Yöntem makalesi

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması İn Vivo

DOI:

10.3791/53989

⸱

9 Mayıs 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarihsel olarak, çoğu hücresel süreç sadece 2 boyutta incelenmiştir. Bu çalışmalar genel hücre sinyalleme mekanizmaları hakkında bilgilendirici olsa da, yerel mikro çevrenin ve hücre dışı matrisin (ECM) yapısal ve mekanik özelliklerinden alınan önemli hücresel ipuçlarını ihmal etmektedir. Hücrelerin fizyolojik bir ECM içinde nasıl etkileşime girdiğini anlamak için, onları 3 boyutlu tahliller bağlamında incelemek önemlidir. Hücre göçü, hücre farklılaşması ve hücre proliferasyonu, 3 boyutlu bir ECM'nin mekanik özelliklerindeki yerel değişikliklerden etkilendiği gösterilen süreçlerden sadece birkaçıdır. ECM'nin temel bir fibriler bileşeni olan kollajen I, bir dokunun basit bir yapısal elemanından daha fazlasıdır. Normal koşullar altında, kollajen ağından gelen mekanik ipuçları morfogenezi yönlendirir ve hücresel yapıları korur. Tümör mikroçevresi gibi hastalıklı mikro ortamlarda, kollajen ağı genellikle dramatik bir şekilde yeniden şekillenir, bu da değişmiş bileşim, gelişmiş birikim ve değişmiş lif organizasyonu gösterir. Meme kanserinde, tümör sınırına dik hizalanmış liflerdeki bir artış, daha kötü hasta prognozu ile ilişkili olduğundan, lif hizalama derecesi önemlidir1. Hizalanmış kollajen matrisleri, kalıcı göç yoluyla tümör hücrelerinin yayılmasının artmasına neden olur2,3. Aşağıdakiler, hücreleri 3 boyutlu, fibriller kollajen hidrojel içine gömmek için basit bir protokoldür. Bu protokol birçok platforma kolayca uyarlanabilir ve ayarlanabilir, 3 boyutlu, fizyolojik bir mikro ortamda hücre göçü, hücre bölünmesi ve diğer hücresel süreçlerin araştırılması için hem hizalanmış hem de rastgele kollajen matrislerini tekrarlanabilir şekilde üretebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok hücresel süreç, 2 boyutta kapsamlı bir şekilde incelenmiştir, böylece temel hücre sinyal mekanizmaları hakkında kolektif bir bilgi oluşturulmuştur. Bununla birlikte, bu çalışmalar, yerel hücresel mikro çevrenin ve hücre dışı matrisin (ECM) yapısal ve mekanik özelliklerinden alınan önemli hücresel ipuçlarını ihmal etmektedir. Hücrelerin fizyolojik bir bağlamda nasıl etkileşime girdiğini daha iyi anlamak için, onları 3 boyutlu (3D) tahlillerde incelemek önemlidir. Bu 3D tahliller için ECM, hücre kaynaklı olabilir veya saflaştırılmış proteinlerden yeniden yapılandırılabilir. ECM'nin kaynağı ne olursa olsun, 3D matris tahlillerinin, hücrelerin fizyolojik dünyada nasıl gezindiğini ve etkileşime girdiğini anlamak için paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Örneğin, 3D matrislerde büyütülen hücreler, 2D deneyleri4-6'da gözlemlenmeyen, çevrelerindeki ECM'nin mekanik doğasına bağlı olarak farklı hareket modları gösterir. Ayrıca, 3D olarak kültürlenen hücreler, cam veya plastik gibi sert yüzeylerde yetiştirilen muadillerine göre daha az ve daha az belirgin stres liflerine ve fokal yapışmalara sahiptir7.

