Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Summary

Damlacık mikroakışkanlarında çok renkli floresan algılama, tipik olarak hacimli ve karmaşık epifloresan mikroskobu tabanlı algılama sistemlerini içerir. Burada, tek bir fotodetektör tarafından toplanan çok renkli verileri geçici olarak kodlamak için bir dizi optik fiber kullanan kompakt ve modüler çok renkli bir algılama şemasını açıklıyoruz.

Abstract

Floresan deneyleri, parlak sinyalleri ve hızlı zaman tepkileri nedeniyle damlacık mikroakışkanlarında kullanılan en yaygın okumalardır. Multipleks deneyleri, enzim evrimi ve moleküler biyoloji ile geliştirilmiş hücre sınıflandırması gibi uygulamalar, iki veya daha fazla floresan renginin tespit edilmesini gerektirir. Boş alan lazerlerini epifloresan mikroskoplara bağlayan standart çok renkli algılama sistemleri hantal, pahalı ve bakımı zordur. Bu yazıda, optik fiberlere bağlı lazerlerle bir mikroakışkan kanalın heyecan verici ayrık bölgeleri ile çok renkli algılama gerçekleştirmek için bir şema açıklıyoruz. Yayılan ışık, tek bir fotodetektöre bağlı bir optik fiber tarafından toplanır. Uyarılma farklı uzamsal konumlarda meydana geldiğinden, yayılan ışığın kimliği zamansal bir kayma olarak kodlanabilir ve daha karmaşık ışık filtreleme şemalarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Sistem, dört benzersiz boya kombinasyonu içeren damlacık popülasyonlarını tespit etmek ve nanomolar altı floresein konsantrasyonlarını tespit etmek için kullanılmıştır.

Introduction

Damlacık Mikroakiskan bir taşıyıcı yağ ¹ içinde süspansiyon haline sulu damlacıkların çok sayıda deney bölümlere yüksek verimli biyoloji için bir platform sağlar. Damlacıklar tek bir hücre analizi ^2, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ³ gibi çeşitli uygulamalarda kullanılan ve evrim ⁴ enzim edilmiştir. Parlak sinyaller ve hızlı zaman yanıtı kilohertz oranlarında alt nanoliter damlacık hacimleri tespit uyumlu olarak Floresan tahlilleri, damlacık Mikroakiskan için algılama standart modu bulunmaktadır. Birçok uygulama, aynı anda en az iki renk için floresans algılama gerektirir. Örneğin, bizim laboratuar yaygın bir tahlil sonucu için bir algılama kanalı kullanmak damlacık sıralama deneyleri PCR aktive gerçekleştirir ve ⁵ tahlil negatif damlacık sayılabilir yapmak için ikincil bir arka plan boya kullanır.

damlacık Mikroakiskan için tipik algılama istasyonları ba vardırEpifloresans mikroskoplar üzerinde sed ve numune odaklı olmak mikroskop içine boş alan lazerler uyarma ışık tanıtmak için ışık manipülasyonlar düzenleri karmaşık gerektirir. floresan bir damlacık yayılan sonra her algılama kanalı dalgaboyu bandında merkezli bir photomultiplier tüp (PMT) kullanır, böylece yayılan fluoresced ışık süzülür. Epifloresans mikroskop tabanlı optik algılama sistemleri nedeniyle gider, karmaşıklık girişine bir bariyer sağlar ve bakım gereklidir. Optik fiberler fiberler elle ayna tabanlı ışık yönlendirme ihtiyacını ortadan kaldırarak, ve ışık yolları fiber optik konnektörleri kullanarak arabirim sağlayan mikroakışkan cihazlar eklenebilir çünkü araçlar, basitleştirilmiş ve sağlam algılama düzeni inşa etmek sağlarlar.

