Yöntem makalesi

Erken Açlık Tepki Koronin A Fonksiyonu incelenmesi Dictyostelium discoideum Toplama Tahliller

DOI:

10.3791/53972

⸱

18 Haziran 2016

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sosyal amip Dictyostelium discoideum açlıktan öldüğünde gelişimsel olarak çok hücreli bir organizmaya geçiş yapar. Evrimsel olarak korunmuş protein koronin A, gelişimin başlangıcında çok önemli bir rol oynar. Agregasyon testlerini ana yöntemimiz olarak kullanarak, koronin A'nın erken gelişimdeki rolünü aydınlatmayı amaçlıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum amiplerin beslenen toprak bulunur. Besin kaynakları kıt hale geldiğinde, tek hücre toplama merkezlerine 1-4 doğru chemotax sırasında bir çok hücreli geliştirme programını başlatmak için faktörleri salgılar. Bu işlem, siklik adenozin monofosfat (cAMP) 5 serbest bağlıdır. cAMP adenilat siklaz ve fosfodiesterazlarm birlikte hareket dalgasından üretilen ve G protein-eşli reseptör cAMP 6,7 ile bağlanır. Yaygın olarak kullanılan deney, daldırılmış koşullar 8,9 hücre toplanmasının gözlemine dayanır Alt düzey ökaryot Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünde yer alan mekanizmaların analiz etmek. Bu protokol, dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) 10 içine daldırılmış doku kültürü plakaları içinde açlık gelişim döngüsünde Koronin A rolünün analizine açıklanmaktadır. Koronin bir yaygın korunmuş pr üyesidirfaaliyetleri 11,12 çeşitli suçlanmıştır coronins bir otein ailesi. A Koronin eksik Dictyostelium hücreleri çok hücreli agrega oluşturamamaktadırlar ve bu kusur düşündüren, cAMP bakliyat tedarik tarafından kurtarıldı olabilir üst baş eylemleri Koronin cAMP 10 basamakla. Bu çalışmalarda tarif edilen teknikler cAMP kaskadının yukan Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünün ilk aşamalarında proteinlerin işlevleri araştırmak için güçlü araçlar sağlar. Bu nedenle, bu toplama tahlil kullanan bir fonksiyon Koronin ve daha fazla çalışma izin ve Koronin biyoloji anlayışımızı ilerleyebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinlerin Koronin aile çok ökaryotlarda boyunca muhafaza edilir. Bu proteinler, bir amino-terminali triptofan-aspartat (WD) tekrar-ihtiva eden bir karboksi-terminal halkalaştırılmış halka etki 13,14 bağlı eşsiz bir bölgesi takip bölge (Şekil 1) bulunması ile karakterize edilir. Coronins iskelet düzenlemesi ve sinyal iletimi 12 de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonların çeşitli implike edilmiştir. Memelilerde, altı adede kadar kısa Koronin molekülleri (Koronin 1-6) ve 7 Koronin bir tandem, 12,15 birlikte ifade edilebilir. Koronin 1 üzerinde en çok çalışılan aile üyesi ve patojen yok, T hücre hayatta kalma ve nöronal sinyal dahil olduğu gösterilmiştir. Nasıl, tam, Koronin 1 bu faaliyetleri yürütmektedir belirsizliğini koruyor. 1 Koronin Ca 2+ ve cAMP bağımlı sinyal yanı sıra F-aktin olarak hücre iskeleti modülasyonu 16-18, potansiyel işbirliği düzenleyen gösterilmiştir ikenMemelilerde kadar 7 aile üyelerinin -Anlatım zorlu nedeniyle potansiyel işten çıkarmalara, bu sistemlerdeki coronins moleküler fonksiyonunu incelemek için yapmıştır. Memeli organizmalardan farklı, alt ökaryot Diktiyostelyum diskodeyum görünüşte olmayan gereksiz fonksiyonları 15,19,20 ile sadece iki Koronin aile üyelerini (Koronin A, memeli Koronin 1 ve Koronin B ortologunu, memeli Koronin 7 ortologu) ifade eder. Bu durum, Dictyostelium discoideum coronins fonksiyonu çalışma güçlü bir model haline getirir.

