Bu makalede, kan-beyin bariyerini geçer ve seçici olarak p-kıvrımh için yoğun bir çekirdek Aβ plaklarda bulunan yaprak bağlanan metoksi-x04 kullanarak Alzheimer hastalığı fare modellerinde amiloid Aβ plaklar görselleştirmek için bir protokol açıklamaktadır. Bu elektron mikroskobu için immün ve işleme öncesinde plak içeren doku kesitlerinde önceden tarama sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Ayrıntılı bir protokolünü Alzheimer hastalığı fare modellerinde beyin kesitlerinde amiloid Aβ plaklar tespit etmek için ön-işlemden geçirilmesi gömme immün ve doku işleme (özellikle iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (IBA1), mikroglia tarafından ifade edilen bir kalsiyum bağlama proteini) elektron mikroskobu (EM). Metoksi-x04 yoğun çekirdekli Aβ plaklarda bulunan p-kıvrımh bir yaprak bağlanan seçici, kan-beyin bariyerini geçer ve bir flüoresan boya olan. metoksi-x04 hayvanların enjeksiyon öncesinde kurban ve beyin sabitleme öncesi tarama ve zaman alıcı manipülasyonlar ile daha fazla işlem için plaka ihtiva eden beyin bölümlerinin seçimi olanak sağlar. bölümlerin sadece küçük bir fraksiyonu mevcut çok az plaklar içerebilir spesifik beyin bölgelerinde veya tabakaların içinde erken AD patolojisinden okuyan bu özellikle yararlıdır. Kongo Kırmızısı, Tioflavin S ve Thiofl doku bölümleri ölüm sonrası işlemleravin T (hatta metoksi-x04) ile β-pilili yaprak etiket, ancak aşırı boya kaldırmak için etanol ile kapsamlı takas gerektirir ve bu işlemlerin ultrastrüktürel korunması ile uyumsuz olabilir. Aynı zamanda sadece doğru yerde Aβ plaklar içeren küçük bir bölümünü elde etmek için, Aβ (ve IBA1 gibi diğer hücresel belirteçleri) ilgi bölgelerinden tüm beyin kesitlerinde için etiketleme yapmak verimsiz olacaktır. Önemlisi, Aβ plaklar elektron mikroskobu ile incelenmesi alanlarında kesin kimlik (genellikle birkaç milimetre karelik kadar) sağlayan, EM için doku işlendikten sonra hala görebilir.
Giriş
Amiloid Aβ plak oluşumu, Alzheimer hastalığı (AD), ana nöropatolojik özelliğidir. Ancak artan kanıtlar hastalığın ilerlemesi 1,2 bağışıklık sisteminin önemli roller önerir. Özellikle, klinik öncesi ve klinik çalışmalardan elde edilen yeni veriler AD patolojiye ana sürücü ve katılımcı olarak bağışıklık disfonksiyonu kurdu. Bu bulgularla, santral ve periferik bağışıklık hücreleri AD 3 olarak umut verici terapötik hedefler ortaya çıkmıştır. Aşağıdaki protokol Aβ plak birikimi ve AD mikroglial fenotipik değişiklikler arasındaki ilişki yeni bir bakış açısı oluşturmak için ışık ve elektron mikroskobu (EM) birleştirir. Bu protokol, floresan boya metoks....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Université Laval Hayvan Bakım Komitesi tarafından yönetilen gibi tüm deneyler onaylanmış ve Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi ile uyumlu, Kurumsal hayvan etik komitenin kurallarına altında yapıldı. yaş 4 ile 21 ay arasında, APP-PS1 erkek fareler kullanılmıştır. yiyecek ve suya serbest erişim ile 25 ° C - Bu hayvanlar, 22, 12 saat ışık-karanlık çevrimi altında muhafaza edilmiştir.
