Yöntem makalesi

İnsan Kan BOS Bariyer A Koroid Pleksus Epitel Hücre bazlı Modeli bazolateral Side Bakteriyel Enfeksiyon Eğitim için

DOI:

10.3791/54061

⸱

6 Mayıs 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of NDU Life Sciences, Nippon Dental University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koroid pleksusun (CP) epitel hücreleri kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini (BCSFB) oluşturur. BCSFB'nin in vitro modeli, insan koroid pleksus papilloma (HIBCPP) hücrelerini kullanır. Bu makale, bir hücre kültürü filtre ekleme sistemi kullanılarak HIBCPP hücrelerinin kültürlenmesini ve bazolateral enfeksiyonunu açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynin ventriküler sisteminde yer alan koroid pleksusun (CP) epitel hücreleri kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini (BCSFB) oluşturur. BCSFB, beyin omurilik sıvısını (BOS) kandan ayırmada ve moleküler değişimi minimum ölçüde kısıtlamada işlev görür. BCSFB'nin in vitro modeli, bir insan koroid pleksus papillomundan (HIBCPP) türetilen hücrelere dayanmaktadır. HIBCPP hücreleri, sıkı bağlantıların (TJ'ler) oluşumu, transepitelyal elektrik direncinin (TEER) geliştirilmesi ve makromoleküller için küçük geçirgenlikler dahil olmak üzere tipik bariyer işlevleri gösterir. BCSFB yoluyla merkezi sinir sistemine (CNS) girebilen ve daha sonra menenjit gibi ciddi hastalıklara neden olabilen birkaç patojen vardır. Bu patojenlerden biri, insana özgü bir bakteri olan Neisseria meningitidis (N. meningitidis)'dir. HIBCPP hücrelerinin bir ters hücre kültürü filtre ekleme sisteminde kullanılması, patojenlerin BCSFB hücreleri ile etkileşimlerinin bazolateral hücre tarafından incelenmesini sağlar, bu da in vivo olarak ilgilidir. Bu makalede, hücre kültürü eklerinde HIBCPP hücrelerinin tohumlanmasını ve kültürlenmesini açıklıyoruz. Ayrıca, hücrelerin N. meningitidis ile enfeksiyonu ve çift immünofloresan yoluyla istila edilmiş ve yapışmış bakterilerin analizi gösterilmiştir. SP hücreleri, Alzheimer hastalığı ve Multipl Skleroz gibi nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere diğer hastalıklarda ve ayrıca tümör hücrelerinin beyin metastazı sırasında da yer aldığından, model sistem diğer araştırma alanlarında da uygulanabilir. Moleküler mekanizmaları deşifre etme ve yeni terapötik hedefleri belirleme potansiyeli sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan-beyin-omurilik sıvısı bariyeri (BCSFB) kan ve beyin 1 arasında üç engelleyici yerlerden biridir. Morfolojik korelasyon koroid pleksus (SP) 2,3 epitel hücreleri, güçlü bir vaskülarize ve beyin ventriküller bulunan bir endotelyal ve epitelyal bükülü. CP serebrospinal akışkan (CSF) üretimi için hem de kan ikinci ayırma görevini görür. Bariyer fonksiyonunu elde etmek için, CP epitel hücreleri, düşük pinositoz aktivite gösteren spesifik taşıyıcıları ifade eder ve yoğun sıkış kesişmeler (TJs) -2,3 sürekli bir ağ ile birleştirilir.

Japon kadın 4 kötü huylu bir koroid pleksus papillomu türetilen insan koroid pleksus papillomu (HIBCPP) hücreleri, BCSFB in vitro model fonksiyonel oluşturmak için kullanıldı. HIBCPP hücreleri TJ oluşumu gibi bir fonksiyonel BCSFB özellikleri bir çift göstermektedirşeritler, transepitelyal elektrik direnci (TEER) gibi belirlenebilir yüksek transepitelyal membran potansiyeli geliştirilmesi ve Makromoleküller için az geçirgenlik. Ayrıca, HIBCPP hücreleri iyonik mikro düzenleyen hizmet ve bazolateral / apikal polarite 5,6,7 gösterebilir karakteristik taşıyıcıları, ifade eder.

