Yöntem makalesi

Deri Cerrahi denervasyon: Cilt Hastalıkları Fare modelleri Sinirler için Gereği Test Bir Yöntem

DOI:

10.3791/54050

⸱

26 Haziran 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, fare derisinin genetik etiketlemesi, cerrahi denervasyon, deri biyopsisi ve tam montajlı β-galaktosidaz boyama ile etiketli epitelin görselleştirilmesi için ayrıntılı protokoller içerir. Bu yöntemler, normal ve patolojik cildin fare modellerinde sinir gereksinimini test etmek için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kutanöz somatosensoriyel sinirler, cilde etki eden çeşitli uyaranları tespit etmek için işlev görür. Yerleşik duyusal rollerine ek olarak, son çalışmalar sinirlerin atopik dermatit, sedef hastalığı ve kanser dahil olmak üzere cilt bozukluklarını da modüle edebileceğini düşündürmektedir. Burada, bir kutanöz mekanosensoriyel organ olan dokunmatik kubbenin (TD) korunmasında sinir gereksinimini test etmek için protokolleri açıklıyoruz. Spesifik olarak, TD'leri tam montajlı boyama ile genetik olarak etiketleme, hasat etme ve görselleştirme ve fare dorsal sırt derisi üzerinde tek taraflı cerrahi denervasyon gerçekleştirme yöntemlerini tartışıyoruz. Birlikte, bu yaklaşımlar, aynı hayvandan alınan denerve edilmiş ve sahte olarak çalıştırılan deride TD morfolojisini ve gen ekspresyonunu doğrudan karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntemler ayrıca, cilt patolojisinin fare modellerinde sinir gereksinimini incelemek için kolayca uyarlanabilir. Son olarak, cildi tekrar tekrar örnekleme yeteneği, başladıktan sonra farklı aşamalarda ve zamanlarda hastalığın ilerlemesini izleme fırsatı sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç yılda, sinirlerin tipik olarak klasik nöropatiler1-4 olarak kabul edilmeyen hastalıklar üzerindeki etkisine yönelik artan bir takdir olmuştur. Deride, son deneysel kanıtlar, duyusal sinirlerin sedef hastalığından kansere kadar çeşitli patolojileri modüle edebileceğini göstermiştir5-9. Bu, kemirgenlerde cerrahi denervasyon ve nöral fonksiyonun farmakolojik inhibisyonu gibi teknikler kullanılarak gösterilmiştir. Sedef hastalığı durumunda, bu çalışmalar insan psoriatik plaklarının nöral fonksiyon kaybını takiben neden gerilediğini anlamak için mekanik bir çerçeve sağlamıştır7,10-12.

Kutanöz sinirler de gen ekspresyonunu13,14 etkileyebilir ve normal ciltte15 mekanosensasyon için kritiktir. Özellikle, dokunmatik kubbe (TD) epiteli, yavaş adapte olan tip 1 (SA1) sinir lifleri16-18 tarafından innerve edilen nöroendokrin Merkel hücreleri ile yan yana duran kolumnar epidermal hücrelerin bir yamasından oluşur. TD'ler hafif dokunma hissine aracılık eder ve Kirpi yolu aktivitesini5,19 gösterdiği gösterilmiştir. TD bakımı, sinirler normal TD'leri ve bunlarla ilişkili Merkel hücrelerini19 sürdürmek için Kirpi ligandlarını salgıladığından, innervasyona20,21 bağlıdır. Ek olarak, innervasyon, TD epitel5'ten Kirpi bağımlı tümör oluşumunu teşvik eder. Birlikte, bu çalışmalar, sinirler ve nişlerindeki çevre hücreler arasında meydana gelen karmaşık moleküler etkileşimlerin, normal TD fizyolojisi ve hastalık için çok önemli olduğu fikrini güçlendirmektedir.