Dictyostelium discoideum'da Koronin A'nın rolünü incelemek için, 10 Koronin barındırmayan vahşi tipli hücreler veya hücre kullanılarak dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) tampon içeren doku kültürü plakaları içinde açlık gelişim döngüsü neden olmuştur. Biz Koronin A eksik hücreler açlık üzerine çok hücreli agrega oluşturmak mümkün olduğunu bulmuşlardır. Bu fenotip doğru kantitatif bir değerlendirme içinBu protokol açıklanan otomatik canlı hücre görüntüleme önemli bir araçtır. Bir Koronin eksik hücrelerin erken açlık tepkisinin başlamasında kusur cAMP çağlayan yukarı bir eylemleri Koronin düşündüren, cAMP bakliyat tedarik tarafından kurtarıldı edilebilir. Gelişiminin başlaması simüle etmek için, cAMP darbelerinin egzojen uygulaması son 8,9 çeşitli laboratuarlar tarafından kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu prosedür, aynı zamanda, hücre yoğunlukları ve zamanlaması büyük ölçüde bağlı olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol tekrarlanabilirliği yüksek derecede garanti altına almak için, bu bir değişkenliğe azaltmayı amaçlamaktadır. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalarda kullanılan teknikler Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünün erken evrelerinde proteinlerin işlevleri araştırmak için güçlü araçlar sağlar ve yukarı tespit hem de bir işlevi Koronin aşağı doğru efektör potansiyeline sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Time-lapse mikroskobu ile Dictyostelium discoideum erken açlık yanıtı gözlemlemek.
    1. HPO 4 5 g proteoz pepton, 5g thiotone e pepton, 10 g glukoz 5 g maya özütü, 0.35 g 2 Na: 1 L için HL-5 ortamı (ihtiva eden bir Erlen bölgesi DH1.10 hücreleri ya da CORA-eksikli hücrelerin büyümesine * 7H 2 O, 0.35 gr KH 160 rpm'lik bir rotasyon ile bir çalkalama inkübatöründe 22 ° C'de 2 PO 4, 0.05 g dihidrostreptomisin-sülfat, pH 6.6). 0.01 x 10 6 hücre / ml ve 2 x 10 6 hücre / ml arasında bir yoğunlukta hücreler tutun.
    2. Hasat log-faz büyüyen DH1.10 hücreleri 21 ya da 22 ° C 'de HL-5 orta kültür çalkalama yetiştirilen CORA-eksikli hücrelerin DH1.10 arka oluşturulan 10, hücre toplama inceleyin. Bunu yapmak için, 400 x g'de 3 dakika boyunca hücreler (genellikle 10 ila 50 mi), santrifüj, uygun miktarda almak ve BSS (10 mM NaCI, 10 mM KCl hücreler iki kez yıkayın, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5).
    3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Daha sonra, (5, 10, 20, ya da 40) bir yoğunlukta plaka hücreleri 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 4 hücre / cm2 x. bunları BSS 22 ° C de 1 saat yapışmaya izin verin.
    4. Görüntüleri her 135 sn alarak, 10 daha önce açıklandığı gibi zaman atlamalı mikroskobu ile toplanmasını gözünüzde canlandırın. kurmak 5X objektif ve uygun yazılım tarafından otomatik bir elektron-çarparak şarj çiftli aygıt kamera ile donatılmış bir canlı hücre görüntüleme kullanarak (Malzeme Tablo).
  2. açlık sırasında Diktiyostelyum diskodeyum hücrelerinin cAMP nabız gibi atan.
    1. Hücrelerin hasat tarafından DH1.10 hücreleri 21 veya DH1.10 Cora -açıklı hücrelerin 10 gelişimine dışarıdan uygulanan cAMP darbelerinin etkisini incelemek. Bunu yapmak için, 400 x g'de 3 dakika boyunca, uygun hücre miktarı (genellikle 10 ila 50 mi), santrifüj almak ve BSS içinde iki kez yıkayın.
    2. couBSS 1 x 10 7 hücre / ml bir yoğunluğa hücreler bir hemasitometre kullanılarak ve tekrar süspansiyon nt hücreleri. bakliyat uygulamadan önce 2 saat boyunca 22 ° C 'de kültür (160 rpm) çalkalayın. Bir zamanlayıcı kontrollü peristaltik pompa kullanılarak cAMP darbeleri ekleyin. 5 saatlik bir süre boyunca 5 sn darbe 50 nM cAMP (son konsantrasyon) 15 ul, her 6.5 dakikada bir Pompayı programlayın.
    3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Daha sonra, (5, 10, 20, ya da 40) bir yoğunlukta hücreler plaka 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 4 hücre / cm 2 x. BSS 1 saat yapışmaya izin verin.
    4. 5X objektif kullanılarak parlak alan mikroskopi ile 22 ° C de 16 saat sonra toplama görselleştirme.
  3. Durumunu ortama maruz kalma ile Dictyostelium discoideum gelişme indüksiyonu.
    1. 22 tarif edildiği gibi, taze koşullu ortam hazırlar. Kült sallayarak gelen log-faz DH1.10 hücreleri 21 veya DH1.10 Cora -açıklı hücreleri 10 topla400 x g'de 3 dakika boyunca bir pipet, santrifüj kullanılarak 22 ° C'de HL-5 ortamı ile etmiş olur ve PBM hücreleri üç defa yıkamak (0.02 M potasyum fosfat, 10 uM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 6.1).
    2. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın mi, 1 x 10 7 hücre / yoğunluğunda PBM bu tekrar süspansiyon ve 110 rpm / 22 ° C'de 20 saat süre ile çalkalanır.
    3. 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj işleminden sonra koşullu ortam toplayın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 8000 x g'da santrifüjleme ile belirler.
    4. 0.45 um'lik bir filtreden filtre koşullu ortam (Malzeme Tablo) ve PBM üç kat seyreltilir.
    5. (5, 10, 20, ya da 40) bir yoğunlukta bir hemasitometre ve plaka kullanarak hücreleri sayın 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 4 hücre / cm2 x. bunları 22 ° C de 1 saat yapışmaya izin verin.
    6. önceden hazırlanmış uygulanmış madde ile hücre değişimi yüzer.
    7. toplama a görselleştirmek5X objektif kullanarak parlak alan mikroskobu ile fter 16 saat.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken gelişme bir gösterisi bir kusur Koronin eksik hücreleri (Şekil 2). Bir hücre Koronin yokluğunda Dictyostelium discoideum gelişim devri sırasında ilk adımdır çok-agregatlar oluşturmak için mümkün değildir. Bu nedenle, Koronin erken açlık yanıtı ve / veya cAMP sinyali sırasında önemli bir rol oynadığı görülmektedir. Gerçekten de, Koronin A'nın olmaması çok hücreli agrega oluşumunun olmaması, indirgenmiş cAMP 10 sinyal eşlik eder. Bununla birlikte,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koronin proteinler ökaryotik dalının en takson bulunurlar. Dictyostelium discoideum Koronin bir memeli Koronin 1 homologu hücreler erken gelişim sırasında çekiş merkezleri oluşturmak mümkün değildir bir eksikliği Koronin yana erken açlık yanıt olarak katılır döngüsü 10. nicel ve doğru bir suşları arasında gelişiminde gecikme değerlendirmek mümkün, otomatik sahne denetleyicisi ile bir mikroskop canlı hücre görüntüleme set-up önemli bir araçtır.

