Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Diyabetik Keratopatide için adenoviral Gen Tedavisi: İnsan Organ-kültürlü kornealar ve Limbal Epitel Hücreleri Yara İyileşmesi Üzerine Etkileri ve Hücre Marker İfade Kök

8.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54058

⸱

7 Nisan 2016

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

İnsan diyabetik organ kültürü yapılmış kornealarda adenoviral gen tedavisinin bir örneği, bu kornealarda gecikmiş yara iyileşmesinin normalleşmesine ve belirgin şekilde azalmış epitelyal kök hücre belirteç ekspresyonuna yönelik olarak sunulmuştur. Ayrıca, kök hücre ile zenginleştirilmiş limbal epitel kültürlerinde bu sürecin optimizasyonunu da açıklar.

Özet

Bu protokolün amacı, insan diyabetik kornealar moleküler değişiklikleri tanımlamak ve organ kültürlü kornealar adenoviral gen tedavisi ile kontrol altına alınabilir nasıl göstermektir. Diyabetik kornea hastalığı kornea sinir ve epitel yara iyileşmesi sık anormallikler diyabet komplikasyonudur. Biz de insan diyabetik kornealar birçok olası epitel kök hücre belirteçleri önemli ölçüde değişmiş ifadesini belgelenmiştir. Bu değişiklikleri hafifletmek için adenoviral gen terapisi başarıyla c-met proto-onkogen ifade düzenlenmesi ve / ya da proteinazlar, matris metaloproteinaz-10 (MMP-10) ve katepsin F. Bu tedavinin down-regüle kullanılarak uygulanan diyabetli kornea yara iyileşmesi hızlandırılmış sadece limbal kök hücre bölmesi transduse zaman bile. En iyi sonuçlar, kombine terapi ile elde edilmiştir. normalize kök hücrelerin mümkün olan hastaya nakli, bir örnek, optimizati arasında sunulmuşturpolikatyonik güçlendiricileri kök hücre ile zenginleştirilmiş kültürlerde gen transdüksiyonu on. Bu yaklaşım, seçilen genler için değil, aynı zamanda kornea epitel yara iyileşmesinin diğer arabulucular için sadece yararlı olabilir ve hücre fonksiyonu kaynaklanıyor olabilir.

Giriş

Diyabetik kornea hastalığı çoğunlukla dejeneratif epitel (keratopatisi) ve sinir (nöropati) değişikliklere neden olur. Genellikle epitel yara iyileşmesi ve kornea sinir azaltma 1-4 anormallikler ortaya çıkar. Tahminen% 60-70 diyabet çeşitli kornea problemleri 1,3 var. Çalışmalarımız değiştirilmiş Cı-met proto-onkogen (hepatosit büyüme faktörü reseptörü) ile aşağı doğru düzenleme dahil olmak üzere insan diyabet kornea ekspresyon ve matris metaloproteinaz-10 (MMP-10) ve katepsin F 5, 6, yukarı doğru düzenleme ile birkaç işaretçi proteinleri tanımlanmıştır. Biz de önemli ölçüde belgelenmiş insan diyabetik kornealar birçok olası epitel kök hücre belirteçleri ifadesini azalmıştır.

Daha önceki çalışmalarda diyabetik, yavaş yara iyileşme gösterir Diyabet kornea organ kültür sistemi kullanılarak şeker-değiştirilmiş belirteçlerin seviyelerini normalize etmek üzere bir adenoviral esaslı gen terapisi geliştirdikişaretleyici değişiklikler ve ex vivo kornealar 7,8 benzer hücre belirteci ifade azaltma kaynaklanıyor. Değişikliklerin Bu sebat epigenetik metabolik belleğin 9 varlığından dolayı görünmektedir. Bu kültür sistemi gen terapisi için daha kullanılmıştır. Bu tedavi için hedef diyabetik kornealar (c-met proto-onkogen) veya artmış ekspresyonu (MMP-10 ve katepsin K) azaltılmış ekspresyonu ile ya belirteçleri seçilmiştir.

