Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

21.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54041

⸱

2 Haziran 2016

 ,  , 
1Center for Vaccines and Immunology, Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia

Bu makalede

Özet

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

Özet

Virüs benzeri partiküller (VLP'ler) ve subviral parçacıkları (SVPs) canlı patojenlerin kullanımı üzerinde artmış biyo-güvenlik ve kararlılık avantajlar sağlar viral aşı tasarımı için alternatif bir yaklaşım bulunmaktadır. Bulaşıcı olmayan ve kendi kendine montaj VLP'ler canlı patojenlerin veya antijen teslimat için rekombinant viral vektörler için ihtiyaç kalmaz, immünojen olarak yapısal proteinleri sunmak için kullanılır. Bu yazıda, klinik öncesi hayvan testleri gelecekteki uygulamalar için VLP tasarım ve geliştirme farklı aşamalarında göstermektedir. Prosedür, aşağıdaki aşamaları içerir: bir antijen dozu için antijenin bir seçim, seçim hücre hattı, VLPler / SVPs saflaştırılmasında antijenin ekspresyonunu ve miktar tayini. Biz antijenlerinin ifadesi için hem memeli ve böcek hücre çizgilerinin kullanımını göstermektedir ve metodolojileri verimle farklılık gösterilmektedir. sunulan yöntem patojenlerin için geçerli olabilir ve immünojenik str antijenleri değiştirilmesi ile elde edilebilirilgi kullanıcının mikroorganizma uctural proteinleri. VLP'ler ve SVPs antijen karakterizasyonu ve en iyi aşı adaylarının seçimi ile yardımcı olur.

Giriş

Virüs benzeri partiküller (VLP'ler), insan aşılama için onaylanmış bir teknolojidir. Aslında, insan papilloma virüsü (HPV) ve hepatit beta da dahil olmak üzere daha çağdaş lisanslı aşıların, bazı (HepΒ) aşılar bu yaklaşımı kullanır. VLP'ler kendini montaj yapabilen yapısal proteinlerden oluşur. monte parçacıklar viral morfolojileri taklit, ancak enfekte ya da viral genomları eksikliği nedeniyle çoğaltma yapamaz. VLP'ler ifade Prokaryotik ve ökaryotik sistemlerde bir dizi saflaştırılır. -% 28, maya -% 20, bitki -% 9, böcek -% 28, ve memeli -% 15 1 bakteri: literatürün gözden farklı ekspresyon sistemleri aşağıdaki oranlarda istihdam edildiği saptandı. Dikkat çekici bir şekilde, L1 kapsid proteini göre aşılar mayalar (Gardasil) 'de ya da bir böcek hücre sistemine (Cervarix) 2 üretilir. HepΒ aşılar Recombivax ve Engerix-Β da mayada üretilir ve HepΒ yüzey antijeninin 3 oluşmaktadır4.