Bununla birlikte, bağlamsal 3D tahlillerin önemi hücre göçü ile sınırlı değildir. Diğer bazı hücre sinyalleme olayları yalnızca 3D tahliller kullanılarak araştırılabilir. Doku ve hücre farklılaşması sırasında, hücre dışı ortamın sertliği ve ECM, morfojenik olayları etkileyebilecek sinyaller sağlar. Örneğin, meme epitelyal tubulogenezi yalnızca düşük sertlikteki 3D matrislerde meydana gelir, ancak sert matrislerde veya 2D substrata8,9'da meydana gelmez. Sert 3D matrisler içinde kültürlendiğinde, bu aynı epitel hücreleri, değiştirilmiş FAK ve ERK sinyali10 boyunca sürülen artan proliferasyon ve hücre zarı çıkıntıları ile anormal bir fenotip alır. Diğer birçok sinyalleşme yolunun ve hücresel sürecin, yerel hücresel ortamın sertliğinden benzer şekilde etkilendiği bilinmektedir ve bu sinyal kaskadları, bir 3D ECM'nin uygun yerel mekanik özellikleri bağlamında sinyalleme olaylarının ve hücresel fenotipin araştırılmasının önemini vurgulamaktadır.

Kollajen I, ECM'nin en bol bulunan bileşeni olduğu ve hücresel mikro çevrenin mekanik özelliklerinin çoğundan sorumlu olduğu için in vitro çalışmalar için özellikle ilgili bir proteindir. Başlangıçta sadece yapısal bir protein olarak düşünülürken, rolünün şimdi çok daha karmaşık olduğu bilinmektedir. Kollajen lifi bileşimi, mimarisi, oryantasyonu, yoğunluğu ve sertliğinin tümü konsantre bir sinyal bilgisi ortamı sağlar5. Kronik inflamasyon ve tümör oluşumu gibi bazı hastalıkların ilerlemesi sırasında, kollajen ağı önemli ölçüde yeniden şekillenir2,11. Daha spesifik olarak meme kanserlerinde, artmış kollajen birikimi ve doku sertliği eşlik eder ve muhtemelen tümör ilerlemesine katkıda bulunur. Bu erken tümörlerde, sertleşmiş kollajen ağı gergin ve daha hizalı görünür, öyle ki liflerin çoğu büyüyen tümörü kapsar2. Tümör ilerledikçe, kollajen yeniden organize olmaya devam eder ve fibriller ağın bölgeleri tümör sınırına dik olarak yönlendirilir2,12. Dikey hizalama, bu hastaların hastalıksız progresyonunun ve genel sağkalımının daha kötü olduğu durumlarda prognostik bir biyobelirteç görevi görür1. Bu korelasyonun bir açıklaması, kötü sonuçların, hizalanmış kollajen ağlarında kalıcı hücre göçü yoluyla tümör hücrelerinin artan yayılmasının bir sonucu olmasıdır3.

Hücrelerin, tümör ilerlemesinde gözlenen hizalama ve organizasyona spesifik olarak nasıl tepki verdiğini anlamak için, deney için hem rastgele hem de hizalanmış 3D kollajen matrisleri oluşturmak gerekir. Fibriller ağlar içinde hizalamayı indüklemek için üç temel metodoloji vardır. İlk teknik, hizalama oluşturmak için iki nokta arasındaki kolajenin büzüldüğü veya gerildiği bir gerilme indükleyici cihaz kullanır. Kuvvet eksenine paralel lifler gergin olarak çekilirken, eksene dik olan lifler sıkıştırılır ve burkulur. Zorlanma kaynaklı teknikler tipik olarak mükemmel hizalama sunarken, bu yaklaşım birçok platforma kolayca uyarlanamayan hantal ekipman gerektirir3,13. Alternatif olarak, hücre kaynaklı suş, daha sonra kollajeni kasılan ve hizalayan lokalize hücre tıkaçları yerleştirilerek oluşturulabilir13. Bu yöntem, birçok parametrenin değişebileceği için değişken olma sorununa sahiptir. İkinci yöntem, kollajen hizalamasını indüklemek için polimerizasyon sırasında manyetik boncuklar ve bir manyetik alan kullanır13,14. Karmaşık olmayan ekipmanlarla bu yöntemden iyi sonuçlar elde edilebilir, ancak polimeri manyetize etmek için antikorların veya başka bir yöntemin kullanılmasını gerektirir. Bu nedenle, kullanımı biraz pahalı olabilir ve kollajen jelinin sertliği, ağdaki artan bağlantılar tarafından potansiyel olarak değiştirilir. Ayrıca, bu işlemde kullanılan manyetik boncuklar genellikle otofloresandır ve bu da görüntüleme deneyleri için sorunludur. Son olarak, hizalama PDMS mikroakışkan kanalları3,15,16 tarafından oluşturulabilir. Bu yöntemde kollajen hizalaması, polimerize kollajenin küçük mikroakışkan kanallardan akıtılmasıyla sağlanır. Bu mikroakışkan kanallar çok sayıda tasarımda yapılabilir ve birçok platforma kolayca uyarlanabilir. Ayrıca, küçük boyutları nedeniyle çok küçük miktarlarda kollajen ve diğer reaktifler kullanıldığından çok ekonomiktirler.