Bu etkileşimlerin doğasını sorgulamak için, burada TD'deki gen ekspresyonunu manipüle etmek ve soy izlemesinden sonra TD görselleştirmesi için deri biyopsileri toplamak için bir dizi in vivo tekniği açıklıyoruz. Son olarak, fare sırt derisinin bir tarafından sinirlerin çıkarıldığı ve karşı tarafın sahte bir iç kontrol olarak bozulmadan bırakıldığı tek taraflı cerrahi denervasyon gerçekleştirme prosedürlerini açıklıyoruz. Ameliyattan birkaç hafta sonra, sinirler kesildiğinde meydana gelen değişiklikleri değerlendirmek için denerve ve sahte kontrol cildi karşılaştırılır. Bu teknikler normal TD'ler bağlamında tanımlanmasına rağmen, denervasyon prosedürü, psoriasis6, yara iyileşmesi13 ve tümörigenez5'in fare modellerinde sinir gereksinimini incelemek için kullanılmıştır. Son olarak, cilt tekrarlanan biyopsilere uygun olduğundan, bu, etiketli hücrelerin uzun vadeli kaderlerini izlemek veya birden fazla zaman noktasında hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için bir fırsat sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol açıklanan tüm işlemler Laboratuar Hayvan Tıp Michigan Birimi Üniversitesi tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapıldı.

1. Farelerde genetik rekombinasyonu azaltmak

Not: Gli1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J fare suşu (Gli1-CreERT2) 13 epitel TD tamoksifen kaynaklı genetik rekombinasyon hedef mümkün kılar. Gli1 oluşturmak için B6.129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm1Sor / J muhabiri fareler (LacZ) 22 Bu gerginlik çapraz; LacZ hayvanlar tüm montaj aşağıda boyanarak TD hücreleri görselleştirmek için.

  1. mısır yağı içinde 12.5 mg / ml'lik bir konsantrasyona tamoksifen çözeltisi hazırlayın.
    1. 1.5 ml tüp içinde, kristalin tamoksifen 20 mg, ve mısır yağı, sonra 1 ml'ye kadar ekleyin. tamoksifen tamamen (2-4 saat) çözülene kadar sıkıca gibi bir girdaplı karıştırıcı tüp, ve oda sıcaklığında en yüksek ayarda sürekli girdap banttamoksifen parçacık bulunmaması için bir mikroskop altında bir tüp incelenmesi ile teyit edilmiştir.
    2. 15 ml'lik bir tüpe transfer çözeltisi ve ek mısır yağı ile 12.5 ml mg / bir nihai konsantrasyona tamoksifen seyreltin. ilave bir 30 saniye süre ile yapışkan bir solüsyon vorteks karıştırın. Karanlıkta 4 ° C'de 1 hafta kadar bu çözelti saklayın.
  2. Gli1 intraperitonal tamoksifen çözelti enjekte edilir; LacZ fareler, fare vücut ağırlığının her 20 gramı başına 200 ul bir hacimde, 20 g fare ağırlığı başına 2.5 mg etkin tamoksifen dozu.

2. Hasat Cilt biyopsiler

Not: Tamoksifen indüksiyon sonrası hafta deneye bağlı olarak, hasat deri biyopsileri birkaç gün. Tüm ameliyatlar için, steril eldiven kullanarak cerrahi maske ya da saç net giyen ve işlem sırasında steril cerrahi örtü ile hayvan kapsayan dahil kemirgen cerrahi için standart protokoller, izleyin.