Bu yazıda, optik fiberler An bir dizi kullanarak çok renkli floresan algılama gerçekleştirmek için kompakt ve modüler bir düzeni montaj ve doğrulama tarifda tek fotodetektör ^6. Optik fiberler bağımsız lazer bağlanır ve düzenli mekansal uzaklıklar bir L şeklinde bir akış kanalına dik yerleştirilir. Bir flüoresan toplama fiber uyarım bölgelerine paralel yönlendirilmiş olan ve tek bir PMT bağlanır. Bir damlacık farklı zamanlarda lazer ışınları geçer, çünkü PMT tarafından kaydedilen veriler zamansal kullanıcı damlacık her ayrı lazer ışını tarafından heyecan sonra yayılan floresan ayırt sağlar ofset gösterir. Bu zamansal kayma dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler bir dizi kullanarak ayrı Proje Yönetim Ekipleri yayılan ışık ayırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Dedektörün etkinliğini doğrulamak için, biz farklı renk ve konsantrasyon boyalar encapsulating damlacık popülasyonlarında floresan ölçmek. sistemin duyarlılığı tek renkli floresan saptama için incelenmiş, ve 0.1 nM bir 200x hassasiyet göstr kadar konsantrasyonlarda damlacıklar tespit edilebildiğini gösterirLiteratürde ⁷ bildirilen son elyaf bazlı yaklaşımlar karşılaştırıldığında ovement.

Protocol

1. SU8 Ana Fabrikasyon

1. tasarım yazılımı kullanarak üç katmanlı imalat için mikroakışkan yapıları tasarlamak ve 10 mikron çözünürlükte devre kartı film üzerine bir satıcı tarafından basılan tasarımları var. Cihaz tasarımı detayları ekli referans ^6'da verilmiştir ve kanal geometrileri, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Katmanlar, her imalat tabaka ^8'den özellikleri yan yana koymak yardımcı hizalama işaretleri içermelidir.
2. spin kaplayıcı bir ön temizliği 3 inç çaplı silisyum gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 80 um bir tabaka kalınlığına sağlayan 1,750 rpm'de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır.
3. gofret çıkarın ve 30 dakika süre ile 135 ° C sıcak plaka üzerinde pişirilir. gofret sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
4. Bir paralel 190 m altında ^1. katman maskesine kaplı gofret Açığa3 dakika için LED mil W, 365. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 1 dakika boyunca oda sonra serin bir 135 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin.
5. Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 40 um'lik bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka ile sonuçlanan, 5,000 rpm'de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır.
6. Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın.
7. 1.3 desenli geometri üzerine ^2. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 4 dakika 30 saniye boyunca 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin.
8. Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. daha sonra, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde 30 SU8-3050 1 ml uygulamasan 1000 rpm'de, 100 um bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka elde edilir.
9. Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın.
10. 1.3 desenli geometri üzerine ^3. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 9 dakika süreyle 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin.
11. 30 dakika boyunca, propilen glikol monometil eter asetat içinde karıştırılan bir banyoda daldırarak maskeleri geliştirir. 1 dakika için 135 ° C bir sıcak plaka üzerindeki izopropanol ve fırında gofret yıkayın. polidimetilsiloksan (PDMS) kalıplama için 100 mm Petri kabındaki geliştirilen usta yerleştirin.

2. PDMS Cihaz İmalatı

1. plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g silikon taban 50 g birleştirerek 1 PDMS: 10 hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir döner aracı ile içeriğini karıştırın. deg30 dakika boyunca bir desikatör içinde karışım olarak veya tüm hava kabarcıkları bertaraf kadar devam eder.
2. Master üzerinde 3 mm kalınlığında vermek ve daha fazla gaz alma için desikatörde geri yerleştirmek için PDMS dökün. Bir kez tüm kabarcıklar kaldırılır, 80 dakika boyunca 80 ° C 'de cihaz fırında.
3. desenli tarafı ile temiz bir yüzey üzerinde bir neşter ve yer kullanarak kalıp cihazı kesin ve 0.75 mm'lik biyopsi yumruk ile akışkan giriş ve çıkış yumruk. 120 mikron ve 220 mikron boyunda geometrileri cihazın yan erişilebilir, böylece cihaz kesmek gerekir.
4. Plazma 300 W plazma temizleyici 20 saniye boyunca 1 mbar O ₂ plazmada 3 inç cam slayt tarafından önceden temizlenmiş 2 inç ile birlikte yukarı özelliği tarafı, cihazı davranın. cam slayt plazma ile işlenmiş yüzüne PDMS cihazın desenli tarafını yerleştirerek PDMS cihaz Bond. 80 ° C sıcaklıkta fırında Cihazı ve 40 dakika boyunca monte edilmiş cihazın fırında.
5. kanal Renderflorlanmış bir yüzey işleme sıvısı ile cihaz temizlemek için bir şırınga kullanılarak hidrofobik. 10 dakika çözücünün buharlaşması için hemen 80 ° C'de cihazı fırında.