Burada, hücreleri 3 boyutlu, fibriller kollajen hidrojel içine gömmek için basit bir protokol verilmiştir. Ek olarak, kollajen matrisinin organizasyonunu ve hizalamasını kontrol etmek için PDMS mikroakışkan kanallarının kullanıldığı daha gelişmiş bir teknik de sağlanır. Bu protokol birçok platforma kolayca uyarlanabilir ve 3 boyutlu, fizyolojik bir mikro ortamda hücre göçü, hücre bölünmesi ve diğer hücresel süreçlerin araştırılması için hem hizalanmış hem de rastgele kollajen matrislerini tekrarlanabilir şekilde üretebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nötralizasyon, seyreltme ve 3D Soruşturma ve Hücresel Daralma Tahliller için Kollajen Çözümleri Polimerizasyonu

  1. steril doku kültürü kaputu buz üzerinde, kolajen (1: 1) ile nötralize 2x PBS içinde steril, buz gibi soğuk 100 mM HEPES, 15 ml konik bir tüp içinde pH 7.4 ile. çözüm homojen ve karıştırma girdaplar artık görünür olana kadar plastik pipet ile iyice karıştırın. karıştırma işlemi sırasında hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun. Buz üzerinde kısaca saklayın.
  2. Hücre ortamı ile uygun bir konsantrasyona (vb RPMI, DMEM, gibi), nötrleştirilmiş kollajen seyreltilir.
    1. N = (D V *), V / (S / 2), N gerekli nötralize kollajen miktarı burada, İstenen kollajen konsantrasyonu olduğu denklem kullanarak, arzu edilen kollajen konsantrasyonunu yapmak için gerekli olan nötralize kolajen miktarını hesaplamak için istenilen kollajen konsantrasyonu son hacim ve S to hisse senedi kollajen konsantrasyonu başlangıç.
    2. Hücre ve Hücre ortamı çözeltisi eklenerek hacim nötralize kolajen miktarını getirin. İyice karıştırın ve döküm için hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
      1. Örnek: (6 plaka veya 50 mm cam alt çanak jel döküm için tipik hacim), 2 mg / ml 1 ml jel hacminde jel, ilk istenilen son hacme göre, istenen konsantrasyonda (2 mg / ml) çarpma (1 mi). Bu numarayı (2 mg) alın ve şişe üzerinde listelenen stok konsantrasyonu (9.49 mg / ml) yarı yarıya bölün. Bu durumda, nötralize kollajen 0.42 ml ortam / hücre karışımı 0.58 ml ile sulandırılır.
  3. Pipetleyin olmayan bir doku kültürü içine ya buz gibi soğuk kollajen / hücre / medya karışım 6-plaka veya 50 mm cam alt çanak tedavi. eşit çözüm yaymak için pipet ucu kullanın.
    NOT: collag dışındaki hücre eki veya büyümesini en aza indirmek için tedavi plaka olmayan bir doku kültürü kullanmak önemlidirjel En.
  4. 15 dakika - yaklaşık 10, oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. jeller polimerizasyon üzerine opak dönmelidir.
  5. polimerizasyonu bitirmek için 60 dakika - opak döndü sonra, ek 45 37 ˚C için plaka veya çanağı hareket.
  6. 45 Sonra - kuyu veya yemeğin çevresinde P200 pipet ucu çalıştırarak iyi yanlarından jeller medya 3 ml ve bırakın - 60 dakika, 2 ekleyin. Girdap çanak yavaşça jel serbest bırakmak için. kolajen jel ortam yüzen olmalıdır.