  1. Suda 90 mg / ml ketamin ve 6.5 mg / ml ksilazin karıştırarak 10x stok anestezik solüsyon hazırlanır. kullanımdan hemen önce, steril PBS içine Bu stok solüsyonu 1:10 seyreltilir ve 8 aya kadar karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
    1. Seçenek olarak ise, tam olarak hayvan anestetize oksijen ile% 4 arasında bir gaz konsantrasyonu ile başlayarak, izofluran teneffüs ile fareler anestezi ve daha sonra işlem sırasında% 1-2, bu düşürür.
  2. 20 g fare vücut ağırlığı başına 200 ul bir dozda intraperitonal anestezik enjekte edilir. hayvan ayak tutam testi ile sedasyon uygun düzlemine ulaştığını kontrol edin ve bu kalbi onaylamak ve solunum oranları (sırasıyla, yaklaşık 600 atım ve min başına 160 nefesler) normaldir.
  3. Dorsal arka cilt üzerinde biyopsi sitesinden saç kaldırmak değil nick dikkatli olmak ya da altta yatan cilde zarar bir elektrik kesme makinesi kullanın.
  4. tıraş silerek cerrahi sitesi hazırlamakBetadinede ve alkol mendil kullanarak ön-to-posterior yönde d alanı. Tüm saç kupürleri siteden kaldırılır emin olun.
  5. Siyah kalem kullanarak biyopsi sitesi anahat aseptik cerrahi alanda bir ısınma pad üzerinde hayvan koyun ve bir steril cerrahi örtü ile kaplayın (gösteri amaçlı steril örtüyü görünürlüğünü artırmak için ihmal edilmiştir).
    Not: saç köklerinin uzunlamasına bölümleri elde etmek için, biyopsi uzun kenarının, bir ön-arka yönde parasagital (saç köklerinin yönüne paralel) çalıştırmanız gerekir (kenar ~ 1 cm histoloji için kesitli olmak üzere) dorsal orta hat (Şekil 1A).
  6. Altta yatan kas fasya zarar vermeden işaretli alanı boyunca tam kalınlıkta eksizyonu yapmak için steril 11. neşter kullanın.
    Not: eksize cilt dokusu epidermis, dermis, deri altı yağ ve panniculus carnosus içerir. Kanama genellikle az.
  7. t düzleştirmeko kuru bir kağıt havlu üzerine deri örneği eksize, dermis, aşağı yan aşırı kağıt havlu uzak trim ve diğer örnekleri toplandı gerekiyorsa kadar 1 saat boyunca soğuk PBS örnek saklayın. Hazır olduğunuzda, histoloji için numune veya tüm montaj β-galaktosidaz (LacZ) boyama Adım 4 işlemek için Adımlar 3.1 veya 3.2 geçin.
  8. Sütür kabaca 3 mm aralıklı basit bir kesintiye desen, 6-0 naylon sütür ile biyopsi sitesini kapatın.
  9. tam iyileşme sonrasına kadar diğer hayvanlar aynı kafesin içine ameliyat geçiren fareler iade etmeyin.
  10. cerrahi alan tipik olarak 1 hafta içinde, iyileşinceye kadar her gün aynı zamanda bilinci kazanmak ve kadar ameliyattan hemen sonra hayvanların izleyin. Fareler ağrı veya sıkıntı belirtileri göstermesi durumunda belirlenen kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak analjezikler kullanın. Ameliyat sonrası 7-10 gün içinde sütür çıkarın.
    Not: Gerekirse, (50 mg / ml stok SOLUT karprofen seyreltilmesiyle analjezik bir çözelti hazırlamakiyon): 1, steril su içinde 100. 20 g vücut ağırlığı başına 200 ul (5 mg / kg fare vücut ağırlığı) bir dozda, Boynun ense yakınındaki kürek kemikleri arasında çözelti, deri altına enjekte edilir.

Histoloji 3. İşlem Örnekleri

düzeltmek için ve eksize doku işlemek, uygulamaya bağlı olarak aşağıdaki yöntemi kullanabilirsiniz: Not.

  1. parafine gömülmüş histolojik örnekleri oluşturmak için en fazla 2 hafta boyunca% 70 etanol içinde oda sıcaklığında PBS O / N% 3.7 formalin deri ve mağaza düzeltmek. parafin içine gömmeden önce kağıt havluyu çıkarın.
  2. Dondurulmuş histolojik numune üretilmesi için, PBS içinde, soğuk% 4 paraformaldehid daldırın doku ve yavaşça 1 saat boyunca çalkalanır. çözelti çıkarın ve PBS 3 değişiklik, yaklaşık 5 dakika ile her numune yıkanır. Daha sonra, ( "sükroz batma") doku cryoprotect PBS içinde% 30 sukroz içinde örnek daldırın.
  3. 4 ° C'de nazik bir çalkalama O / N kuluçkalayın. Ertesi gün, kağıt yedekte kaldırmakEl derinin dermal tarafında aşırı yağ dokusu uzak trim ve. doğrudan OCT içine doku embed ve -80 ° C'de dondurulmuş blok saklayın.
    Not: Daha önce 5,19 açıklandığı gibi kesit sonra, parafin veya dondurulmuş numuneler ya TDS Merkel hücreleri ve sırasıyla Keratin 17, Keratin 8 ve Nörofilaman, karşı antikorlar kullanılarak sinirler tanımlamak için immünohistokimyasal olarak boyanmış olabilir.