BCSFB merkezi sinir sistemi (MSS) 8 içine patojen (bakteriler, virüsler ve mantarlar) için bir giriş yeri olarak işlev gösterilmiştir. Neisseria meningitidis (N. meningitidis), Gram-negatif bakteri de dahil olmak üzere patojenlerin, işgali menenjit gibi ciddi hastalıklara neden olabilir. Bu CP koruyucu epitel engelinin üstesinden gelecek, kanıtlar meningokok hastalığı damar ve CP epitel hücreleri 9,10 meningokoklara artan miktarlarda sergileyen hastalarda histopatolojik gözlemler ile desteklenir. konakçı hücreler ba içine girmeyecteria genellikle aracılık ettiği veya konakçı hücreler üzerinde bulunan spesifik yüzey reseptörleri tarafından tetiklenen endositoksik mekanizmaları kaçırma. Bu reseptörler ile patojenlerin etkileşimleri türler olabilir çünkü belirli 11, hayvan modelleri sadece kısıtlı ölçüde konsülte edilebilir. HIBCPP hücre hattı işgali sürecinin yanı sıra bir insan modeli sisteminde altta yatan moleküler mekanizmaları incelemek için fırsat sağlar. Hücre kültürü ekler istihdam iki ayrı hücre taraftan konakçı hücreleri ile patojenlerin etkileşimleri analiz etmemizi sağlar. Bir çok bakteri, aşağıdakileri içeren N. meningitidis enfeksiyonu deneyleri sırasında yerçekimi etkisi güçlü bir şekilde bağlıdır. deneyleri sırasında HIBCPP hücreleri ile patojenlerin optimum etkileşim, bakteriler, başlangıçta hücre kültürü filtre elemanı sisteminin üst bölmeye eklenir. Sırasıyla, in vitro sistemde iki varyasyonları olmuştur esta apikal veya bazolateral hücre tarafından enfeksiyonu etkinleştirmek içinblished: Standart sistemde HIBCPP hücreleri mikroorganizmalar CSF-tarafında yer alan ve hücreler (Şekil 1A, C), apikal kısmı ile temas içine almak da durum taklit filtre elemanının üst bölmesine ekilir. Buna karşılık, bir ters hücre kültürü filtresi elemanı sisteminde HIBCPP hücreleri kullanılarak bakteri kan dolaşımına girmiş koşullarını yansıtmaktadır. Mikroorganizmalar bazolateral tarafı (Şekil 1B, D) kan ve karşılaşma CP epitel hücrelerinde yaymak. Dikkate değer olarak, bu model sistemde bakteri bazolateral hücre tarafı 5,7 arasında, özellikle polar bir şekilde HIBCPP hücreleri istila gösterilmiştir.

Daha sonra CP enfeksiyon, işgal patojenler örüntü tanıma reseptörleri ligasyon yoluyla doğuştan gelen bağışıklık sistemi (PRR) tarafından kabul edilebilir. PRR ve iyi tanımlanmış üye Toll-benzeri reseptör (TLR) ailesine aittir. TLR can binVadeli patojenle ilişkili moleküler yapılar (PAMPS) olan bulaşıcı mikroorganizmaları genel karakteristik özellikleri, d. Reseptör bağlama da BCSFB 13,14 boyunca bağışıklık hücrelerinin göçünde uyaran sitokinler ve kemokinlerin 12 ekspresyonunu tetikleyen konakçı hücre aktivasyonu sinyal iletim yol açar. Hücreler, birkaç HIBCPP mRNA düzeyindeki TLR ve N ile birlikte bu enfeksiyon ifade gösterilmiştir meningitidis CXCL1-3, IL6, IL8 ve TNFa 15,16 dahil olmak üzere çeşitli sitokinler ve kemokinlerin, salgılanması ile sonuçlanır.