Optik Bileşenleri 3. hazırlanması

1. 105 mikron çekirdek, 125 mikron kaplama son 5 mm yalıtımı kaldırarak lazer uyarma lif hazırlayın, NA 0.22 fiber optik =.
2. Bir ^2. özdeş elyaf için 3.1 tekrarlayarak ^2. renkli lazer uyarma fiber hazırlayın.
3. 200 mikron çekirdek, 225 mikron kaplama için 3.1 yineleyerek floresan sinyalini toplamak için fiber hazırlayın, NA 0.39 fiber optik =.
4. ipuçları düz bir yüzeye sona yoksa, bir lif çubukla uçları yeniden tutunmaya - tüm liflerin ipuçlarını inceleyin.
5. 50 mW, 405 nm lazer lazer fiber bağlayıcı takın ve lazer 105 mikron çekirdek liflerinin birini ekleyin. Lazer gücünün sensörüne elimden ucunu yönlendirinmetre ve lazer gücünü maksimize etmek lazer coupler ince ayar kullanın.
6. 50 mW, 473 nm lazer için 3.5 tekrarlayın.
7. Lazer ışığı bloke ve yayılan floresan iletmek için objektif tüpleri kullanarak PMT bir 446/510/581/703 nm dört band geçiren filtreler monte edin. o ışık PMT isabet önce filtreler üzerinden geçecek, böylece fiber kuplörünü takın.
8. 3.7 toplandı birimine 3.3 ile fiber takın.

4. Çevrim karıştırılmış bir emülsiyon Üretim

1. 60 mm x 60 mm delik bir akış odak Mikroakiskan dropmaker cihazı edinin.
2. % 2 iyonik fluorosurfactant ⁹ HFE 7500 yağlar ile 1 ml şırınga doldurun.
3. 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM: floresein aşağıdaki birleşimleri (FITC) ve dekstran-konjuge mavi boyalar PBS (CB) 1 ml şırınga bir dizi doldurun CB, ve 10 nM FITC / 100 nM CB.
4. ters MICROS sahnede dropmaker cihaz montebaş ve şırınga pompalarında sulu ve yağlı şırınga. Çift PE-2 boru kullanan cihazlar için şırınga.
5. 500 ul / sulu çözeltiler için bir yağ, 250 ul / saat saat sonra şırınga pompaları çalıştıran, 4.3 çözümler içeren 80 um damlacıkların bir karışım oluşturmak. Sulu örneğin her türü için, çapraz bulaşmayı önlemek için yeni bir dropmaker cihazı kullanın. Boş şırıngaya Her bir boya kombinasyonu emülsiyon ~ 200 ul toplayın.
6. 4 damlacıklar türleri tek bir koleksiyon şırınga içinde toplanmıştır sonra, defalarca şırınga çevirerek emülsiyonu karıştırın.
7. Tekrar sulu çözeltiler, PBS içinde 0.1, 1, 10 ve 100 nM FITC içeren 4.2-4.6 adımları tekrarlayın.

5. Fiber Optik Ekleme

1. <100 mikro-saniye deklanşör hızları yeteneğine sahip dijital kamera ile birleştiğinde ters bir mikroskop sahnede 2. adımda imal mikroakışkan çip yerleştirin.
2. yan, INSE dikkatle ÇalışmaAna akış kanalı aracılığıyla ponksiyon özen uzak yukarı 120 mikron kanalı içine 473 nm lazer bağlanmış lif rt.
3. , Uzak aşağı 120 mikron yüksek yan kanalı içine 405 nm lazer bağlanmış lif eklemek 300 mikron fiber boşluk sağlar.
4. iki lazer uyarım lifleri normal 220 mikron boyunda kanala PMT-birleştiğinde lif yerleştirin.