adenoviral (AV) tedavisi tüm organ kültür kornealar veya sadece korneoskleral periferik limbal bölmeye kullanılmıştır. Bu bölme kornea epitel yenilemek ve aktif 4,10-15 yara iyileşmesi katılmak epitel kök hücreleri barındırır. Burada, protokoller, normal sağlıklı insan kornea organ kültürü, epitelyal yara iyileşmesi, izolasyon ve kök hücre zenginleştirilmiş limbal hücre kültürlerinin karakterizasyonu ve adenoviral hücre ve kornea transdüksiyon için verilmiştir. BizimSonuçlar gelecekteki olası transplantasyon için diyabetik kornea işaretleyici ifade ve yara iyileşmesi normalleştirilmesi için bu tedavinin uygulanabilirliğini göstermektedir. Onlar da kombinasyon tedavisi, diyabetik kornea 16-18 normal işaretleyici desen ve epitel iyileşmesini geri en etkili yol olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Ulusal Hastalık Araştırma Değişim (Ndri, Philadelphia, PA) rıza gösterilen postmortem sağlıklı ve diyabetik insan gözleri ve korneaları verilir. Ndri insan doku toplama protokolü Sağlık gözetimi National Institutes yönetim komitesi ve konuya tarafından onaylanmıştır. Bu araştırma onaylı Cedars-Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) muaf protokol EX-1055 kapsamında yapılmıştır. , Dr kornea cerrahları İşbirliği. E. Maguen ve Y. Rabinowitz, kök hücre ile zenginleştirilmiş kornea epitel kültürlerin izolasyonu için ıskarta korneoskleral jantlar verilir. Bu araştırma onaylı IRB protokolü Pro00019393 altında yapılmıştır.

1. İnsan Kornea Organ Culture

Not: Normal ve diabetik korneaları veya bütün gözler soğutulmuş kornea depolama ortamına alınır (örneğin, Optisol GS) Ulusal satıcı Ndri gelen ölümünden sonra 48 saat içinde.

  1. forseps ile depolama kabından kornealar çıkarın ve ben onları iki kez yıkayınN antibiyotik antimikotik (ABAM) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Bütün gözlerin durumunda, kavisli makas ile küreler gelen kornea kesip. en az 5 mm konjonktiva jant bırakın ve aynı zamanda ABAM de korneaları yıkayın.
  2. kornea konkavlık yerleştirilmesi için bir karışım hazırlayın. Serum içermeyen minimum temel ortam (MEM) içeren ABAM, 1 mg / l (0.1 N asetik asit içerisinde 10 mg / ml'lik bir stok çözeltisinden elde edilen) mi dana derinin kollajen,% 1 agar ve insülin transferin-selenit oluşmaktadır 7 tamamlar.
  3. Mikrodalga sterilizasyon ve agar çözülme için kaynayan bu karışım. Her şey erimesi için ne 1 dakika kadar sürebilir. Kaynadıktan zaman karışım kolayca aşıyor çünkü kısmen açık tüp kapağını bırakın. Bu nedenle, çok sayıda kaynama çevrimleri 10-15 sn için, her biri gerekli olabilir. 37-39 ° C'ye kadar karışım soğutun.
  4. Steril 60 mm yemekleri kornealar aşağı epitel tarafı yerleştirin. 1.2 anlatılan karışımın yaklaşık 0,5 ml kornea konkavlık doldurun.Karışım 2 dakika içinde kornealar üzerinde katılaşır.
  5. Aşağı steril 60 mm yemekleri kornealar agar tarafını yerleştirin ve ABAM ile MEM içeren tam orta ekleyin ve insülin transferin-selenit ek 7 (37 ° C) hava-sıvı arayüz kültürü için limbusta yaklaşık seviyesini korumak için. orta hacimli çanak başına 7-8 ml.
  6. Bir su tavası ile nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 kuvöz içine kornealar yemekleri ile koyun 35 ° C (normal kornea sıcaklığı) (Bu şekilde, nem düzeyinde veya% 95 üzerinde tutulur). kornealar nemlendirmek için epiteli günlük 100 ul orta (iki damla) ekleyin.
  7. kornea morfolojisi ve 4X amacı ile standart bir mikroskop kullanılarak iletilen ışık altında mikroskopik epitel hücre canlılığı izleyin. Bir gün çok kez yapın.
  8. her üç günde bir orta değiştirin. kornea en az üç hafta boyunca kültürlenebilir. 3-5 gün boyunca gen terapisi deneyleri için, kültür kornealar sonra detfaiz (4,1-4,4) genleri ile e yara iyileşmesi protokolü (2,1-2,4) için transgen ve konuya bağlı olarak başka bir 3-5 gün bekletin.