Burada, BCSFB taklit eden bir ters hücre kültürü uç sisteminde yetiştirme ve insan hücre hattı HIBCPP enfeksiyonunu tarif eder. Bu model sistemi, in vivo ilgili bazolateral hücre tarafı hem de daha sonra, hücresel yanıt patojenlerin etkileşimleri incelemek için olanak sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bir Ters Model Sistemde Tohum HIBCPP Hücreleri Hücre Kültürü Filtre Uçlar hazırlayın

  1. 5 ug / ml insülin ile takviye edilmiş ön sıcak DMEM / F12 (HAM), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 10 cenin buzağı serumu (FCS).
  2. Baş aşağı 12 oyuklu plaka (Şekil 1 E) olarak 3 um arasında bir gözenek boyutuna sahip 0,33 cm² büyüme alanı, hücre kültürü filtre malzemeleri yer steril forseps kullanın.
  3. Hücre kültürü filtre elemanının alt bölmeye (3 mi) ve filtre elemanının üzerine 100 ul içinde orta doldurun. plaka yanı sıra orta alt bölme sel. Filtre elemanının alt bölmesi (Şekil 1 E) dolu kalır şekilde aşırı ortam aspire.
    Not: adım için bir serolojik pipet kullanılması tavsiye edilir.
  4. , Kapaklı 12-plaka Kapak ve inkübatör hazırlanan hücre kültürü filtre ekler aktarmak 37 ° C,Hücrelerin ilave edilene kadar% 5 CO2.

2. Yetiştirme ve HIBCPP Hücrelerinin Pasajlanması

  1. 5 ug / ml, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 10 FCS ile takviye edilmiş DMEM / F12 (HAM) hazırlayın.
  2. 37 ° C su banyosunda Pre-sıcak orta ve PBS. şişeye aspire ortamı. şişeye ve girdap 10 ml PBS ekleyin. kez bu adımı yineleyin.
  3. şişeye ve girdap 3 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. , Inkübatör içine 37 ° C,% 5 CO2 yerleştirin.
  4. Yaklaşık 20 dakika sonra inkübatörden balon çıkarın. Hücreler şişenin dibine kopuk olduğundan emin olun ve mikroskop ile incelenen zaman yuvarlak bir şekle görüntüler.
    Not: hücreler, birbirinden tamamen ayırmak ve bu nedenle sıklıkla topakların bulunurlar. Geçit 38'e kadar hücrelerin kullanımı tavsiye edilir.
  5. 17 ml orta ekleyin trypsinization durdurmak için. aşağı yukarı pipetleme hücreleri tekrar süspansiyon ve süspansiyonu transfer50 ml'lik bir tüp içine. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 x g'de santrifüjleyin.
  6. ortamın uygun hacimde bir hücre yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı.
    Not: yeniden süspansiyon haline HIBCPP hücre konsantrasyonu 1 x 10 6 hücre / mL olmalıdır. HIBCPP hücrelerin korunması için, T75-şişeye 10 mi ortam içinde 1-6 x 10 6 hücre bir miktarı aktarmak için önerilmektedir. her ikinci gün orta değiştirin.

HIBCPP Hücreleri ile 3. Tohumculuk Ters Hücre Kültürü Filtre ekler

  1. (Filtrenin alt tarafına, yani), her bir ters filtre elemanının üzerine hücre süspansiyonuna (yani. 8 x 10 4 hücre) (Şekil 1 E) 80 ul ekle.
    Not: Hücreler eşit tohumlama önce tersini tüp süspansiyon dağıtılır emin olun.
  2. inkübatör 12 oyuklu plaka ve transfer kapak, 37 ° C'de,% 5 C ile tohumlanır-hücre kültür filtre ekler KapakO 2.
  3. İlk gün, 24 oyuklu bir plaka gözlerine 1 mi ortam doldurun. 12 plaka dışına forseps kullanarak hücre kültürü filtre ekler kaldırın, iç orta atmak filtre ekler açmak ve hazırlanan 24 plaka (Şekil 1E) içine standart yönde yerleştirin.
  4. her ikinci gün taze ortama hücreleri yerleştirin. taze ortam ile 24 kuyu hazırlayın ve buna filtre ekler aktarın. 0.5 mi taze ortam ile uçlar doldurun. 4. bölümde açıklandığı gibi, her gün teer edin.
  5. Hücre kültürü ekler üzerinde HIBCPP ekildi hücrelerinin TEER değerleri aştığında 70 Ω X cm² (yaklaşık olarak 4 gün Tohumlamadan sonra), daha sonra% 1 FCS ve 5 ug / ml insülin içeren bir ortam içinde hücre kültürü devam etmektedir. her bir 1 ml ortam ile 24 oyuklu plakalar hazırlamak. Üst bölmede hazırlanmış kuyular ve döviz ortamına filtre ekler aktarın.
    Not: konfluent sonra bu serum çekilmesi oluşumuna yol açardaha yüksek bir zar potansiyeli.
  6. Filtre bölümünden orta aspire, iyi hazırlanmış transfer ve 500 ul orta ile doldurun. kez bu adımı yineleyin. , Inkübatör içine gece boyunca 37 ° C,% 5 CO2 hücreleri koyun.