Tüm montaj LacZ Boyama tarafından 4. gözünüzde canlandırın Örnekleri

  1. X-gal boyama çözüm hazırlayın.
    1. steril su, 250 ml 0.94 g sodyum fosfat monobazik ve 2.6 g sodyum fosfat dibazik birleştirin. 7.3 pH ayarlayın. Buna, 1 M magnezyum klorid, 0.5 ml, potasyum ferrosiyanür 0.528 g, potasyum ferrisiyanür ve 0.412 g ilave edin. oktilfenil-polietilen glikol 250 ul ve deoksikolat 125 mg ekleyin. baz çözeltisi karanlıkta 6 ay için 4 ° C'de saklanabilir.
    2. 50x stok X-gal soluti hazırlayın50 mg / ml solüsyon oluşturmak için X-gal hazır şişeye dimetilformamid eklenerek ilgili. karanlıkta -20 ° C'de bu çözüm saklayın.
    3. boyama çözüm üretmek için X-gal baz çözeltisi içine stok X-gal çözüm 01:50 sulandırmak, kullanımdan hemen önce. Daha küçük biyopsi (<1 cm2), örnek başına boyama çözeltisi alikosu 1-2 ml.
  2. yavaşça buz üzerinde sallayarak, 30 dakika boyunca soğuk PBS içinde% 2 paraformaldehit /% 0.2 glutaraldehit ihtiva eden bir çözelti içinde Aşama 2.7'de elde deri örneği düzeltildi. Daha küçük biyopsi (<1 cm2) için, numune başına sabitleyici çözeltisi 1-2 ml kullanın.
    Not: Alternatif olarak, sadece% 2-4 paraformaldehid örnekleri düzeltmek, ya da% 0.5 glutaraldehit sadece. Optimum sabitleme koşulları doku, lacZ ekspresyonu ve uygulama derecesine bağlıdır.
  3. sabitleyici çözeltisini çıkarın ve oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde PBS 3 değişiklikler, her biri 5 dakika ile örnekleri yıkayın.
  4. numunenin altında kağıt havlu çıkarın ve excès kesipkünt forseps ile yağ tutma ve kesme makas ile kırparak derinin dermal tarafında yağ dokusu s.
  5. X-gal ile boyama çözeltisi içinde örnek daldırın ve 37 ° CO / H inkübe edin. LacZ ifadesi bir mikroskop (Şekil 1B) altında mavi bir leke olarak görülebilir.
    Not: sinyal yoğunluğu zayıfsa, boyama çözüme ertesi gün yerini ve O / N inkübasyon tekrarlayın. arka plan boyama çok yoğun ise, boyama süresini azaltmak, ya da C ° 37 oda sıcaklığında örnek inkübe yerine.
  6. boyama çözeltisini çıkarın ve PBS yavaşça oda sıcaklığında çalkalanarak yaklaşık 5 dakika için% 3 DMSO içeren 3 değişiklikleri örnekleri yıkayın.
  7. Her biri 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde 2-3 değişiklikler yıkayın örnekler. % 70 etanol içinde mağazası örnekleri.