2. Epitel Yara İyileşmesi

Not: kırılgan epitel bazal membran, normal kornealar olmaz süreçte, müstakil olduğu için diyabetik kornealar ise, mekanik kazıma ile epitel debridman mümkün değildir. Bu nedenle, yara iyileşmesinin benzer şartlar altında, normal ve diyabetik kornealar tutmak için, N-heptanol epitelin kimyasal çıkarılması 19 kullanılır. Bu prosedür epitel kaldırır ama hem normal hem de diabetik kornealar sağlam bir bazal membranın geride bırakır.

  1. Merkezi epitel debridmanı 20 gerçekleştirmek için, 75 saniye boyunca santral kornea ön yüzeyinde n-heptanol batırılmış 5 mm filtre kağıdı diski yerleştirin.
  2. filtreyi kaldırmak ve tam orta korneaları yıkayın. 0.5 mi agar-kollajen ile konkavite doldurmak1.4 gibi karışım ve kültür. Debridmandan sonra, epitel hücreleri genellikle ölür ve mikroskopik bozulmamış bazal membran 7 geride bırakarak batağından.
  3. Sadece limbal gen terapisi ile yapılan deneylerde geniş epitel yaraları oluşturmak için 8.5 mm diskleri kullanın. Bu iyileşme sürecinde limbal kök hücrelerin katılımını sağlayacaktır.
  4. mikroskobik kornea iyileşmesini izleyin. epitel defekti tamamen iyileşene kadar her gün 4X ve 10X fotoğraflarını olun. İyileşme süreci (normal veya diyabetik) devlet ve yara büyüklüğüne bağlı olarak 2 ile 15 gün arasında sürebilir.
    Not: iyileşme sürecinde, siyah örümcek benzeri hücreler üst odak düzlemi gözlenir. Bu hücreler epitel çıkarıldıktan 4 sonra ölen apoptotik stromal keratositler vardır. Şifa bu ölü hücreler şifa epitel ile büyümüş ve artık görünür (Şekil 2, ek) zaman tam olarak tespit edilir.
  5. şifa sonratamamlama, yarım kornealar kesilmiş kriyostat kesitleri üzerinde dolaylı immünofloresan veya Western lekeleri 16,21 için Ekim bileşik ve bu süreç içinde onları gömmek.

Kök Hücre zenginleştirilmiş Kültürlerin Limbal Hücreler ve Bakım 3. İzolasyon

Not: korneoskleral jantlar primer limbal epitel kök hücre (LESC) bakımından zenginleştirilmiş kültürleri hazırlayın. Kornea nakilleri standart kornea depolama ortamına (örneğin, Optisol) içinde işbirliği cerrahlar alınan sonra sağlıklı donörlerden gelen ve atılan jantlar. Aksi takdirde, LESC zenginleştirilmiş kültür normal ve diyabetik bütün kornea eksize jantlar elde edilebilir veya korneal depolama ortamında Ndri alınan küreler.

