Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

10.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53995

⸱

20 Eylül 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

Bu makalede

Özet

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Özet

İnsan primer villöz sitrotrofoblastları, plasental fonksiyonları ve düzenleyici mekanizmaları incelemek ve gebelikle ilgili hastalıkları anlamak için çok yararlı bir primer hücre kaynağıdır. Bu protokolde, standart bir DNaz/tripsin protokolü ile plasentalardan taze izole edilen insan primer villöz sitrofoblastları, küçük enterferans yapan RNA (siRNA) ile mikroporasyona tabi tutulur. Bu yaklaşım, lipofeksiyon bazlı bir yöntemle karşılaştırıldığında siRNA transfeksiyonu için daha fazla verimlilik sağladı. Transfekte edilmiş hücreler daha sonra transfeksiyondan sonraki 3-4 günlük bir zaman dilimi içinde standart Western blot ile analiz edilebilir. Ek olarak, kültürlenmiş primer villöz sitrofoblastlar kullanılarak, Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA) analizi optimize edildi ve 1 ila 4. günler arasında ekstraktlar üzerinde gerçekleştirildi. Bu kültürlenmiş primer hücrelerin kullanımı ve tarif edilen protokol, villus sitotrofoblast benzeri bir hücre tabakasına villus sitrofoblast farklılaşması sürecinde spesifik genlerin ve transkripsiyon faktörlerinin etkisinin değerlendirilmesine izin verir. Bununla birlikte, kültürde izin verilen sınırlı zaman aralığı, kararlı bir hücre popülasyonunun oluşturulması gibi daha fazla zaman gerektiren yöntemlerin kullanılmasını engeller. Bu nedenle, bu hücre popülasyonunun test edilmesi, yüksek düzeyde optimize edilmiş gen transfer protokolleri gerektirir.

Giriş

İnsan plasental disfonksiyonu, preeklampsi ve intrauterin büyüme kısıtlaması gibi gebelikle ilişkili çeşitli hastalıkların gelişimi ile ilişkilidir 1. Plasentanın önemli bir hücre bileşeni, ekstravillöz veya villöz sitrotrofoblastlar olarak sınıflandırılabilen trofoblastlardır. Füzyon üzerine, villöz sitotrofoblastlar, feto-maternal değişim ve hormon üretiminde önemli bir role sahip çok çekirdekli bir hücre yapısı olan sinsityotrofoblast tabakasına daha da farklılaşır 2. İnsan primer villöz sitrofoblastları ve bunların farklılaşmış muadilleri, önemli biyolojik örnekleri temsil eder ve araştırmacıların kültürde hücre füzyonu gibi plasenta ile ilgili bir dizi süreci incelemesine izin verir. Ayrıca, gebeliğe bağlı hastalıklara özgü koruyucu tedavileri geliştirmek ve uygun yönetimi kolaylaştıracak belirteçleri belirlemek için önemli çabalar devam etmektedir. Laboratuvarlar, plasenta villus 3'ün tripsin sindirimine dayanan standart bir izolasyon prosedürü kullanarak, primer insan villöz sitrofoblastlarını taze plasentalardan rutin olarak izole eder. Kültürlenmiş sitotrofoblastlar, kültür 4 üzerinde sinsityotrofoblast benzeri bir tabaka halinde çoğalma ve hızla farklılaşma kapasitelerini kaybettikçe, çok verimli transfeksiyon yöntemlerine ve optimize edilmiş analiz yaklaşımlarına ihtiyaç vardır. Önceki çalışmalar, bu primer sitotrofoblastların 5 transfeksiyonunun optimal koşullarını belirlemiştir. Burada, daha önce bu hücre tip 6'da test edilmiş olan farklı bir siRNA transfeksiyon yöntemi sunulmaktadır. Lipofeksiyon bazlı bir yaklaşımla karşılaştırıldığında, bu mikroporasyon yöntemi, belirli genlerin susturulma derecesi ile değerlendirildiği gibi transfeksiyonu iyileştirir.