Karışık Emülsiyonlar 6. Floresan Algılama

1. PE-2 boru ile bir algılama cihazı aralayıcı yağı girişine% 2 iyonik fluorosurfactant HFE 7500 dolu bir 5 ml şırıngaya monte edin.
2. PE-2 boru kullanılarak cihazın damlacık reenjeksiyon girişine bir dikey olarak yönlendirilmiş şırınga pompa ve çift karışık FITC / CB emülsiyonu içeren şırınga monte edin. atık konteynerine cihaz çıkışından PE-2 boru uzunluğu bağlayın.
3. Her iki kadar 1.000 ul / saatte pompaların her çalıştırarak Başbakan cihazYağ ve damlacıkları düzenli cihazda birleştiren ve aşağı akan görülmektedir.
4. algılama bölgeye seyahat damlacıklar arasında önemli bir boşluk sağlar boşluk yağı 6.000 ul / saat hızında çalışır şekilde debileri ve 100 ul / saatte damlacıklarını ayarlayın.
5. , Lazerler açmak veri toplama programını başlatın ve bazal gürültü zemin 100x daha vardır sinyalleri sağlamak için PMT kazancı ayarlayın. duble zirveleri tek bir doğrusal ölçekli timetrace üzerinde açıkça görülebilir şekilde lazer gücünü ayarlayın.
6. en az 20 kHz PMT gerilim timetrace 60 saniye kazanır. Böyle Matlab olarak bilgisayar programına veri almak ve özel bilgisayar programı komut kullanılarak kaydedilen çifti zirvelerinden yükseklikleri ölçülür.
   Not: Bu ilave bilgi olarak verilmektedir.
7. Tekrarlayın 405 nm lazer kapalı olan, 4,7 oluşturulan FITC sadece karışık emülsiyon kullanılarak 6.2-6.7 adımları.

Results

Optik fiberlerin yerleştirilmesi için izin veren bir PDMS cihazın imalatı değişen yükseklik (Şekil 1) kanalları oluşturmak için çok adımlı bir fotolitografi prosedürü gerektirir. İlk olarak, SU-8 80 um boyunda tabaka silikon yonga üzerine bükülmüş ve akışkan geometrisini oluşturmak için bir maske kullanılarak şekillendirilmiştir. Sonraki, SU-8 ek 40 mikron katman gofret üzerine bükülmüş ve 120 mikron boyunda lazer fiber ekleme kanalları oluşturacak özellikleri oluşturmak...

Discussion

Fiber optik algılama akışkan kanal ile ilgili olarak, optik fiberlerin hizalanmasını gerektirir. Bizim cihaz çok tabakalı fotolitografiyle imal kılavuz kanalları kullandığından, birbirlerine göre olan maske yerleştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Fiber kılavuz kanallar sıvı kanala çok yakın ise, sıvı sızması için bir potansiyel var; kılavuz kanallar çok uzakta bulunan ya da hizadan ise, algılama fiber tarafından toplanan floresan sinyali önemli ölçüde azalabilir. Tam hizalama fotoğraf desen sırasında birlikte bulunduğu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fotoğraf maskeleri	CadArt Servcies
3" silikon gofretler, P tipi, bakire test sınıfı	Üniversite Gofretleri	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 silikon elastomer kiti	Krayden	4019862
1 ml şırınga	BD
10 ml şırınga	BD	309604
27 gaugue iğnesi	BD	305109
PE 2 polietilen boru	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Yaygın olarak HFE 7500
İyonik Krytox Yüzey Aktif			Madde olarak bilinir Ref #10'da sentez talimatları
Dekstran konjuge kaskad mavi boya	Yaşam Teknolojileri	D-1976
Floresein sodyum tuzu	Sigma	28803
Dörtlü bant geçiren filtre	Semrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Fiber bağlantı noktası	Thorlabs	PAFA-X-4-A
lens tüpü	Thorlabs	SM1L05
200 & # 956 ile yama kablosu; M Çekirdek / 225 μ 105 & # 956 ile Thorlabs Özel Yama kablosu, bir soyulmuş uç ve bir FC / PC konektörü ile m kaplama fiber
M Çekirdek / 125 μ bir soyulmuş uçlu ve bir FC/PC konektörlü m kaplama fiber optik	Thorlabs	Custom
125 & # 956; m elyaf sıyırma aleti	Thorlabs	T08S13
225 & # 956; m fiber sıyırma aleti	Thorlabs	T10S13
lazer fiber adaptörü	OptoEngine	FC / PC Adaptörü
50 <'de 405 nm CW lazer; mW	OptoEngine	MDL-III-405	CNI lazerler için
473 nm CW lazer 50  mW	OptoMotor	MLL-FN-473-50