2. Western Blot, Celi Morfogenez ve Jel Gontractility Deneyi

  1. 10 gün deneyi - 7 için hücreleri ile seribaşı, 1.6 - sertliği ECM ile ilgili olarak protein düzeylerinin, morfolojisi veya hücresel kontraktilite değerlendirmek için, 1.1 göre kollajen jeller dökerek başlar. büyüme hızı ve confluency bağlı ampirik her hücre hattı ekim oranını belirlemek. 100.000 hücre / jel - 10 günlük bir deney için, tohum yoğunluğu 20,000 arasında olabilir.
  2. ÖlçmekHücre kasılması, bir cetvel ya da bir kamera her 24 saat kullanarak veya uygun bir zaman aralığında jel çapını ölçün.
    Not: Buna ek olarak, mikroskop toplanan karşılık gelen görüntüler gibi acininin benzeri yapılar, epitelyal tübüller, cep çıkıntılar ve lameliapodia olarak, jel tohumlandı hücre çizgisinin morfolojik özellikleri karakteristikleri için incelenebilir.
  3. Protein düzeylerini değerlendirmek Wozniak ve ark., 17 ve Gallagher et al. 18 de tarif edildiği gibi ilgi duyulan proteinlerin Western blot analizi için RIPA jeller tampon lize edildi ve prosesi ile ilgilidir.
    1. ÖNEMLİ: hücre hatları arasında kontraktilite karşılaştırmalarda, Lui tarafından belirtildiği gibi jeller elde edilebilir toplam DNA, için kasılma normalleştirmek, vd 19 veya Batı tarafından değişmeyen, temizlik proteini (histon, GAPDH, vb). blot analizi, Wozniak ve ark., 17 ve Gallagher et al de tarif edildiği gibi. 18. jel içinde sayma hücreler hemasitometre kullanarak ise, hücreleri konsantre olacak müteahhitlik jel gibi toplam jel alanına hücre sayısını normalleştirmek için emin olun.
  4. ortam 1 ml çıkarılması ve taze ortam 1 ml ile değiştirilmesi yoluyla 4 gün - Besleme jeller her 3. Ölçüm kontraktilitesinde ani bir artış neden olur taze medya / serum ilave olarak alındıktan sonra jeller beslemek için emin olun.

Kollajen Fiber Uyum PDMS Mikrokanallarda 3. Nesil

Not: hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için, PDMS mikro kanallarda (Şekil 2A) için bir kalıp yumuşak litografi 15 aracılığıyla yapılan bir SU-8 silikon ustası gerektirir.