Promotör ve gen ekspresyon çalışmaları da plasenta fonksiyonunun daha iyi anlaşılmasını sağlar. Primer villöz sitrofoblastların kültürlenebildiği kısa zaman dilimi nedeniyle kullanımı daha zor olmasına rağmen, daha önce yayınlandığı gibi standart protokoller kullanılarak yapılan promotör analizleri yine de ele alınabilir 7. Elektroforetik Mobilite Kaydırma Testi (EMSA), DNA-protein etkileşimlerinin hızlı ve kolay bir şekilde izlenmesini sağlayan, yaygın olarak kullanılan in vitro yöntemlerden biridir. Bu birincil trofoblastlardan elde edilen nükleer ekstraktlar, belirli etkileşimler için Syncytin-2 promotörünün, bir bölgesini test etmek için kullanıldı. Sonuçlar, bağlı faktörlerin kültürün farklı zaman noktalarında ve belirli ve tekrarlanabilir bir şekilde tespit edilebileceğini ortaya koydu.

Bu protokolde sunulan veriler, transfeksiyon yaklaşımımızın ve EMSA protokolünün izole primer villöz sitotrofoblastlar için kullanılabileceğini ve normal veya patolojik koşullarda villöz sitrofoblastların çeşitli fonksiyonlarını incelemek için çok faydalı olacağını doğrulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Uqam etik kurul Centre Hospitalier Universitaire de Montréal St-Luc Hastanesi (Montréal, Kanada) etik komitenin kurallarına uygun olan bu protokolleri onayladı. Katılımcılar bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı.

1. Orta Hazırlama ve İlköğretim Villöz sitotrofoblastlar İzolasyonu

  1. 25 mM HEPES,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ilave etmek suretiyle, insan primer villöz sitotrofoblastlar için kültür ortamı hazırlayın. Bir steril 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden hazırlanan orta filtre -20 ila 50 ml'lik alikolar içinde ° C sıcaklıkta dondurucuya.
  2. Standart protokoller 3 Aşağıdaki taze plasenta primer villus sitotrofoblastlar izole edin.
    1. villöz doku kaldırmak için dikkatli olurken pense kullanarak, kapalı çizilme hafifçe tarafından dokudan fetal membran kaldırmak. Cutneşter ve makas kullanılarak yaklaşık 3 x 3 cm küp plasental villuslar kalan. İyice anne kanı çıkarmak için% 0.9 NaCl içeren su ile yıkayın.
      1. pense ile her küp Holding, dikkatle kalan gemiler ve fibröz doku kullanarak makasları villöz doku kaldırmak.
      2. Ve deoksiribonükleaz I (DNase I) (, villöz doku 15 ila 30 mg, (nihai konsantrasyon 1.2 mg / mL 9,6 x 10 5 1.8 x 10 6 U) Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ihtiva eden tripsin dört kez sindirimi sürekli çalkalanarak bir su banyosu içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika süreyle nihai konsantrasyon 200 mg / ml).
        Ikinci sindirim için 100 ml ve kalan iki sindirim için 75 ml ilk sindirim için 150 ml toplam hacmi kullanın: Not.
    2. Frensiz 15 dakika 1250 xg'de dağılmış hücreleri ve santrifüj içeren süpernatant toplayın. içeren prewarmed DMEM 1 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın% 1 penisilin / streptomisin.