Bu montaj için çok sayıda yapısal proteinlerin ko-ifadesini gerektiren VLP'lerini üretilmesi için, memeli ve böcek hücre ifade sistemlerini kullanır. grip virüsü, solunum sinsityal virüs (RSV), dang virüsü (DENV) ve chikungunya virüsü (CHIKV): Çalışmalarımız insan patojenlere karşı tasarımı, üretim ve arıtma VLP-bazlı aşılar üzerinde duruluyor. Bizim yöntemleri birden fazla ekspresyon plazmidleri birden fazla yapısal proteinlerin birlikte ekspresyonu ya da tek bir sentezleme plasmidi (Şekil 1) sağlamak için yeterince esnektir. Daha önce, üretilen ve saflaştırılmış H5N1 VLP'ler insan embriyonik böbrek 293T hücrelerinde 5,6 influenza hemaglutinini (HA), nöraminidaz (NA) ve matris (M + -1) kodlayan plasmidin birlikte ekspresyonundan toplandı. genler, memeli hücrelerinde ekspresyon için kodon-optimize edilmiş ve pTR600, transkripsivonel başlatmak için sitomegalovirüs hemen-erken promoteri artı intron A içeren bir ökaryotik ifade vektörüne klonlanmıştırÖkaryotik ekler ription ve transkripsiyon 7 sonlandırılması için sığır büyüme hormonu poliadenilasyon sinyali. HA, NA (Şekil 1A) ve alternatif bir viral matriks proteini, HIV gag p55, üç plazmid ko-ifadesini kullanan benzer bir yaklaşım, bu çalışmada, insan mevsimsel grip alt H3N2 VLP'lerin üretimi için kullanılmıştır ve elde gösterilmiştir grip parçacıklar 8 olarak benzer büyüklükteki VLP'ler. Influenza aşıları baskın anti-HA antikor ortaya rağmen, grip nöraminidaz eklenmesi transfekte edilmiş hücrelerin 9 ve ayrıca mevcut olmayan ilave imünojenik hedeflerden filizlenen VLP sağlamak için siyalidaz aktivitesi aracılık eder. RSV VLP'lerini üretmek için, aynı zamanda, daha önce tarif edilen ve elektron mikroskopi 6,10 ile karakterize edilen, ayrıca HIV gag ile VLP'lerin oluşumu esnekliğini göstermek için özel olarak RSV yüzeyi glikoproteinleri mevcut prototip aşı tasarım HIV gag ilgisiz bir çekirdek parçası seçilebilir. DiğerleriDaha önce RSV glikoproteinleri Newcastle hastalığı virüsü (NDV), 11 ve influenza matris 12 çeşitli viral bileşenler kullanılarak monte edilebilir sunulması VLP'ler göstermiştir. Tam uzunlukta yüzeyi glikoproteini sekansları, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile işlevsel bir reseptör bağlanması ve antikor tanıma analizi için gerekli olabilir yerel konformasyonun korumak için bu çalışmada kullanılmıştır.

partikülleri oluşturmak için tekli plazmid sentezleme sistemlerinin kullanımı için örnekler DENV ve CHIKV bulunmaktadır. DENV durumunda, bir prM / e yapısal gen sentezleme kasetini 13 içeren tek bir plazmidden 293T hücrelerinde hiçbir kapsid ile subviral parçacıklar (SVPs) üretebilir. vadeli SVP viral yapısal proteinlerin mecliste bir çekirdek veya kapsid proteini eksikliği belirtmek için kullanılır. CHIK VLP'ler da CHIKV yapısal gen kaseti, kodlayan kapsid ve zarf proteinlerini içeren tek bir plazmid kullanılarak üretilebilir veya ibir rekombinan bakulovirüs böcek hücresi ekspresyon (- Cı Şekil 1B) için optimize aynı yapısal gen kasetinin kodlayan enfekte nsect hücreleri.

Yukarıda ele alındığı yaklaşımları ifade sonuç daha sonra% 20 gliserol tampon ile ultra-santrifüj yoluyla saflaştırılabilir hücre kültür ortamına VLPler sürüm. Bu yazıda, ifade ve memeli ve böcek hücre sistemleri bu VLP'lerini arındırmak için yöntemler sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Grip H3N2 VLP Üretimi 1. Memeli İfade Sistemi