  1. Bütün korneaları veya küreler kullanılması halinde, ilk limbal alanları izole. Bunu yapmak için, epitel tarafı ile steril plastik tabak üzerine kornea yukarı yerleştirin ve bir 9 mm trepan (dairesel kornea bıçak) ile merkezi alanı kaldırmak.bu merkezi kısmını atın. Sonra 13 mm trefin kullanarak limbal bölgeyi tüketim ve dış konjonktiva kısmını atın. izole etmek için hücreler, simit gibi limbal kenar kullanımı. hücre izolasyonu önce, steril pamuklu çubukla yüzey epiteli ters korneanın iç tarafında endotel hücreleri ve iris yapışan kalıntıları çıkarmak.
  2. dispase tedavi ile limbal hücre yaprak izole edin. 2 saat 22 süreyle 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1.5 mi keratinosit serumsuz ortam (KSFM) 'de 2.4 U / ml dispase II, her korneoskleral kenar inkübe edin.
  3. Yavaşça forseps bir kesme stereo bir mikroskop altında ağız dışı limbal epitel hücre tabakasını kolaylaştırmak ve% 0.25 tripsin 1 ml hücreleri ayırmak - oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.02 EDTA çözeltisi.
  4. Ortam (ör Epilife) 10 ml hücre yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca masa üstü santrifüjü içinde 300 xg'de bunları pelet.
  5. süspanse inciKültür ortamı içinde, hücrelerin: N2, B27 ve keratinosit büyüme takviyeleri, ve 10 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile orta.
  6. KSFM olarak, 0.5-1 mg / cm2 de, fibronektin, tip IV kolajen, laminin ve (FCL) dahil olmak üzere insan bazal membran proteinlerinin bir karışımı ile kaplanmış şişelerinde 3.000-5.000 hücre / ml ya da 60 mm tabaklar hücreleri Tohum orta.
  7. Kültür, 37 ° C'de, nemlendirilmiş (% 95 ya da daha yüksek nem) CO2 inkübatör hücreler tam konfluent tek tabaka oluşturmayan kadar. Bu 1-2 hafta sürebilir.
    Not: Düzenli Pax6, keratin (K) 14, K15, K17, ve ΔNp63α dahil varsayılan LESC belirteçler pozitif immünositokimyasal boyama ile hücre kimliğini onaylamak. Birincil antikorlar dahil olmak üzere boyama bilgilerini 8,16-18,22 yayınlanmıştır.
  8. 37 ° C'de 10 dakika süre ile (% 0.25 solüsyon 5 dilüsyon 1) konfluent hücreler kanalı için, 1 ml% 0.05 tripsin solüsyonu ile muamele. 5 ml soya fasulyesi tr ekleme3.5 gibi bir ortam içinde 4 ve santrifüj hücreleri: ypsin inhibitör çözeltisi (ug / ml, 10 mg), 1 seyreltilmiştir.
  9. seyreltilmiş soya fasulyesi tripsin önleyicisi çözeltisi 3 ml hücre pelletini yıkayın. 2 x 10 4 hücre / ml FCL-kaplı üzerine hücreleri (3.7 bakınız) yemekleri veya cam haznesi slaytlar Plate.

Organ-kültürlü kornealar 4. adenoviral İletimi

Not: Rekombinant adenovirüsleri (AV), AV-vektörü (Resim geninin dahil) (c-met geninin açık okuma çerçevesi ile), AV-met, (MMP-10 shRNA) ile AV shM10 ve AV-shCF içerir ( shRNA ile) F katepsin için. Bunlar ana ani erken sitomegalovirüs promoterinin kontrolü altında genlerin E1 / E3-silinmiş tip 5 AV vardır. AV-c-met virüsler AV vektör Pad / CMV / V5-dest 16 kullanılarak üretilir. AV-shRNA virüsleri özel bir replikasyon-yetersiz (-E1 / -E3) huma içine iLenti EGFP vektörü gelen HH1 promotör ve GFP etiketi dizisi ile birlikte shRNA dizilerinin alt klonlanması tarafından oluşturulann AV tipi Adeno-4 ifade sistemi 17 ile 5 genom.

  1. Bir gen ifadesi-modülasyon AV, AV-vektörü ve başka kornea ile her çiftin bir organ kültürlü kornea transduce. 24 oyuklu kabına orta yüzeyinin altındaki her kornealar tutarak, 37 ° C'de 48 saat süre ile kültür ortamı içinde kornea başına 0,8 8 ila 10 x 1.25 plak oluşturucu birim (pfu) AV-met kullanın. Kornea başına 1-2 x 10 8 pfu AV-shRNA virüs kullanın.
  2. 75 ug / ml sildenafil sitrat ile eklenmiş tam ortam içinde transdüksiyonu için virüs kullanın. Bu reaktif epitel hücreleri 21 viral alımını kolaylaştırmak kaveolin taşıma aktive eder. Nedeniyle sulu çözeltilerde sildenafilin kısa yarılanma ömrü, daha sonra orta 4-5 saat için aynı miktarda yeniden ekleyin. Standart işleme 48 saat için.
  3. limbusta orta düzeyde tutarak AV olmadan ortamda yuvarlak uç steril spatula ve kültürü ile yeni yemekler korneaları aktarın. add sonraitional sıvı-hava arayüzü de 4-8 gün, süreç epitel yara iyileşmesi için çeşitli analizler veya test için AV-tedavi kornealar (yukarıya bakınız). Rutin olarak korneanın üzerine, 100 ul ortam (iki damla) ilave edilerek kültür sırasında kornealar ıslatın.
  4. Sadece limbal hücrelerin iletimi için merkezi epitel iletimini önlemek için, limbusta orta seviyede hava-sıvı arayüzü de kornealar ile virüsleri kuluçkaya yatmaktadır.