    3. Fren yapmadan 507 x g'de 23 dakika boyunca% 70 polivinilpirolidon kaplanmış silika gradyanı (gradyan hazırlanması için Tablo 1 'e bakınız) ve santrifüj - bir süreksiz% 5 üstünde dağılmış hücrelere katman. Aspirasyon ile 1.033 kadar 1.017 arasındaki yoğunluk tabakası kaldırmak ve yeni bir pipet ile degrade% 40 ile% 50 arasında katmanları toplamak. % 1 penisilin / streptomisin içeren DMEM önceden ısıtılmış 10 ml ile iyice hücreleri yıkayın.
      Not: Toplanan fraksiyon trofoblast barındıran 1.048 ile 1.062 arasında yoğunlukları karşılık gelir.
    4. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Kısaca, hücreler karıştırmak ve yeni bir mikrosantrifüj tüpü içinde 10 ul ekle. Tripan mavisi 10 ul ekleyin ve hafifçe tekrar karıştırın. hücre süspansiyonu çizin ve hemositometre odaları doldurun. 10X objektif altında hücreleri saymak.
    5. 1 x 10 6 ve 4.5 x 10 bölümden 1.3 ve 2 kullanılmak üzere ayrı tüpler içine 6 hücre, ilgili koyunly. Diğer deneyler için 4 günlük bir süre için CO2, 37 ° C / de desteklenmiş DMEM aracı maddesi ve kültür 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda kalan hücreleri, tohum ve% 5.
  3. İzole primer villus sitotrofoblastlar saflık değerlendirilmesi
    1. Sıkma 300 x g mikrosantrifüj tüpleri içinde yeni izole edilmiş sitotrofoblastlar 1 x 10 6. Süpernatant atılır ve önceden ısıtılmış fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 ml. Santrifüj hücreleri 300 xg'de ve aspirasyon ile PBS kaldırmak.
    2. hücrelere soğuk metanol 1 ml ilave edilir ve 20 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin. 5 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücreleri ve aspirasyon ile metanol kaldırın.
      Dikkat: metanol taşıma sırasında teneke kutu maske, koruyucu gözlük ve lastik eldiven kullanın.
    3. 300 xg'de hücreleri, santrifüj rehidrate ve aspirasyon ile PBS çıkarmak için oda sıcaklığında PBS 1 ml ilave edilir.
    4. FBS (1:50 [hacim / hacim] seyreltme) bir FcR içeren PBS içinde inkübe hücreleriOda sıcaklığında 45 dakika boyunca reaktif (1:10) bloke spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için.
    5. 5 dakika boyunca 300 x g'de oda sıcaklığında 500 ul PBS, santrifüj hücreler iki kez yıkayın ve aspirasyon ile PBS kaldırmak. 100 ul oda sıcaklığı PBS içinde süspanse edin hücreleri.
    6. ya da oda sıcaklığında 45 dakika boyunca% 0.2 BSA içeren PBS içinde bir kontrol izotip eşleştirilmiş spesifik olmayan antikorda: bir fare monoklonal floresein izotiosiyanat (FITC) ile inkübe hücreleri anti-insan sitokeratin-7 antikoru klonu LP5K (200 1) ile konjüge edilmiş karanlık. PBS hücrelerin yıkayın.
    7. Flow sitometri 3 hücreleri analiz edin. başka deneyler için akış sitometrisi ile% 96 CK-7-pozitif hücrelerin en az göstermektedir hücre preparatları kullanın.