5. Cerrahi denervasyon

  1. Adım 2.2 gibi hayvan anestezisi ve tüm dorsal cilt tıraş.
  2. Cerrahi alan o hazırlayınBetadine ve alkol mendil ve bir steril cerrahi örtü ile hayvan kapak kullanarak arka cilt f (gösteri amaçlı steril örtüyü görünürlüğünü artırmak için ihmal edilmiştir). aseptik cerrahi alanda çalışırken bir ısıtma yastığı kullanılarak hayvan sıcak tutun.
  3. kuyruk yukarıda kabaca 0.5 cm boyun tabanından dorsal orta hat boyunca steril 11. neşter kullanılarak bir kesi yapmak.
  4. Künt forseps kullanarak, hafifçe sadece arka bacak yukarıda boyun yakın skapular yağ pedleri altta yatan doku görselleştirmek için uzağa zayıf sol tarafta cilt yansıtmaktadır.
    Not: Dorsal deri sinirler (Şekil 2) keskin virajlı yapma ve deri altına gevşek bağ dokusu girmeden önce gövde duvarının saydam fasya ile kaudal seyahat gibi beyaz ipliklerini görünür.
  5. Diseksiyon ışık mikroskobu altında ultra-ince forseps kullanarak, anima sol kanattan gelen sadece sinirleri çıkarmakyerden toplama anatomik sitelerde T3-12 bulunan l deri içine kendi giriş sitelerine gövde duvara bölümleri bend (Şekil 2).
    1. Orient forseps dikey ve streç ve çevre dokuya (- E Şekil 2C) ayrı sinir neden kendi viraj siteleri aşağıda yaklaşık olarak 0.5 cm açgözlü ve yukarı doğru çekerek sinirleri kaldırın. Bitişik kan damarlarının çatlaması önlemek için dikkatli olun.
    2. Cilde gövde duvarının uzanan tüm sinirler kaldırılana kadar devam edin. gövde duvarının yoğun fasya içinde sinirleri bozmaya etmeyin. periyodik steril% 0.9 tuzlu su çözeltisi damla damlatılarak işlem boyunca nemli bir doku tutun.
    3. Alternatif olarak, forseps ile gövde duvarının yakınında yakın kenarlarından tutarak ve ince makas ile kırpma yoluyla sinirleri kaldırın. Daha sonra, cilt yakın uzak uçları sever (Şekil 2F - H). Son olarak, int kaldırmakervening sinir segmentleri (Şekil 2I).
  6. Adım 5.4 maruz cilt flebi herhangi sinirleri çıkarın. Bu lifler dorsal deri sinirlerin distal dalları içerir ve cilt kapağının dermal tarafında (Şekil 2J - K) üzerinde bağ dokusu içinde düzensiz bulunan beyaz dallanma ipliklerini olarak görünür.
    1. Bu ince dalları kaldırmak için, ince forseps kabaca, dermal yüzeyine paralel sinirleri kavramak ve kan damarlarını bozarak ve cilt delinmesiyle önlemek için yukarı doğru koparmak yerleştirin. Görünen tüm sinirler kaldırılıncaya kadar devam edin.
  7. Künt diseksiyon kullanarak, dorsal orta hat kesi sağ tarafında cilt yansıtan, ama sinirleri çıkarmayın. Bu kontralateral sahte operasyona kontrol olarak görev yapacak.
  8. Basit bir kesintiye desen dorsal orta hat boyunca sütür insizyon kapatmak için. kurtarma ve post-oper sırasında hayvan izleyinonları bir arada, daha önce (Adım 2,8-10) gösterdi. Ameliyat sonrası 7-10 gün içinde sütür çıkarın.
  9. işlevsel ameliyattan sonra birkaç hafta istikrarlı denervasyon kadar değerlendirmek için, bir elektrik clipper kullanarak sırt derisine saç kaldırmak.
  10. Yavaşça bir derialtı iğne kullanılarak Denerve deri alanını prick ve hayvan genellikle titreyerek ya da başını çevirerek, yanıt verip not edin. cilt alanı stabil sinirsiz olmuşsa, hayvan çok az veya hiç tepki gösterecektir.
  11. siyah kalem kullanarak, herhangi bir yanıt alanı yanı sıra kontralateral sahte tarafında benzer boyut ve konumu bir alan belirtin.
  12. Adımlar analiz için 2,1-2,9 gibi bu sitelerden biyopsi toplayın.
    Not: Alternatif olarak, Denerve ve sham operasyonu bölgeler dahil olmak üzere tüm dorsal arka deri, Adım 4'te tarif edildiği gibi benzer tüm montaj boyama için tek bir sayfaya olarak kaldırılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üretilmesi tamoksifen indüklenebilir Gli1-CreERT2 ifade eden farelerde ve LacZ haberci alel tarafından, TD epitel görselleştirmek ve zaman içinde bu hücrelerin kaderini izlemek mümkündür. Tüm denervasyon işlemi genellikle fare başına 1 saat içinde tamamlanabilir ve hayvana en az sıkıntıya neden gerekir.