D. diskodeyum ömrü ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suşlar ve reaktifler için Dictyostelium Stok Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı ve Basel Kantonu'ndan alınan hibelerle finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HL-5 ortamı (1 L için: 5 g proteoz pepton, 5 g tiyoton E pepton, 10 g glikoz, 5 g maya özütü, 0,35 g Na2HPO4*2H2O, 0,35 g KH2PO4, 0.05 g dihidrostreptomisin-sülfat, pH 6.6)
Proteoz peptonBD Bioscience211693
Tiyoton E peptonBD Bioscience211684
Maya özüBD Bioscience212750
GlikozAppliChemA3666
Na2< / sub>HPO4< / sub> * 2H < sub>2OFluka71643
KH2PO4AppliChemA1043
dihidrostreptomisin-sülfatSigma-AldrichD1954000
PBM (0.02 M potasyum fosfat, 10 &; M CaCl2< / sub> ve l mM MgCl2< / sub>, pH 6.1)kendi kendine yapılan
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2< / sub>, pH 6.5)kendi kendine yapılan
0.45-μ m Filtropure S filtreSarstedt83.1826
Falcon 24 oyuklu Doku kültürü plakasıFisher Scientific08-772-1H
Cellobserver mikroskobuZeissözel yapım
AxioVision yazılımıZeiss
IPC Mikroişlemci– kontrollü dağıtım pompasıISMATECISM 931
Axiovert 135M mikroskopZeiss491237-0001-000
İnkübasyon ÇalkalayıcıInforst HT Minitron

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268(2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820(2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dictyostelium discoideumCoronin AAggregation AssayCyclic AMP PulsesCell AggregationTime lapse MicroscopyHemocytometer CountingConditioned MediumStarvation ResponseDevelopmental Biology

İlgili makaleler