1. Metoksi-x04 Çözeltisinin Hazırlanması
- % 10 dimetil sülfoksit (DMSO),% 45 propilen glikol ve% 45 sodyum fosfat tamponlu tuzlu su (100 mM fosfat tampon maddesi içinde% 0.9 NaCl ihtiva eden bir çözelti içine metoksi-x04 çözülmesiyle metoksi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu bölüm, protokol farklı kritik aşamada elde edilebilir sonuçları göstermektedir. hipokampus CA1, tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare: Özellikle sonuçları beyin metoksi-x04 lekeli belirli bir bölgedeki plaklar ve ilgi katmanları içeren bölümlerinin örneklerini göstermektedir. Plaklar ve hipokampus lamelli / bölgesel örgüt gittikçe UV ve parlak bir alan filtreleri (Şekil 1) bir kombinasyonu kullanılarak görüntülenmiştir. Seçilen beyin bölümleri sonradan boyanmış v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol EM ile yoğun çekirdek Aβ plaklar hedefleyen bir bağlaşık bir yaklaşım açıklar. In vivo enjeksiyon metoksi-x04 Örneğin, hipokampus CA1, tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare Aβ belirli bölgeler içinde plaket ve ilgi katmanları ihtiva beyin bölümlerinin hızlı seçilmesini sağlar. Bu örnekte, metoksi-x04 Ön görüntüleme mikroglial fenotipleri yoğun ana Aβ plaklar mevcudiyetinde ultra-yapı seviyesinde sinaps etkileşime kadar farklı çalışma IBA1 için immün öncesi gömme ile bir araya getirilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Centre de recherche du CHU de Québec'in Biyogörüntüleme Platformu'ndan Dr. Sachiko Sato ve Julie-Christine Lévesque'ye teknik yardımları için minnettarız. Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) RGPIN-2014-05308, Banting Araştırma Vakfı ve Kanada İskoç Riti Yardım Vakfı'ndan M.E.T'ye verilen hibeler bu çalışmayı destekledi.
H.E.H., Lübnan Eğitim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı'ndan ve K.B. Université Laval Faculté de médecine'den burs aldı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Metoksi-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | tablet başına 10 mg substrat |
| Propilen glikol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Dikkat: toksik |
| Sodyum Klorür NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodyum fosfat monobazik monohidrat | Sigma | S9638 | |
| Sodyum fosfat dibazik | Sigma | S0876 | |
| Tris Hidroklorür | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Akrolein | Sigma | 110221 | Dikkat: Toksik |
| Paraformaldehit Granül | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 19210 | Dikkat: Toksik |
| Filtre kağıdı | Fisher | 09-790-14F | |
| Borulu Peristaltik Pompa | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Kanatlı kan Alma Seti İğneler 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Ekstra İnce Forseps | FST | 11152-10 | Uç şekli: kavisli |
| Makas | FST | 14090-09 | Uç şekli: düz |
| Hartman Kanama Durdurucular | FST | 13003-10 | Uç şekli: kavisli |
| Cerrahi Makas | FST | 14004-16 | Uç şekli: düz |
| Mikro Diseksiyon Makası | ROBOZ cerrahi mağaza | 5818 | |
| Cam sintilasyon şişeleri | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Titreşimli Bıçak Mikrotom Leica VT1000 S | Leica Biosystems | ||
| Vibratom bıçakları | Elektron mikroskobu Bilimleri | 71990 | |
| Mikroskop Slaytları | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24 kuyulu Doku Kültürü Plakaları | Fisher Scientific | 353047 | |
| Etilen Glikol | Fisher BioReaktifler | BP230-4 | |
| Gliserol | Fisher BiyoReaktifleri | BP229-4 | |
| Hidrojen Peroksit, %30 | J.T.BAKER | kedi: 2186-01 | |
| Sodyum borhidrür | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal sığır Serumu (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Sığır serum albümini (BSA), fraksiyon V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Tavşan | WAKO | 019-19741 | |
| Keçi Anti-Tavşan IgG | Jackson İmmünoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kiti (Standart) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidin tetra-hidroklorür (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Dikkat: toksik |
| Osmiyum tetroksit,% 4 çözelti | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 19150 | Dikkat: toksik |
| Durcupan ve ticaret; ACM tek bileşenli A | Sigma | 44611 | Reçine Dikkat: Toksik |
| Durcupan ve ticaret; ACM tek bileşenli B | Sigma | 44612 | Sertleştirici Dikkat: Toksik |
| Durcupan ve ticaret; ACM tek bileşenli C | Sigma | 44613 | Plastikleştirici Dikkat: Toksik |
| Durcupan ve ticaret; ACM tek bileşenli D | Sigma | 44614 | Hızlandırıcı Dikkat: |
| Toksik Etanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propilen oksit | Sigma | 110205 | Dikkat: aşındırıcı |
| Alüminyum tabakları tartı Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 70048-01 | |
| ACLAR® – Floropolimer Filmler Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 50425 | |
| Fırın/İnkübatör | VWR |
Kaynaklar
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