5,19 - Daha önceki çalışmalar sinirler, normal TDS yanı sıra bunların ilişkili Keratin 8 +<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinirler duyu değil, aynı zamanda, memeli organ gelişimine, bakımı ve rejenerasyonu 13,24-27 değil sadece önemli fonksiyona hizmet. sinirler en son çeşitli cilt bozuklukları işaret edildiği gibi, burada tarif edilen teknikler hayvan hastalık modellerinde çeşitli innervasyonundan gereksinimi çalışma için kullanılabilir. Nitekim, tek taraflı denervasyon tekniği aynı fare bozulmamış veya bozulmuş sinir ya cildin doğrudan karşılaştırma için izin verir. sonraki veri eşleştirilmiş t-testi yararlanarak analizleri il...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, fare fotoğrafçılığı konusundaki yardımları için Autumn Peterson'a, fareler konusundaki yardımları için Daniel Thoresen'e ve cerrahi denervasyon konusundaki yardımları için Dr. Nicole Ward ve Dr. Abdelmadjid Belkadi'ye teşekkür eder. Bu çalışmalar, Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü'nden (R00AR059796 ve R01AR065409 hibeler) sağlanan fonlarla desteklenmiştir; Michigan Üniversitesi Dermatoloji Bölümü; Biyolojik Bilimler Bursları Programı; Organogenez Merkezi; Michigan Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi; ve John S. ve Suzanne C. Munn Kanser Fonu. S.C.P., Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nün finansmanıyla desteklenmiştir (hibe T32 GM007315). Bu çalışma aynı zamanda NIH Intramural Araştırma Programı, Kanser Araştırma Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından da desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alkol hazırlama pedleriPDIB339
AnaSed (Ksilazin)LloydNADA 139-236
Antikor, anti-Keratin 8Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma BankasıTROMA-Isıçan antikoru, 1:500 konsantrasyonda kullanım
Antikor, anti-Keratin 17Hücre Sinyali# 4543tavşan antikoru, 1: 1.000 konsantrasyonda
kullanım Antikor, anti-NörofilamentHücre SinyaliC28E10tavşan antikoru, 1:500 konsantrasyonda
kullanın Betadine hazırlama pedleriMedlineMDS093917
Carprofen (Rimadyl)Zoetis
Kablosuz şarj edilebilir kesme makinesiWahldüzeltici modeli 8900
Mısır YağıSigma-AldrichC8267
KriyostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD13061: 1.000 konsantrasyonda kullanım
DeoksikolatSigma-AldrichD6750
Tüy Dökücü KremNairN/A
DimetilforamidSigma-Aldrich319937
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GlutaraldehitSigma-AldrichG5882
ImmEdge KalemVektör LaboratuvarlarıH-4000
Ketamin HClHospiraNDC 0409-2051-05
Magnezyum klorürSigmaM8266
Mikro kapak camıVWR48404-454
Mikro SlaytlarVWR48311-703
% 10 Nötr Tamponlu FormalinVWRBDH0502-4LP
6-0 naylon sütürlerDemeTECHNL166012F4P
Oktilfenil-polietilen glikolSigma-AldrichI8896
OCT BileşikSakura Dokusu-Tek4583
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127
Pottasium ferrosiyanürSigma-AldrichP9387
Pottasyum ferrisiyanürSigma-Aldrich702587
Sodyum fosfat monobazikSigma-AldrichP9791
Sodyum fosfat dibazikSigma-AldrichS5136
SükrozSigma-Aldrich84097
TamoksifenSigma-AldrichT5648-1G
Ultra ince forsepsDumont0103-5-PO
VectashieldVektör LaboratuvarlarıH1000
X-galRoche10 651 745 001Kullanmadan önce 50x stok oluşturmak için dimetilforamid içinde çözün

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115(2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
  4. Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
  5. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
  6. Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
  7. Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
  8. Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
  9. Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
  10. Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
  11. Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
  12. Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
  13. Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
  14. Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
  15. Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
  16. Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
  17. Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
  18. Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
  19. Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
  20. English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
  21. Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
  22. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
  23. Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
  24. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
  25. Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
  26. Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
  27. Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
  28. Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
  29. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cutaneous Surgical DenervationMouse Skin DiseaseTouch Dome MorphologyDorsal Cutaneous NerveWhole Mount StainingGenetic LabelingSham Operated ControlHistological Section AnalysisHedgehog SignalingMerkel Cells

İlgili makaleler