Kültürlenmiş Limbal Hücreleri 5. adenoviral İletimi

  1. 0.5 ug / cm2'de FCL karışımı ile kaplanmış plastik tabaklar 10 ng / ml EGF ile ortam içinde LESC zenginleştirilmiş kültürleri (3.5) muhafaza.
  2. Yeşil floresan proteini geni (AV-GFP) veya AV karıştırılmış enfeksiyon çokluğu aralığında shRNA-GFP (: ​​1-300 PFU / hücre MOI) barındıran AV% 70-80 konfluent ulaşmış kültürlenmiş hücreleri nakletmek 2 ng / ml EGF ile üretilebilir. transductio gerçekleştirinN, 0.5 mi ortamında 20 saat ve ardından en az bir hacim (0.2 mi) içerisinde 37 ° C'de 4 saat karıştırıldı. kaveolin nakil etkinleştiricisi sildenafil hücre kültürü transdüksiyonu için gerekli değildir.
  3. ya da polikatyonlar (1 ug / ml poli-L-lisin ya da 5 ug / ml polybrene), ya da 6 ul / ml transdüksiyon reaktifi (: AV iletim verimliliğini artırmak için hücre yüzeyine bağlanma AV kolaylaştıran aşağıdaki reaktiflerin birini kullanarak ör ViraDuctin) ya da 20 ul / ml transdüksiyon arttırıcı (ör ibiBoost).
  4. AV olmadan biri için orta değiştirdikten sonra, nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesinde, 4 gün süre ile kültüre hücreleri inkübe ve ters flüoresan mikroskop kullanılarak GFP tanımı seviyesini değerlendirmek.
  5. AV-transduced kültürlerde hücre göçü değerlendirmek için karalama yara iyileşmesi tahlil kullanın. multiwell oda slaytlar hücreleri büyümek. 200 ul pi düz bir doğrusal hareket hücreleri kazıyarak bir tek tabaka yaraları yapmakPette ucu. yaralama sonra, müstakil hücreleri çıkarmak için taze bir orta değiştirmek.
  6. 4X büyütme ters bir mikroskop bağlı bir dijital kamera ile her gün yaraları fotoğraf. şifa tamamlandığında zaman kaydetmek (yara kenarları tüm yara boyunca temas).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu kornea organ kültürlerinde, diyabetik belirteçleri (örneğin, bazal membran proteinleri ve integrin α3β1), normal ve diyabetik kornea ile yara iyileşmesi ifadesindeki farklar korunmuş olduğu daha önce gösterilmiştir. Bu kültür sistemi gen diyabet değiştirilmiş belirteçler, c-Met, MMP-10 seviyelerini normale döndürme amaçlı tedavisi ve katepsin F tabi tutuldu

Bütün kornea epitel MMP-10 veya katepsin F (ayrı ayrı veya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kornea bağlı gen verici, hem de etkinliği ve yan etkilerin değerlendirilmesi kolay yüzey konumuna gen terapisi için ideal bir doku gibi görünmektedir. Ancak, bu güçlü bir yaklaşım klinik çevirisi genetik kornea hastalıklarının nedenleri ve gen tedavisi hedefleri 24 kıt bilgilere hala yavaş. Korneal değişiklikler de dahil olmak üzere Diyabetik komplikasyonlar metabolik belleğe 9 çevirir doğada, büyük ölçüde epigenetik olabilir. Bu nedenle, diyabet dokular ve hücreler, ex vivo olarak kendi a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