  1. PDMS kanalları yapmak için, bir zanaat sopayla tek kullanımlık fincan iyice PDMS karıştırın. 6 inç silikon ana için, sertleştirme maddesi 2 g elastomer tabanı 20 g karıştırılır.
  2. Gazlardan bir vakum basıncı altında bir vakum odasındaki tek fincan yerleştirerek PDMS karışımı550 mm Hg. Gazlardan 1 - 1.5 saat.
  3. PDMS de-gazla birlikte, dökme için silikon ustası hazırlamak. Silikon usta tarafından izlenen bir ocak üzerine asetat film temiz bir levha koyarak hazırlayın. Mikrokanal kalıp yukarı baktığından emin olun.
    NOT: PDMS döküm ve kür sırasında, silikon ana asetat film iki levha arasına sıkışmış olacak.
  4. 1 Sonra - 1.5 saat, vakum odasından de-gaz verilerek PDMS kaldırmak ve yavaş yavaş silikon usta üzerine dökün.
    ÖNEMLİ: hava kabarcıkları kaçının. master merkezinde dökün ve yerçekimi eşit bir şekilde yaymak için izin devam edin.
    NOT: PDMS açılan ana kenarına kadar tüm yol genişletmek gerek yoktur.
  5. PDMS ustanın üzerine döküldükten sonra, silikon master ve PDMS üstüne asetat film bir ikinci tabaka uygulayın. Dikkatle, hava kabarcıklarını önlemek için aşağı PDMS / silikon ustanın üstüne ikinci şeffaflık sayfasını döndürün. Acele etme. PDMS artık eşit o yayılmalıdırver usta.
  6. Yavaşça 1/8 "akrilik levha takip şeffaflık üstüne bir lastik levha, yerleştirin.
  7. akrilik levha üstünde üç 10 lb ağırlıkları ekleyin. Başlangıçta, ağırlıklar "yüzer" olacaktır. Onları daha fazla devam etmeden yerleşmek ve stabilize etmek için izin verin.
  8. 4 saat 70 ˚C ve tedavi PDMS ocak gözü sıcaklığı ayarlayın. rahatsız önce 1 ek hr az soğumasını bekleyin.
  9. Dikkatle gofret asetat film üst tabakayı soyun ve bir forseps ile kanalları kaldırmak.
  10. hazır olana kadar tozsuz çanak saklayın kullanın.

Kullanım 4. Hazırlayıcı PDMS mikro kanallar

  1. baş aşağı yeni, temiz asetat film üzerine yerleştirin kanalları. Keskin bir forseps ile dairesel hareketler kullanarak temizleyin tüm bağlantı noktaları (Şekil 2b). PDMS herhangi parçaları kaldırın.
  2. Bir çakmak bez olarak bant ambalaj bir parça kullanarak temiz kanalları. tezgah yüzeyinin (yukarı yapışkan tarafı) bant yapıştırıp, sonra kanal o setn üst. iyi temas sağlamak için forseps yuvarlak ucuyla kanallarda bastırın. Çıkarın ve görünür artıklar kadar her iki tarafta da tekrarlayın.
  3. Aktarım temizlenmiş,% 70 EtOH ile 50 ml'lik bir konik içine PDMS kanalları prepped. 30 saniye boyunca en yüksek hızda vorteksleyin. EtOH atın ve taze% 70 EtOH ile değiştirin. kadar hazır% 70 EtOH mağaza kullanmak için.
  4. doku kültürü kaputu ve aseptik teknikler kullanılarak yılında temiz ve steril cam kapak veya cam alt yemekler PDMS kanalları aktarın. EtOH çekinceye kadar kanal tarafı yukarı ve UV tedavi koyun.
  5. kanallar coverglass aşağı doğru bakacak böylece bir kez kuru, PDMS çevirin. iyi bir sızdırmazlık yapmak için camın üzerine PDMS kanalı aşağı doğru bastırın. Kapsayacak şekilde steril PDMS bir yama ekleme / merkez noktasını kapatın (port B Şekil 2b). Devam etmeden önce iyice kurumasını bekleyin.
  6. Ön kaplama, steril su içinde 10 ug / ml kolajen kanalın içinde. kaplamak için, bir chann üstüne bir 100 ul damlacık yerEl ve vakum ile doğru çizin. 37 ° C'de 1 saat sonra, bir buzdolabı kollajen kaplama solüsyonu ile doldurulmuş aktarım kanalları. 30 dakika - yaklaşık 15 soğutun.
  7. Aspiratör veya pipet ile kollajen kaplama çözümü çıkartın ve kollajen hazırlık başlar.