  1. Alt klon, daha önce tarif edildiği pTR600 ökaryotik ekspresyon vektörleri, viral yapı glikoproteinlerin hemaglutinin (HA), nöraminidaz (NA) ve insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) Gag P55. 7
  2. Kimyasal yetkili Escherichia coli (örneğin, DH5α) DNA yükseltmek ve üreticinin talimatlarına göre bir plazmid saflaştırma kiti kullanılarak transfeksiyon dereceli plazmid izole. DNA miktarı verim ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlıdır.
  3. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 ile 37 ° C 'de% 10 fetal bovin serumu (FBS) içeren büyüme ortamı içinde bir memeli hücre çizgisi, 293T, koruyun.
  4. T-150 doku kültürü şişesi şişe aşağıdaki gün tam hücre yapışmasını ve% 85-95 hücre confluency elde şekilde şişeye başına 45-75 x 10 6 hücre içerecek şekilde hücreleri büyür. İstenilen conflu için mikroskop altında hücrelerin kontrol edinEnsi.
    Not: Yüksek hücre yoğunluğu, tipik olarak, ancak aşırı konfluent yan ürünleri, hücresel atık birikim neden olur ve hücre canlılığı azaltabilir ticari transfeksiyon reaktifleri kullanarak minimum sitotoksik optimal protein elde etmek için önerilmektedir.
  5. NA: 1: HA 2 transfeksiyon günde 1 DNA bileşimi DNA hücreleri, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak lipozom ve DNA karışımı hazırlamak ve transfekte Gag T-150 şişesi başına 40 ug toplam DNA miktarı ile. Her şişe, 20-30 ml bir toplam hacme sahip olacak şekilde, antibiyotikler olmadan, serumsuz transfeksiyon ortamı DNA ve lipozom çözüm seyreltilir.
    Not: gen yapılarının oranı kullanım optimizasyon gerektirebilir. : 1 oranında Burada gösterilen olmasına rağmen, benzer bir transfeksiyon prosedürü 1 solunum sinsitiyal virüsü (RSV) F ve HIV gag ile işlenmiştir. DENV ve CHIKV tek ekspresyon plazmidleri, T-150 şişesi başına DNA 20 ug toplam uygun e için kullanılanXPression. DNA: transfeksiyon reaktif oranlar kullanıcı optimize edilmiş. Kullanım transfeksiyon yöntemi, temel transfeksiyon ortamı önerilen örneğin polikatyonik lipid transfeksiyon ve böylece ortam hormonlu takviye edilebilir bir azalma ve cenin sığır serumu yokluğunu tavsiye ve serum olmadan büyümesini desteklemek için eser elementler.
  6. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de şişeler dönün. 200 ml'lik bir hacme için, 9 T-150 şişelerde. Hücreler VLP'ler hasat güne kadar transfeksiyon kültür ortamında tutulur.
  7. 72-96 saat sonrası transfeksiyon antijeni bağlı veya mikroskobik muayene ile tahmin edilen hücre canlılığı,% 70-80 düşmüştür zaman sonra hücrelerden Hasat kültür süpernatanı. Başına 50 ml konik tüp içine süpernatan ve hücre kalıntıları topak haline 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g hücreleri aşağı doğru döndürün.
    Not: yiel olacak yapışık hücrelere taze, önceden ısıtılmış, serumsuz transfeksiyon ortamı ile 3 günlük yüzer değiştirilmesive benzer ya da biraz azaltılmış verim ile VLP'lerinin da ikinci çok kullanıcı tarafından optimize edilmelidir.
  8. ultrasantrifüj yoluyla çökelme öncesi 0.22 um zar içinden Havuz süpernatan ve filtre.
  9. % 0.8 hindi ya da memeli kırmızı kan hücreleri kullanılarak standart himeglütinasyon denemesi 14 HA-ifade VLP'lerinin hemaglütinasyon aktivitesini test veya antijen spesifik ELISA ile devam edin. Temsilcisi sonuçları için Şekil 2'ye bakınız.