Transepitelyal Elektrik Direnci 4. Ölçümü (TEER)

  1. % 80 etanol içinde 15 dakika boyunca epitel doku voltohmmeter bir elektrot uçları bırakın. kaputun altında voltohmmeter aktarın ve bir an için elektrot kurumaya bırakın. dengelenmeye 15 dakika daha hücreler için kullanılan ilgili kültür ortamına içine daldırın.
  2. filtre elemanı bölmeye kısa kol koyun, alt bölümünün alt her zaman değecek şekilde elektrodun uzun kolu konumlandırarak ölçümleri gerçekleştirmek.
    Not: Hücre kültürü filtre ekler Direnç değerlerini ortamda hücreler olmadan boş değerler kullanılmalıdır ((ölçülen değer (Ω) - boş değer (Ω)) x filtreYüzey (yani 0.33 cm²)).
  3. 15 dakika boyunca% 80 etanol içine elektrot yere geri ölçtükten sonra. kuru tüp içinde saklayın.

Parasellüler geçirgenliği 5. belirlenmesi

  1. 5 ug / ml insülin,% 1 FCS ile takviye edilmiş 200 ml kültür ortamı içinde 1 g FITC inulin eritin. hücrelerin enfeksiyondan önce üst filtre bölmesine çözelti 50 ug / ml uygulanır.
  2. enfeksiyondan sonra çok İnülin hücre katmanı üzerinden filtre bölmesinden nasıl geçtiğini belirlemek için alt kuyudan orta örnekleri toplamak.
  3. bir FITC-inulin standart solüsyonu hazırlayın ve 1 gerçekleştirmek: 2 dilüsyonlarla 10 kez (100,% 50,% 25,% 12.5,% 6.25,% 3.13,% 1.56,% 0.78,% 0.39,% 0.2, ve% 0%) . mikroplaka okuyucu Tüm numunelerin ölçülmesi ile floresan belirler.

Hücre Kültürü Filtre Eklemeler üzerinde HIBCPP Hücre Enfeksiyon için Bakterilerin 6. hazırlanması

  1. Deneyden bir gün önce, sıyrık tO donmuş N. meningitidis Vitox Çikolata Agar üzerinde bir gliserol-stok ve çizgi dışarı kapalı suşları. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de, bir gece boyunca inkübatör içinde büyür.
  2. Bir gecelik kültürün 20-30 koloniler ekstrakte edin ve% 0.042 NaHCO 3, 0.01 M MgCI2 ve% 1 Polyvitex ile desteklenmiş 8 mi proteoz pepton ihtiva eden bir tüp içine aktarılır.
  3. 220 rpm'de, 37 ° C'de 1.25 saat boyunca bakteri çalkalayın. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 2.684 g'de santrifüje edilerek, bakterinin ufalanması. Süpernatant atılır ve 8 ml serumsuz ortam ile bakteriyel pelletini. Girdap homojen bir süspansiyon haline sağlamak.
  4. Kültür yoğunluğu belirlemek için, 600 nm'lik bir optik yoğunluğa (OD) olarak 1:10 seyreltme ölçer. OD 0.1 600 bakteri süspansiyonu ayarlayın.
    Not: Bu süspansiyon yaklaşık içerir. 1 x 10 8 CFU / ml olmuştur.
  5. Bakteriyel hücre konsantrasyonunu doğrulamak için, bir kadar süspansiyon aşamalı (1:10) seyreltikÇikolata Agar plakaları üzerine 10 -5 seyreltme ve plaka.
    Not: Benzer seri seyreltme bakteriyel büyüme eğrileri hesaplamak için yapılması gerekir.