Insan primer Villöz sitotrofoblastlar 2. siRNA transfeksiyonu

  1. Bir mikro-gözeneklendirmeden cihazı kullanılarak insan primer villöz sitotrofoblastlar transfeksiyonu
    1. ihtiva eden 6 oyuklu plakalar hazırlamakmicroporated hücre inkübasyon için desteklenmiş DMEM aracı maddesi 2 ml.
    2. Birincil sitotrofoblastlar (Bölüm 1.2) izole edildikten sonra, süspansiyon içinde hücrelerin bir kısım almak ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı belirlenir.
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile mikrosantrifüj tüpü ve topak hücrelere 1.5 x 10 6 hücre transfer edin. 1 mi Dulbecco PBS (DPBS) (Mg2 +, Ca2 + içermeyen) hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
    4. Süpernatantı ve yeniden süspansiyon haline getirme tamponu 100 ul yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri.
      Oda sıcaklığında uzun süre, 15-30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu tutmak önlemek hücre canlılığı ve transfeksiyon etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için: edin.
    5. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne Syncytin-2 siRNA (ya da kontrol-şifreli siRNA) 300 ng ekleyin ve bir 100 ul transfeksiyon pipet kullanarak hücre siRNA karışımı aspire. Ekleistasyona pipet (Malzeme listesi) ve 30 milisaniyelik bir 1.300 V tek darbe hücreleri tabi.
    6. Hemen, hücre hasarı önlemek için, 37 ° C önceden ısıtılmış ilave ortam içeren (aşama 2.1.1 hazırlandı) 6 çukurlu plakalara hücreleri transferi.
    7. Kalan numuneler için 2.1.5 ve 2.1.6 adımları.
    8. Yavaşça hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için 30 saniye için plaka sallayın. 24 ila 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe plakası. kültür ortamı transfeksiyondan 24 saat sonra yenileyin.
    9. Western blot analizi ile transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek (adımlar 6 3'e bakın).
  2. İnsan birincil sitotrofoblastlar siRNA lipofeksiyon-
    1. Villöz sitotrofoblastlar ve izole edildikten sonra, kültür ortamı 2 ml 6 yuvalı plakalar içinde oyuk başına 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda hücreler tohum ve 18 saat inkübe edilir.
    2. Syncytin-2-spesifik siRNA 300 ng seyreltin (veya kontrol-şifrelisiRNA) ve antibiyotiğe ve serum barındırmayan ortam, 10 ul toplam hacim içinde, ayrı 1.5 ml tüpler lipid bazlı transfeksiyon reaktifi 5 ul. 5 dakika boyunca inkübe edin.
    3. seyreltilmiş reaktifler karışımı ve transfeksiyon kompleksi oluşturmak üzere, oda sıcaklığında, ilave bir 20 dakika boyunca inkübe edin. 100 ul'lik nihai bir hacme kadar karışıma antibiyotiğe ve serumsuz ortam içinde 90 ul ekle.
    4. 6-delikli plakalardaki (aşama 2.2.1) kültür ortamının çıkarın. 2 taze ortam ilave edildi ve her bir oyuğa 100 ul transfeksiyon karışımı ekleyin. 24 ila 48 saat boyunca bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe hücreleri. kültür ortamı transfeksiyondan 24 saat sonra yenileyin.
    5. Western blot analizi ile transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek (adımlar 6 3'e bakın).

Tüm hücre kültüründen Lisatlar 3. hazırlanması

  1. Ortamı çıkarın ve önceden ısıtılmış DPBS kullanarak (adımlarda 2.1.8 ve 2.2.4 den) her durulama (2+ Mg Ca 2 + ücretsiz). DPBS aspire ve% 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 500 ul ilave edin. Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 1-3 dakika boyunca inkübe edin. Serum içeren büyüme ortamı 500 ul ekleyerek tripsin tedaviyi durdurun.
    Not: Uygun ortam hacminin şişe / çanak türüne göre: 10 7 hücre / 100 mm tabak / 150 cm2 şişe başına 1 mi; 5 x 10 6 hücre / 60 mm tabak başına 0.5 ml / 75 cm2 şişe.
  2. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hücreleri aktarın, pelet hücreleri. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile DPBS ile (Mg2 +, Ca2 + içermeyen) ve topak hücreler yıkanır.
  3. Dikkatle pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. buz üzerinde tüp yerleştirin. 50-200 ul buz soğukluğunda Radyo-immünopresipitasyon deneyi (RIPA), tampon (tampon bileşimi için Tablo 2'ye bakınız), taze ilave içeren pelletini1x nihai konsantrasyonda Ed proteaz ve fosfataz inhibitörleri. Kısaca, tüp vorteks ve 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın.
  4. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de dönerler. Dikkatle buz üzerinde tüp yerleştirin. Bir pipet kullanarak, buz üzerinde tutulan bir taze, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne süpernatantı aktarın. pelet atın.

Kültürlenmiş hücrelerin çekirdek özütleri 4. hazırlanması

  1. Her bir (adım 1.2.5) için, önceden ısıtılmış DPBS (Mg2 +, Ca2 + içermeyen), 1 ml ile iki kez kültür sitotrofoblastlar yıkayın. Aspire DPBS ve% 0.25 tripsin / EDTA, 500 ul ekle. Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 1-3 dakika boyunca inkübe ve serum ihtiva eden büyüme ortamı içinde 500 ul eklenmesiyle tripsin tedavisi dur.
  2. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hücreleri aktarın, pelet hücreleri. Santrifüj DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -ücretsiz) ve pelet hücreleri hücreleri yıkayınOda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 xg'de. Dikkatle pelet bozmadan tüm süpernatant kaldırmak ve buz üzerinde tüp yerleştirin.
  3. üreticinin talimatlarına uygun olarak, nükleer protein ekstresi. Protein ölçümü tahlili (Bradford ya bisinkoninik asit deneyi (BCA)) kullanılarak, her numunenin protein konsantrasyonu belirlenir.