Bakulovirüs / Böcek Hücre Sisteminin Kullanılması 2. CHIK VLP İfade

  1. ticari bir bakulovirüs sentezleme sistemi kullanılarak S-27 suşu Chikungunya virüsü kapsidini ve zarf proteinleri (Cı-E3-E2-6K-E1) ifade eden yeniden birleştirici baculovirüs oluşturur.
  2. 28 ° C 'de 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile serumsuz Sf9 büyüme ortamında kültür Spodoptera frugiperda Sf9 hücreleri. Suspens için dönücü şişesi kültürleri başlatmak için 3-5 x 10 5 c / ml kullanınİyon hücre büyümesi. Passage rutin onlar 2-4 x 10 6 c / ml (her 3-4 gün) hücre yoğunlukları ulaştığınızda.
  3. Bir çok noktalı bir karıştırıcı plaka sistemi 130 rpm'de karıştırılarak döndürücü şişelere süspansiyon kültür Sf9 hücreleri. Doğru havalandırma için, dönen şişeden hiçbir yarısından fazlasını seste kültür hacimleri korumak.
  4. CHIK VLP'ler ekspresyonu için, 1 enfeksiyon çeşitliliğinde, rekombinan bakülovirüs ile 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta Sf9 hücreleri enfekte ve 28 ° C inkübatör geri dönün. Tipik haliyle, 250 mi Sf9 hücreleri ihtiva eden bir ya da iki döndürme şişeleri enfekte etmektedir.
    Not: Bu yöntemi kullanmak yok iken, Sf9 hücreleri bir çalkalama platformu kullanarak 28 ° C'de çalkalama şişelerinde kültüre olabilir.
  5. hücre canlılığı,% 70-80 düşmüştür zaman hasat kültürleri 72-96 st post-enfeksiyon sonrası veya üreticinin protokolüne göre mavi Tripan çıkışı ile belirlendiği gibi.
    Not: Hücreler enfekte ise çoğalmaya devam var3 gün sonrası enfeksiyon (dpi) rekombinant CHIK VLP bakülovirüs ile enfekte edilmiş Sf9 kültürlerinde ~% 80 canlılığı. Bakulovirüs enfekte hücreler görünüş olarak daha büyüktür. Morfoloji da dikdörtgen için yuvarlak değişebilir. bakulovirüs enfeksiyonun geç aşamalarında, hücreler lize başladı.
  6. şirketinden süspansiyon kültüründen 50 ml konik tüp içine, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri aşağı spin Aktarım kültürleri.
  7. süpernatantlar toplamak ve Ultrasantrifügasyon yoluyla sedimantasyon önce 0.22 mikron gözenek zarından filtre.

VLP / SVPs 3. Çökelme / saflaştırma

  1. biyogüvenlik kaput içinde% 70 etanol ile 25 mm x 89 mm üstü açık ultrasantrifüjdeki tüpleri sterilize edin. Etanol kullanılmadan önce kurumadan emin olun.
  2. Temiz bir tüpe süpernatant 32 ml yükleyin. 25 ml minimal hacim çöküşü ve yetersiz dolu ultrasantrifüjdeki tüplerin zarar görmesini önlemek için tavsiye edilir.
  3. Dikkatle süpernatanlar zekâ altında yatanPBS h steril 3 ml% 20 gliserol (h / h). Emin tüpler dengeli olduğundan emin olun.
  4. 4 ° C'de 4 saat boyunca 135,000 x g'de dönerler.
  5. Süpernatant aspire, pelet sağlanması tüpten çıkarmak değildir.
  6. Süspanse şiddetle yukarı ve aşağı pipetleme steril PBS ile tüplerin alt kısmında VLP'lerini çöktürülür. PBS miktarı VLPler VLP toplam protein verimi ve alt uygulamalara bağlıdır tekrar süspansiyon gerekiyordu. Tipik olarak, en az 100 | il her VLP pelletini.
  7. Mağaza örnekleri, uzun süreli depolama için kısa süreli depolama ve -80 ° C'de saklama için 4 ° C.