Mikrokanallarda Kullanım 5. Kollajen Hazırlık

  1. 2x PBS, pH 7.4 içinde, buzla soğutulmuş 100 mM HEPES: Buz üzerinde, kolajen (1: 1) etkisiz hale getirir. homojen hale gelinceye kadar iyice karıştırın (Daha fazla bilgi için, bölüm 1.1).
  2. hücre medya ile uygun konsantrasyonlarda için nötralize kollajen seyreltin (Daha fazla bilgi için, bölüm 1.2). Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin.
  3. Aynı zamanda, soğutma, buz üzerinde kanal monte edilebilir.
    NOT: amaç altında 4 ˚C veya kanal işlemi için tüm bileşenleri sahip olmaktır. Kollajen çekirdeklenme sıcaklığı ve süresi polimerizasyon işlemi için anahtar parametreler ve gerekirse daha fazla optimizasyon için başlangıç ​​noktası olabilir.
  4. CounBu zamanda uygun tohumlama yoğunluğunda bir hemasitometre ve tekrar süspansiyon T hücreleri. 3.000.000 hücre / ml - hesaplamalar kolaylığı için, 1 ila yeniden süspanse edin. (Daha fazla bilgi için, aynı zamanda bölüm 2.1).
  5. Hücreler sayılmış ve 15 dk geçtikten sonra, dökme kolajen geçin.