5. Numune Hazırlama ve Elektroforez

  1. Bir protein miktar tayini kullanılarak, her hücre ekstresi protein konsantrasyonunu belirleyin (örneğin, Bradford 8 veya BCA 9).
  2. (Antikorlar azaltılması ve denatürasyon koşulları kullanılabilir ise), üreticinin talimatlarına uygun olarak, toplam proteinin 20-30 ug 2x Laemmli numune tamponu (Tablo 2) bir eşit hacmi ekleyin.
  3. 5 dakika boyunca 100 ° C'de kaynatılır hücre lizatlan. tekrarlanan donma / erime döngülerinden kaçınmak ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de, kalan tüplerini muhafaza etmek üzere lizatının kısım 50-100 ul.
  4. Numunelerin ısıtılmasıyla iken, tampon (Tablo 2) çalıştıran 1x 1 L hazırlar.
  5. bir kaç saniye için 16,000 x g'de örnekleri Spin ve buz üzerine yerleştirin.
  6. Molekül ağırlığı işaretleyici ile birlikte, bir% 12 SDS-PAGE jeli (jel bileşimi için Tablo 2'ye bakınız) her kuyuya proteinin eşit miktarda yükleyin. 100 V 2 saat 1 için jel çalıştırın

6. Membran Gel dan Protein aktarma

  1. 1 dakika boyunca metanol ile poliviniliden florit (PVDF) membran aktive ve 1X transfer tamponu /% 10 metanol çözeltisi ile yıkayın. üreticinin talimatlarına göre, bir protein boyutuna bağlı olarak 1 saat ile 30 dakika boyunca aktarın.
    Not: Aktarım etkinlik engelleme aşamasından önce Ponceau Kırmızı boyama kullanılarak değerlendirilebilir.

7. Antikor Boyama

  1. Oda sıcaklığında 1 saat ya da gece boyunca 4 ° C de,% 5 engelleme çözeltisi kullanılarak MEMBRAN engeller.
  2. 6 ya da anti-gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH, 0,4 ug / ml; 1: 500) ile birlikte,% 5 bloke çözeltisi içinde gece boyunca: Anti-Syncytin-2 antikor (5.000 1 ila 4 ug / ml) ile membran inkübe 4 ° C (anti-Syncytin-2) ya da oda sıcaklığında 45 dakika karıştırıldı. Tris-tamponlu tuzlu su Tween Membran üç kez yıkayın (TBST tamponu bileşimi için Tablo 2'ye bakınız), 5 dakika boyunca.
  3. Uygun yaban turpu peroksidazı (HRP) ile konjüge edilmiş membran inkübe anti-tavşan veya anti-fare antikor ile (1: 10,000),% 5 1 saat boyunca oda sıcaklığında TBST içinde blokaj tamponunda. 5 dakika boyunca zarın TBST içinde üç kez yıkanır ve daha sonra TBS içinde durulayın. Kemiluminesan tabanlı blot substrat kullanılarak sinyalleri algılar.

