi karışım örnekleri. 0 3.000 × g santrifüj katmanları ayırmak için. Su kirlenmenin önlenmesi Aşama 1.4.6 belirtildiği gibi, sıvı / sıvı ekstraksiyon yapmak için olmayan bir silanize Pasteur pipet kullanın.
  7. İki ekstraksiyon toplam bir kez daha ekstraksiyon, tekrarlayın. (AS raf güvenli tutulur) şişeleri OLARAK Silanlanmış etiketli içine Organik tabakayı aktarmak için Silanlanmış Pasteur pipetler kullanın. hemen altında ağzına AS şişeleri doldurun.
  8. azot gazı altında 40 ° C'de 15 dakika boyunca (AS şişelerde) kuru numuneler için bir ön-ısıtılmış, sığ çukurlu ısıtma bloğu kullanın. aşırı kuru etmeyin. Nihai ürünler, kısmen metillenmiş alditol asetatlar (PMAAs) olarak bilinir.

5. Gaz Kromatografisi - Kütle Spektrometrisi (GC-MS)

  1. aseton 100 ul her bir örnek sulandırın ve iyice karıştırın. GC bölme modu (280 ° C 'de muhafaza edilmekte ve silanize bir cam yünü küçük fiş ihtiva eden) bir astar olarak bölünmüş modda her bir örnek için 1 ul enjekte etmek için bir otomatik numune alıcı kullanın. 0.25 mm ID 0.25 mikron film kalınlığında 30 m DB 5 ms GC kolonu boyunca 0.8 ml / dakika sabit akış modunda taşıyıcı gaz olarak 40. Kullanım helyum lik bir ayırma oranı kullanın.
  2. 0.5 dakika boyunca 165 ° C 'de, ilk GC fırın sıcaklığı tutun. (10 dk) 10 ° C / dk bir oranda 265 ° C'ye kadar, 165 ° C, her bir çalışma için, sıcaklık eğrisi, program fırın başlangıç ​​süresi izlenerek ve hemen ardından sıcaklığı 265 ° C Rampa (2 dakika sürer) 30 ° C / dk bir oranda 325 ° C ve 3 dakika için 325 ° C'da sıcaklığı muhafaza. numune başına toplam çalışma süresi 15.5 dk.
  3. yanlısı kullanınPerly ayarlanmış ve (El, 250 ° C'de 70 eV) iyonizasyon elektron KR sütunundan elüsyon örnek bileşenleri tabi kütle spektrometresi kalibre edilmiştir. Bir TOF kütle analizörü, bir 0.1-sn darbe toplamı oranı ile, m / z 800 m / z 40 parçaları analiz. 2.5 dak EI-filament çözücü gecikme süresini ayarlayın.

6. Veri Analizi

  1. Bir TOF kütle analizörü kullanarak ise, çıkarılan iyon kromatogramı elde etmek için 0.15 Da kitlesel bir pencere uygulayarak her PMAA için fragman iyonları en bol ve / veya teşhis toplamı. Her PMAA Hedef iyonları yerde yayınlandı, 33 ancak aşağıdaki değişiklikler yapılmıştır: t-GLC iyonları şimdi 145.1 + 205.1 vardır; 2-Man iyonları 161.1 + 189.1 vardır; 3-Gal iyonları 6-Gal iyonları 161,1 + 189,1 + 233,1 olan + 233.1 161.1 vardır; 2,6-Man iyon 189.1 olduğu; 3,6-Man iyonları + 233.1 189.1 vardır.
  2. otomatik olarak iyon kromatogram çıkarılan toplamlı her pik alanları entegre QuanLynx veya başka bir yazılım kullanın.
  3. El ile her entegre çıkarılan iyon kromatogram görüntüleyerek entegrasyon sonuçlarını doğrulamak. Sonra, daha fazla analiz ve tüm heksoz XIC alanlarının toplamına her heksoz XIC alanını bölen içerir veri normalleştirme için bir elektronik tabloya zirve entegrasyon veri ihracat; Benzer şekilde, her bir HexNAc XIC alan tüm HexNAc XIC alanlarının toplamı bölünür. Bu prosedür her heksoz ve HexNAc için normalize zengindi üretir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göre iki kritik permethylation adım yanlış infaz edildiği durumlarda başarılı permethylation, hidroliz, azaltma, ve insan kan plazma örneklerinin asetilasyonunu gösteren bir toplam iyon akımı kromatogram (TIC) Şekil 3 'de gösterilmiştir.

Heksozların için HexNAcs Görece mutlak Verim:

N -acetylhexosamine (HexNAc) kısmen olarak metill...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel olarak, heksozlarla kısmen metillenmiş alditol asetatlar başarılı üretim (PMAAs) Daha az zorluklarla doludur ve N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs başarılı üretiminden daha sağlamdır. Bu prosedürün her aşamasında dışarı oynar gibi bu fenomenin arkasında tam mekanizması bilinmemekle beraber heksozlarla için HexNAcs göreceli özgü (yerine hidroksil grubuna göre) N-asetil grubunun eşsiz kimyaya ilgili olmalıdır. Asit hidrolizi ile ilgili olarak bunun altında yatan mekanizmanın Kısaca başka. 43