6. Bağlantısızlar ve Random Kollajen mikro kanallar dökme

  1. kanallardan kollajen çizmeden önce, ayarlamak ve bir satır içi vakum regülatörü ile vakum basıncını ayarlayın. Vakum basıncı neden ve hizalama derecesini belirler kolajen akış hızını kontrol etmek için bir kuvvet sağlar.
    1. rastgele veya hizalanmamış matrisler için, 10 mm Hg veya daha düşük bir vakum basıncı ile geniş bir kanal (3 mm genişlik x 200 mm boyunda) kullanın.
    2. hizalanmış matrisler için, 60 mm Hg ya da daha yüksek bir vakum basıncı ile dar bir kanal (1 mm genişlik x 200 mm boyunda) kullanın.
  2. buz monte kanalı çıkarın ve laminer akış h temiz, sterilize bir yüzeye yerleştirinood.
  3. (Şekil 2b) port A içine nötralize kollajen 150 ul - hızlı çalışır ve 120 yükleyin.
  4. C çıkışı (Şekil 2b) üzerindeki vakum hattına bağlı bir 25 ml'lik pipet yerleştirerek kanal boyunca kollajen çizin. Tek, tek biçimli bir hareketle aracılığıyla kollajen çizin. ÖNEMLİ: rastgele veya hizalanmamış matrisler için, kanal genelinde yavaşça kolajen çizin (yaklaşık 0,5-1 saniyede mm) ve sonuna ulaştığında durur. hizalanmış matrisler için, daha hızlı karşısında kollajen çizmek, ama hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterin.
  5. Dikkatle P200 Pipetman veya aspiratör ile liman bölgesinden aşırı kollajen çıkarın.
  6. A ve C. Tüm bağlantı noktaları şimdi ele alınmalıdır hem bağlantı noktaları üzerinden steril PDMS yamaları yerleştirin.
  7. 2 Sonra - 3 dakika, merkez PDMS yama (port B) çıkarın ve 2 eklemek - merkez portuna - (10 bin hücre 5) hücrelerin 3 ul. 15 dakika - kısmen bir 10 Oda sıcaklığında (opak dönüş) polimerize olmaya bırakın.
  8. 10 sonrası- 15 dakika, ek 15 37 ˚C transfer - polimerizasyon bitirmek için 30 dakika. PDMS kapaklarını çıkarın ve gerektiği gibi tamamen kanal ve kültür hücreleri kapsayacak şekilde medyayı ekleyin. Hücreler, eski medya ml çıkarılması ve yeni medya ml değiştirerek beslenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D deneyler kollajen jel ile aynı sertlik içinde yapılabilir ise, jel sertliği farklı hücreler, hücresel mikro-mekanik değişikliklere cevap verecek belirlemek için kullanılabilir. Bir sert kollajen hidrojel gömülü hücreler lokal çevredeki kolajeni sözleşme edemiyoruz bir jel olarak tanımlanır. Farklı hücre tipleri iç kontraktilite benzersizdir ve bu nedenle uyumlu bir şekilde ve sert algılanan olan kollajen konsantrasyonunu belirlemek için basit bir kontraktilite eğrisi ile başlamak en i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D kollajen jeller hücreleri yorumlamak anlamak ve kendi yerel mikroçevresinin yanıt vermek alet değerli bir katkı vardır. Bu el yazması bir 3D kollajen matriks içinde hücreleri gömmek için çok temel bir protokol sağlamıştır ve tekrarlanabilir rastgele veya hizalanmış kollajen lifleri ile matrisler oluşturmak için. Her iki protokol, farklı kollagen izoformlar, çapraz bağlayıcılar, ve diğer matris proteinleri, potansiyel olarak polimerizasyon sırasında ilave edilebilir şekilde adapte platformlar çalışır. Ayrıca, gen ifad...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışmayı finanse edilmesi için hibe numaraları UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 ve T32-GM008692-18 kabul etmek istiyorum. Biz de BT-YANGIN analizi ile geliştirilmesi ve yardım için loci Jeremy Bredfelt ve Yuming Liu kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yüksek Konsantrasyonlu Sıçan Kuyruğu KollajenCorning354249
SylGard184 elastomer kitiPDMS kanalları içinCorningNC9285739
HEPES nötralizasyon tamponuHEPESFisherBP310
KCl HEPES nötralizasyon tamponu içinFisherBP366
KH2< / sub>PO4< / sub> HEPESnötralizasyon tamponu içinFisherBP362
Na2< / sub>HPO<>sub4< / sub> HEPESnötralizasyon tamponu içinFisherS374
NaClFisherBP358HEPES nötralizasyon tamponu
için Levy Geliştirilmiş Neubauer HemasitometreFisher15170-208hücre sayımı
6 oyuklu doku dışı kültür plakası Corning351146
50 mm cam alt çanakMatTekP50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastik Vakum KurutucuBel-ArtF4200-2021PDMS şeffaflık filmi için gaz giderme odası
 3Mpp2950Pdms kanallarını dökmek için plastik film
ThermoScientific CimaRecThermoScientific HP141925PDMS mikro kanallarını sertleştirmek için sıcak plaka
Vakum regülatörüHassas MedikalPM3100Kollajen mikrokanallar için vakum regülatörü
8" x 8" kauçuk levhaAmazon - Kauçuk-CalPDMS mikro kanalını dökmek için60A
8" x 8" x 0.125" akrilik levhaAmazonPleksiglas levhalar
10 lb ağırlıklarAmazonPDMS mikro kanallarını dökmek içinhalter
15 ml Konik tüplerFisher352097
50 ml Konik tüplerFisher352098
Plastik pipetlerDot Scientific229202B, 229206B ve 667225B2  ml, 5  ml ve 25 nbsp; ml
%70 EtOHFisherNC9663244
Elastomeriçin Silikon - kauçuk levha PDMS mikro kanallarını dökmek için CAP

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
  2. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38(2006).
  3. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
  4. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).
  5. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
  6. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
  9. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  10. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  11. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
  12. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11(2008).
  13. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
  14. Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
  15. Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
  16. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
  17. Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
  18. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18(2008).
  19. Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14(2013).
  20. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
  21. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007(2014).
  22. Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B Kolajen JellerKolajen Matriks HizalanmasPDMS MikrokanallarKolajen PolimerizasyonuH cre G DeneyiYumu ak LitografiVakumlu Gaz GidermeKolajen Ak H z3B H cre K lt rH cre D Matriks

İlgili makaleler