Tek sarmal kollu oligonükleotit 8. Radyo-etiketlenmesi

  1. Fosforilasyon reaksiyonu,
    1. mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 U 1 x T4 polinükleotid kinaz tamponu ile bir ön oligonükleotidin 50 ng boyunca eklemeT4 polinükleotid kinaz ve 20 uCi (γ- 32 P) ATP ve nükleaz içermeyen su ile 20 ul reaksiyon hacmi oluşturuyor.
    2. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 0.5 M EDTA 5 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. nükleaz içermeyen su ile 50 ul hacim oluşturuyor.
  2. Oligonükleotidler, adi nükleotid uzaklaştırılması
    1. Imalatçının talimatlarına uygun olarak TE tamponu (Tablo 2) ile dengelenmiş bir G-25 sütunu hazırlayın. taze DNaz-özgür 1.5 ml mikrosantrifüj tüp sütun yerleştirin.
    2. Yavaş yavaş reçine yatağını rahatsız etmemek için dikkatli olmak, reçine üzerinde (adım 8.1.2 itibaren) sonda 50 ul ekleyin. 350 xg 2 dakika boyunca spin bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde saflaştırılmış örnek toplamak için. mikrosantrifüj tüpü içinde toplamak için 350 x g'de 2 dakika süre ile nükleaz içermeyen su ve spin 36 ul G-25 sütunu yıkayın.
  3. komplementer zinciri ol ile hibridizasyonigonucleotide
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne radyo-etiketli prob (86 ul) aktarın ve 200 ters oligonükleotidin ng ve tavlama tampon 1x (Tablo 2) ekleyin. Isıtma 95 ° C de 5 dakika ve soğutma için gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.
    2. İleri etiketlenmemiş 50 ng eklenerek radyoaktif olmayan iki-şeritli oligonükleotitlerin hazırlanması ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, oligonükleotitlerin ve tavlama tampon 1x tersine çevirir. nükleaz içermeyen su ile 100 ul birimi oluşturacak. Isı ve aşama 8.3.1 de tarif edildiği gibi, oda sıcaklığında tutun.

EMSA için denatüre edici olmayan poliakrilamid jeli 9. hazırlanması

  1. 1.5 mm'lik bir alanı tarak (jel bileşimi için Tablo 2'ye bakınız) ile 4% yerel jel (10 x 12 cm) hazırlayın. distile su kullanılarak tüm cam plakalar temizleyin.
    Not: plakaları SDS gibi, iyonik deterjan tamamen ücretsiz olması önemlidir.
  2. hemen pve levhalar arasında bizim akrilamid çözelti polimerizasyonu (yaklaşık 30 dakika) devam etmek için izin verir.
  3. elektroforez cihazı monte edin ve 0.5x TBE ile deposunu doldurun. Örnek yükleme öncesi 150 V de 1 saat 30 dakika boyunca jel ön çalıştırın.

10. DNA bağlama reaksiyonu

  1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 x jel kayma Bağlama tamponu (Tablo 2) nükleer ekstrakt (aşama 4.3) 10 ug ekleyebilir ve nükleaz içermeyen su ile 10 ul son hacim oluşturur. Bir kontrol olarak, nükleer ekstre içeren bir tüp hazırlanır. Yarışma reaksiyonu için soğuk spesifik olmayan ve spesifik çift kollu oligonükleotit (aşama 8.3.2) 1 ul ekle.
  2. Her reaksiyon için adım 8.3.1 radyoaktif prob 1 ul ekle. 20 dakika için oda sıcaklığında reaksiyon inkübe edin. Reaksiyon başına 10x jel yükleme tamponu 1 ul ekleyin ve bölüm 9'da hazırlanan jel üzerinde her örnek yüklemek.
  3. 15 2 saat için 1 1/2 jel çalıştırınTaşıma işleminden sonra 0 V, bir fosfor ekranın altında bir pozlama kaset içinde bir plastik sargı ve konumda jel ve cam sarın. 24 saat boyunca 4 ° C'de kaseti bırakın.
  4. Pozlama kasetinden ekranı çıkarın ve tarama için fosfor görüntüleme cihazında yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

terimi, gebelik taze plasenta Protokol bölümde sunulan deneyler grubunu yapmak için insan primer villöz sitotrofoblastlar izole etmek için kullanılmıştır. Bunların izolasyonundan sonra, ilk sitokeratin-7 işaretleyici (Şekil 1) kullanılarak sitotrofoblastlar saflığını analiz edilmiştir. Hücre preparatları, böylece, bir monoklon anti-sitokeratin-7 antikoru kullanılarak boyandı. 1 sitometri, standart akış sitometrisi ile analiz primer villöz sitotrofoblastl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