Çift İmmünofloresan tarafından Bakteriyel Invasion Hücre Kültürü Filtre Eklemeler ve Belirlenmesine İlişkin HIBCPP Hücreleri 7. Enfeksiyon

  1. % 1 FCS ve 5 ug / ml insülin içeren bir ortam içinde hücre kültürü devam sonra, epitel doku voltohmmeter ile her gün hücreler ölçer. Hücreler yaklaşık 500 Ω x cm² bir teer ulaşmış ise, enfeksiyon yürütmek.
  2. Zaman, belirtilen süre boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de, enfeksiyon 10 deposu inkübatör enfekte hücreleri (MOI) bir çokluğunda hazırlanmış bakteriyel süspansiyonun hücreleri enfekte etmektedir.
    Not: İçişleri Bakanlığı izdiham (1.21 x 10 6 hücre / cm2) de dikkate hücre kültürü filtre elemanının başına hücre sayısını alarak hesaplanabilir.
  3. Infect durdur% 1 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden 500 ul serumsuz ortam maddesi ile üç kez (SFM) yıkayarak iyonu alt bölme için, filtre bölmesine 1 ml uygulanmıştır.
  4. 500 ul SFM filtre bölmesi içinde% 1 BSA tampon içeren ve spesifik olmayan bağlanma sitelerinin antikorların yapışmasını önlemek için, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca alt bölme 1 ml ile bloklayın.
  5. 100 ul primer antikor anti N. inkübe Filtre bölümü ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca alt bölmeye 500 ul: meningitidis α-OMP (200 1).
    Not: Gerekirse, antikor konsantrasyonu titre edilmesi gerekmektedir.
  6. Filtre bölümünden orta aspire hücreleri yıkayın,% 1 BSA içeren bir iyi hazırlanmış 1 ml SFM filtre elemanını aktarmak ve% 1 BSA içeren 500 ul SFM ile boşaltılmış filtre bölmesi doldurun. İki kez bu adımı yineleyin.
  7. Filtre iştigal 500 ul% 4 formaldehit hücreleri saptamakrtment, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca alt bölme 1 mi.
  8. Filtre bölümünden orta aspire hücreleri yıkayın, 1 ml PBS ile bir hazırlanan oyuğa filtre elemanını aktarmak ve 500 ul PBS ile boşaltılmış filtre bölmesi doldurun. kez bu adımı yineleyin.
    Not: Numuneler 4 ° C'de PBS içinde gece boyunca saklanabilir.
  9. Kesme sabit hücre kültürü ekler üzerinden filtre eder ve 250 ul PBS,% 1 BSA ihtiva eden ile yıkayın. hücre dışı bakteriler leke: etiketli 250 ul floresan (emisyon dalga boyu 594 nm) ikincil antikor, tavuk anti tavşan (1: 500) ile, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
    Not: Gerekirse, antikor konsantrasyonu titre edilmesi gerekmektedir.
  10. 250 ul PBS, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 BSA ve% 0.5 Triton X-100 ihtiva eden hücreleri geçirgenliği. 250 ul PBS% 1 BSA içeren hücreleri üç kez yıkayın.
  11. 250 ul primer antikor anti N. inkübe meningitidis α-OMP (1: 200), 30 dakika boyunca ekstra ve hücre içi bakteri leke. 250 ul PBS% 1 BSA içeren hücreleri üç kez yıkayın.
  12. Floresan etiketli (emisyon dalga boyu 660 nm) Phalloidin (1: 250) ve 4', 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) (: floresan etiketli (emisyon dalga boyu 488 nm) ikincil antikor (1: 500), 250 ul uygulayın 1: 50,000), oda sıcaklığında 1 saat boyunca ekstra ve hücre içi bakteri, aktin hücre iskeleti ve çekirdekleri leke.
    Not: Gerekirse, antikor konsantrasyonu titre edilmesi gerekmektedir.
  13. 250 ul PBS% 1 BSA içeren hücreleri üç kez yıkayın. mikroskop aracılığıyla inceleme kadar 4 ° C'de orta ve mağaza montaj hücreleri gömün.
  14. Önceden tanımlanmış alan başına işgal bakteri sayısını belirler. Filtre membranı başına 20 alanlar sayarak bunu yapın. işgal bakteri yüzdesini hesaplayın.
    Not: Bir alan coeffic 20 mikroskobik alanları ortalama bakteri sayısı çarpınsağ- lasa. Sonuç 0.33 cm² hücre kültürü filtre elemanının içinde bulunan toplam bakteri miktarını ifade eder. enfeksiyon süresince ortam yetişen bakteri miktarı ile değerine bölünür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada ters bir hücre kültürü insert sisteminde kültürlenmesini ve HIBCPP hücrelerin enfeksiyonunu tanımlar. Bu model bize (Şekil 1) yayma ve kan dolaşımı yoluyla epitel hücreleri giren bakteri fizyolojik durumunu üreten, bazolateral hücre taraftan işgali mekanizmaları ve altında yatan moleküler sinyal yolları çalışma sağlar.