4. Protein Miktarları ve Spesifik Antijen Verimini belirlenmesi

  1. Bu üreticinin protokolü doğrultusunda BCA deneyi olarak, ticari bir protein miktar yöntemi kullanılarak toplam protein içeriği belirlenir.
  2. spesifik antijen içeriği değerlendirmek için standart antijen ve 2-5 seri dilüsyonları kaplama doğrudan enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) yerine1 'dir; ELISA 96 gözlü düz tabanlı bir plakaya toplam protein örneğinin örn.
    1. plaka antijenlerinin varlığını araştırmak ve mikroplaka okuyucusu için tespit absorbans üretilmesi için geleneksel bir ELISA gelişimi alt tabakaların kullanımı, antijene spesifik antikorlar ile takip edin. VLP HA-eksprese eden bir örnek için HA ve ELISA deneyi için temsili sonuçlar için bkz Şekil 2; HA ve NA birçok kombinasyonları muhtemelen ama verimleri HA-NA uyumluluğu 15 üzerine farklı olabilir.
      Not: Antijen spesifik antikorlar, değişken bir ilişki içindedir ve antikor son uç seyreltme titrasyon VLP ölçümü uygulamadan önce tespit edilmesi önerilmektedir. Ticari antikorlar ELISA'da kullanım için önerilen yoğunlaştırmadan veya seyreltmeden aralıkları, hem de önerilen protokoller vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

VLP verimleri viral antijen yapısı tasarımı ile değişken idi. Bu protokol, ultra-santrifüj ile yüzer SVP ya da VLPler üretimi ve saflaştırılması için, böcek ve memeli hücreleri kullanımını göstermiştir. DENV prM / e yapısal gen sentezleme kasetleri dört alt tipi, Tablo 1 'de (1-4 olarak çizilmiş) DENV SVPs sürümlerini oluşturmak ve 0.6 ml hacim toplam proteinin 1,1-2,6 mg arasında bir aralığı göstermek için kullanılmıştır. HA için: 2: 1: Üç gen yapıları gerektiren VL...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz başarıyla SVPs ve çeşitli patojenler için birden fazla yapısal proteinlerden oluşan VLP'lerini ifade ve arındırmak için yukarıda açıklanan teknikler kullandık. Genel olarak, bizim VLP'lerini oluşturmak için memeli ifade sistemleri kullanırlar. Ancak, bizim elimizde, memeli hücre CHIK VLP verimleri düşük türetilmiş. Bir rekombinant bakülovirüs-böcek hücre sistemini kullanarak CHIK VLP verim daha güçlü oldu. Genel olarak, bakulovirüs, böcek hücre sistemleri, kontrol altında ve aynı zamanda bağlı yabancı genler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz maksimum verimlilik ve verim için protokol optimize yardımcı olmuştur Ross laboratuar öncesinde üyelerini kabul etmek istiyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Plazmid Maxi KitiQiagen12163
DMEMCellgro10-013
LipofektaminYaşam TeknolojileriL3000075Lipofektamin 2000, Lipofektamin 3000
Opti-MEM IYaşam Teknolojileri31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Ekspresyon Sistemi Yaşam Teknolojileri10359-016
Cimarec I 6 çok noktalı karıştırma plakasıThermoFisher Scientific50094596
Polyclear ultrasantrifüj tüpleriSeton7025Ultrasantrifüj ve kova boyutu için uygun tüpleri onaylayın
Mikro BCA Protein Test KitiThermoFisher Scientific23235
Fosfat sitrat tamponuSigmaP4922
o-fenilendiamin dihidroklorür ve nbsp;SigmaP8287
0.22 & mu; m vakum filtre üstü (500 ml)Nalgene569-0020
GliserolSigmaG5516
H2SO4Sigma339741 
Sf-900 II SFMThermoFisher Bilimsel10902-096

Kaynaklar

  1. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
  2. Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
  3. Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
  4. Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
  5. Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
  6. Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
  7. Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
  8. Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501(2008).
  9. Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
  10. Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
  11. Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
  12. Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
  13. Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
  14. Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
  15. Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
  16. Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
  17. Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
  18. Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
  19. Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

VLP Safla t r lmasAntijen EkspresyonuH cre Hatt EkspresyonuUltrasantrif gasyonGliserol Alt TabakasS pernatan FiltrasyonuProtein KantifikasyonuBCA AnaliziHA Analizi
İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.