insan plasental fonksiyon ve geliştirme ile ilgili çalışmalar büyük ölçüde çeşitli plasental hücre popülasyonlarının izolasyonu optimize hedefleyen protokoller tarafından geliştirilmiştir. En iyi çalışılmış plasental hücre popülasyonunun biri büyük ölçüde verimli ve güvenilir bir izolasyon izin optimize protokolleri yararlandı çalışma olan villöz sitotrofoblastlar kalır. Bu ayrıca, transfeksiyon ve promotör çalışmaları gibi deneyler, bir dizi izin vermektedir. Daha önce tarif edilen protokol 3 kullanılarak, p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Kanada Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) (# 298527) (BB) bir hibe ile desteklenmiştir. BT kurumsal FARE burs tarafından desteklenmiştir. AV NSERC Graham Bell Ph.D. tarafından desteklenen burs. BB İnsan Retrovirology bir Kanada Araştırma Başkanı (Tier 2) düzenledi. metnini revize yardım için Beatrix Beisner teşekkürler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HBSS olmadan  Ca2+, Mg2+ Sigma#H2387
HBSS (10x)Sigma#14060-057
DMEM Hepesiz Yüksek GlikozGibco#12100-061
Hepes (1 M)Gibco#15630-080
Penisilin-Streptomisin-Neomisin (100x)Gibco#15640-055
Amfoterisin B Sigma#A2411
CaCl2Sigma#C4901
MgSO4.<>sup7H2O Sigma#M
Fetal sığır serumuGibco# 16170-078 
Percoll Sigma#P-1644Yoğunluk gradyanı
için Syncytin-2 siRNAAmbion Life teknolojileri#AM16708
Şifreli siRNAQiagen# SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
Tripsin, tip I Sigma#T8003
DharmaFECT Lipotransfeksiyon  reaktifler GEhealthcare# T-2001-01
Tripsin/EDTAYaşam teknolojileri#25300-062
Proteaz İnhibitörü KokteyliRoche Teşhis#11873580001
Pierce BCA Protein Test KitiThermo Scientific#23225
BSASigma#A7906
TWEEN 20Sigma#P9416 
Anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı antikor Hücre Sinyalizasyonu# 7074
BM Kemilüminesans Western Blotting Substrat (POD)Roche Teşhis#11500708001
DPBS Yaşam teknolojileri#14287-080
T4 Polinükleotid KinazNEB#M0201S
ATP, [γ-32P]Perkin Elmer#BLU002A100UC
AkrilmidSigma 
TEMEDYaşam teknolojileri# 17919
Amonyum PersülfatSigma 
Anti-insan sitokeratin-7 antikor klonu LP5K, FITC konjugeMilliporeCBL194FSeyreltme 1:200
FcR bloke edici reaktif Miltenyi Biotec130- 059-901Seyreltme 1:10
Akış Sitometresi BD Acuri sistemiBecton Dickinson
Microporator MP-100 aparatı Dijital Biyo
Resüspansiyon Tamponu R (Neon Transfeksiyon Sistemi 100  &mikro; l Kit)PVDFMPK10096
 KırlangıçIPVH00010 Metanol ile etkinleştirin
Anti-insan GAPDH antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-1371791:500
At Turpu Peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-tavşan antikoru veya anti-fare antikoruHücre Sinyali# 70741: 10.000
Yaban Turpu Peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-fare antikoruHücre Sinyali# 7076 & nbsp;1:10.000
NE-PER Nükleer ve Sitoplazmik Ekstraksiyon ReaktifiThermo Scientific# 78833
G-25 sütunu GE Healthcare#27-5325-01
Kemilüminesans ve floresan görüntüleme cihazıMontré al BiotechFusion FX5
%4 yerli jelEv yapımı
PBSEv yapımı1x
Kişisel Moleküler Görüntüleyici (PMI) SistemiBioRad
#A9099#A3678 membran yaşam teknolojileri

Kaynaklar

  1. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
  2. Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
  3. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  4. Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
  5. Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
  6. Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
  7. Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468(2015).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  9. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  10. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
  11. Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
  12. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
  13. Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
  14. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  15. Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
  16. Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Mikroporasyon TekniğiEMSA AnaliziAkış SitometrisiWestern BlotSyncytin-2 siRNADNA Protein EtkileşimiPrimer Hücre İzolasyonuHücre Canlılığı
Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.