HIBCPP hücreleri asgari düzeye moleküler değişimi kısıtlamak sağlayacak bazı bariyer ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SP'nin epitel hücreleri, kan 2,3 dan CSF ayıran BCSFB oluştururlar. Son zamanlarda BCSFB bir fonksiyonel insan model olarak HIBCPP hücre hattı kuruldu. Hücreler, yüksek membran potansiyelinin geliştirilmesi, makromoleküller için düşük geçirgenlik, aynı zamanda TJs 5 sürekli elyaf varlığı da dahil vitro BCSFB arasında önemli bir engel fonksiyonlarını gösterir. TJ proteinler hücrelerin bazolateral / apikal kutuplarına katkıda bulunur. kutup yüzeyi reseptörlerinin yönlendirilmiş lokalizas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, elektron mikroskobunu gerçekleştirdiği için Prof. Hartwig Wolburg'a teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTAGibco25200-056
4 akut;, 6 diamidino-2-fenilindol (DAPI)Yaşam TeknolojileriD1306
12 oyuklu plakalarStarlabCC7682-7512
24 oyuklu plakalarStarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPBu antikor, Dr. H. Claus ve U. Vogel'in (Wü Üniversitesi; rzburg, Almanya)
Alexa Fluor 488 (tavuk anti tavşan)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (tavuk anti tavşan)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
Sığır serum albümini (BSA)Calbiochem12659
Çikolatalı agar plakalarıBiomerieux43109
Sitokalasin DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES FenolredGibco11039-047
Dimetil sülfoksitSigmaD2650
Fetal buzağı serumu (FCS)YaşamTeknolojileri 10270106
FITC-İnülinSigmaF3272
İnsülinSigma19278
MgCl2< / sub>Sigma2393
NaHCO3< / sub>Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
Penisilin / StreptomisinMP Biyomedikal1670049
PolyvitexBiomerieux55651
Proteoz peptonBD211684
Serum içermeyen ortamGibco10902-096
24 oyuklu plakalar için Thincert hücre kültürü ekleri, gözenek boyutu 3 ve mikro; mGreiner662630
Doku kültürü şişesi 75 cm² kırmızı kapaklı sterilGreiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Volt-Ohm Metre Millicell-ERS2 MERSSTX01 elektrotluMillipore MERSSTX00

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
  2. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
  3. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
  4. Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
  5. Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069(2012).
  6. Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
  7. Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  8. Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80(2015).
  9. Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
  10. Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
  11. Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
  12. Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
  13. Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
  14. Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
  15. Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  16. Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30(2013).
  17. McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
  18. Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
  19. Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
  20. Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
  21. Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
  22. Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
  23. Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
  24. Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
  25. Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
  26. Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
  27. Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
  28. Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
  29. Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
  30. Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
  31. Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
  32. Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
  33. Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Choroid Plexus Epithelial CellsHuman Choroid Plexus Papilloma CellsTransepithelial Electrical Resistance MeasurementTight Junction Formation AnalysisBasolateral Bacterial Infection ModelNeisseria Meningitidis Invasion AssayFITC Inulin Permeability TestCell Culture Filter Insert SystemImmunofluorescent ZO 1 Occludin Claudin

İlgili makaleler