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Arizona Eyalet Üniversitesi Liberal Sanatlar ve Bilimler Koleji tarafından CRB'ye laboratuvar başlangıç fonları şeklinde desteklenmiştir. Ayrıca Flinn Vakfı'ndan (Hibe No. 1977) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından R33CA191110 Numaralı Ödül kapsamında bir hibe ile desteklenmiştir. JA, Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (PREP) tarafından R25GM071798 numaralı ödülle desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sodyum hidroksit boncukları 367176Sigma-Aldrich 20-40 ağ, reaktif sınıfı %97
0.9 ml Spin sütunu69705ThermoFisher Scientific'in Pierce bölümü İçindekiler  tapalar ve polietilen fritler 
GC-MS otomatik numune alma cihazı şişesi (silanize edilmiş)*C4000-9ThermoFisher Scientific TargetDP Yüksek Geri Kazanım Şişesi, 1,5 inç ml, 12  mm x 32  mm, Teflon astarlı delinebilir kapaklar
içerir 1,5 ml polipropilen test tüpleri05-402-25ThermoFisher Scientific Çıtçıtlı kapak
2 ml polipropilen test tüpleri05-408-138ThermoFisher Scientific Çıtçıtlı kapak
Dimetil Sülfoksit (DMSO)D8418Sigma-Aldrich Moleküler biyoloji için BioReagent, reaktif sınıfı %>99,0
İyodometan I8507Sigma-Aldrich Stabilizatör olarak bakır içerir, ReagentPlus %99
AsetonitrilA955-4ThermoFisher Bilimsel Optima LC/MS
Mikrosantrifüj75002436: Sorvall Legend Micro 17 SantrifüjThermoFisher Scientific 24 x 1.5/2.0 rotor, ClickSeal biyolojik muhafaza kapaklı. Rotor katalog numarası: 75003424
13 x 100 cam test tüpü (silanize edilmiş)*53283-800VWR13 mm x 100 mm vidalı kapaklı borosilikat cam test tüpleri
test tüpleri için kapaklar14-930-15DThermoFisher Scientific Kimble ve ticaret; Siyah Fenolik Vidalı Kapaklar; 13  mm-415 GPI dişi; PTFE yüzlü kauçuk astar.
Sodyum klorür ve nbsp;S7653Sigma-Aldrich % >99,5 saf
Kloroform4440-08Macron İnce Kimyasallar  
Trifloroasetik asit 299537Sigma-Aldrich Protein dizilimi için yeniden damıtma ile% 99 saflaştırılmış 
Sodyum borhidrür71321Fluka Analitik %99
Amonyum hidroksit çözeltisi 320145Sigma-Aldrich NH < alt> 3< / alt> içerik: %28.0-30.0
MetanolAH230-4Honeywell Burdick & JacksonHPLC sınıfı
Asetik asit & nbsp;320099Sigma-Aldrich %99,70
Plastik vakumlu desikatör ve nbsp;Yeterli boyutta herhangi bir modelFoodSaver
Asetik anhidrit 539996Sigma-Aldrich %99,50
Diklorometan D143SK-4ThermoFisher Bilimsel Stabilize HPLC sınıfı
Aseton 9006-03J.T.BakerBaker Analiz Edildi 
Isıtmalı buharlaştırma manifoldu (ana ünite)pi18823ThermoFisher Scientific Thermo Scientific* Reacti-Therm* Isıtma ve Karıştırma Modülü; Isıtma ve Karıştırma Fonksiyonlu Üç Bloklu Model
Isıtmalı buharlaştırma manifoldu (üstten evaporatör)pi18826ThermoFisher Scientific ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporatör, 27 portlu; Üç bloklu Reacti-Therm ısıtma modülü ile kullanım için
Buharlaşma manifoldu için alüminyum numune tutucu bloklarpi18816ThermoFisher Scientific Blok, Alüminyum, Reacti-Block S-1, 13  mm çap test tüpleri, 13 delik (14  mm çap x 45  mm derinliğinde)
Gaz kromatografıModel A7890Agilent CTC PAL otomatik numune alma cihazı ile donatılmıştır
Kütle spektrometresi GCT Premier (Uçuş Süresi)Waters 
Bölünmüş modlu astar (devre dışı bırakılmış / silanize edilmiş)5183-4647AgilentKüçük bir silanize cam yünü tapası içeren
DB-5ms GC sütunu122-5532Agilent30 m x 0,25 mm ID x 0,25 mikron film kalınlığı
Klorotrimetilsilan95541Sigma-Aldrich 
Cam vakumlu desikatör (cam eşyaların silanizasyonu için)EW-06536-30Cole-Parmer12" genişliğinde; 230 mm plaka boyutu
*Cam eşya silanizasyonu, büyük bir cam vakumlu desikatörde klorotrimetilsilan buharı kullanılarak gece boyunca şirket içinde gerçekleştirilir.
Cam

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
  2. Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).
  3. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  4. Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
  5. Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
  6. Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
  7. An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
  8. Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
  9. Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
  10. Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
  11. Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
  12. Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
  13. Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
  14. Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
  15. Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
  16. Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
  17. Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
  18. Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
  19. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
  20. Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
  21. Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
  22. Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
  23. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  24. Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
  25. Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
  26. Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
  27. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
  28. Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
  29. Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
  30. Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
  31. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  32. Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
  33. Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
  34. Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
  35. Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
  36. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
  37. Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
  38. Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
  39. Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
  40. Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
  41. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
  42. Seed, B. Silanizing glassware. Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).
  43. Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Glikomik Yakla mGC MS AnaliziPermetilasyon lemiS v S v EkstraksiyonuAsetilasyon ModifikasyonuHidroliz Prosed rT revlendirme Tekni iK tle SpektrometresiGlikan zellik Tespiti

İlgili makaleler