NIH/NEI R01 EY13431 (AVL) tarafından sağlanan mali desteği, CTSI hibesi UL 1RR033176 (AVL) ve Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Cedars-Cedars Tıp Merkezi'nden alınan hibeleri minnetle kabul ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
minimum esansiyel ortamThermo Fisher Scientific11095-080
Optisol-GS Bausch & Lomb50006-OPT
ABAM antibiyotik-antimikotik karışımıThermo Fisher Scientific15240062
buzağı derisi kollajeni Sigma-Aldrich C9791
agar, doku kültürü sınıfıSigma-Aldrich A1296
n-heptanolSigma-Aldrich 72954-5ML-F
O.C.T. bileşiği VWR Uluslararası25608-930
Dispase II Roche Uygulamalı Bilimler4942078001
keratinosit serumsuz besiyeri (KSFM) Thermo Fisher Scientific17005042
Kalsiyumlu EpiLife ortamıThermo Fisher ScientificMEPI500CA
N2 orta takviyesi, 100xThermo Fisher Scientific17502-048
B27 orta takviyesi, 50xThermo Fisher Scientific17504-044
insan keratinosit büyüme takviyesi, 100xThermo Fisher ScientificS-001-5
tripsin% 0.25 - fenol kırmızısı ile EDTA% 0.02Thermo Fisher Scientific25200056
fenol kırmızısı ile tripsin% 0.25Thermo Fisher Scientific15050065
soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve nbsp;Sigma-Aldrich T6414
fetal sığır serumuThermo Fisher Scientific26140079
insülin-transferrin-selenit takviyesi (ITS)Sigma-Aldrich Keratin 14'e karşı I3146-5ML
antikorSanta Cruz Biotechnologysc-53253
keratin 15'e karşı antikorSanta Cruz Biotechnologysc-47697
keratin 17'ye karşı antikorSanta Cruz BiotechnologySC-58726
&Delta'ya karşı antikor; Np63 ve alfa;Santa Cruz Biotechnologysc-8609
PAX6antikoru BioLegendPRB-278P-100
antikoru nidogen-1R& D Systems,
; 3 ve beta; İnsan354008
Millipore Sigma-Aldrich L4445
insan tipi IV kollajenSigma-Aldrich C6745-1ML
adenovirüsCapital BioSciencesözel yapım
adenovirüs eksprese eden katepsin F shRNA, Capital BioSciencesözel yapım
adenovirüs, scrambled shRNA ve GFP eksprese eden adenovirüsCapital BioSciencesözel yapım
adenovirüs, c-metOriGene (plazmit)SC323278
KeraFASTFVQ002
sildenafil sitrat, eczanedenPfizer
epidermal büyüme faktörü ve nbsp;Thermo Fisher ScientificPHG0311
poli-L-lizinSigma-Aldrich P4707
polibrenSigma-Aldrich 107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi, Almanya50301
fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Corning yuvarlak uçlu spatula ve nbsp;Dow Corning3005
60 mm Petri kaplarıThermo Fisher Scientific174888
Nunc Lab-Tek II çok kuyulu odacıklı kaydıraklar Sigma-AldrichC6807
200 & l pipet uçlarıBioexpressP-1233-200diğer tedarikçiler mevcut
ters mikroskop ve nbsp;NikonDiaphotdiğer tedarikçiler / modeller mevcut
nemlendirilmiş CO2< / sub> inkübatörü ve nbsp;Thermo Fisher Scientific370 (Steri-Cycle)diğer tedarikçiler/modeller mevcut
floresan mikroskopOlympus, JaponyaBX-40diğer tedarikçiler/modeller mevcut
diseksiyon stereo mikroskopLeica, AlmanyaS4 Ediğer tedarikçiler/modeller mevcut
, , , , , , , , integrin ve alfa antikorunu MAB2570 laminini insan fibronektini BD Biosciences MAB1992 EMD MMP-10 shRNA eksprese eden , , eksprese eder GFP 25 mg eksprese eden

Kaynaklar

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425(2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

c-met Proto-onkogenMMP-10 DownregülasyonuKatepsin F İnhibisyonuPolikatikyonik Geliştiriciler
Diyabetik Keratopatide için adenoviral Gen Tedavisi: İnsan Organ-kültürlü kornealar ve Limbal Epitel Hücreleri Yara İyileşmesi Üzerine Etkileri ve Hücre Marker İfade Kök
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.