Yöntem makalesi

PGR-Mavi Plasmitlerinin ve Golden Gate Meclis kullanma Terminatör Hızlı Doğrulama

DOI:

10.3791/54064

⸱

25 Nisan 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, in silico bulunan sonlandırıcıların gücünü hızlı bir şekilde ölçmek için Golden Gate Assembly ve plazmid pGR-blue'yu kullanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, biyoinformatik olarak tanımlanmış sonlandırıcıların hızlı bir şekilde doğrulanmasına izin vermektir. Ayrıca, plazmit (pGR-Blue) bu protokol için özel olarak tasarlanmıştır ve sonlandırıcı verimliliğinin ölçülmesine izin verir. Kavramın bir kanıtı olarak, mikobakteriyofaj Bernal'de altı sonlandırıcı biyoinformatik olarak tanımlandı13. Tanımlandıktan sonra, sonlandırıcılar daha sonra uygun yapışkan uçlara sahip oligonükleotidler olarak yapıldı ve birlikte tavlandı. Golden Gate Assembly (GGA) kullanılarak, sonlandırıcılar daha sonra pGR-Blue'ya klonlandı. Görünür ışık altında, yalancı pozitif koloniler mavi görünür ve pozitife dönüşmüş koloniler beyaz/sarıdır. Arabinoz ile indüklenebilir bir promotörün (pBad) indüksiyonundan sonra, üretilen yeşil floresan proteininin (GFP) üretilen kırmızı floresan proteinine (RFP) oranı ölçülerek koloni gücü belirlenebilir. pGR-Blue ile protokol üç gün gibi kısa bir sürede tamamlanabilir ve bir eğitim ortamı için idealdir. Ek olarak, sonuçlar, bu protokolün, transkripsiyonun düzenlenmesi ile ilgili sonlandırıcı verimliliğinin in silico tahminlerini anlamak için bir araç olarak yararlı olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük sentetik biyoloji projeleri, gen ekspresyonunu düzenlemeye yardımcı olmak için oldukça etkili transkripsiyon sonlandırıcılarının kullanılmasını gerektirir. Yeni sonlandırıcıların tanımlanması, yeni genomların biyoinformatik analizini gerektirir. Bununla birlikte, her biri tahmin için kullanılan benzersiz bir algoritmaya sahip artan miktarda biyoinformatik yazılım geliştirildikçe, varsayılan sonuçlar arasında daha fazla tutarsızlık ortaya çıkmaktadır. Bu süreç biraz öznel olduğundan ve in silico olarak yapıldığından, bu tahminlerin biyolojik olarak doğrulanması gerekir. 1 Ek olarak, in-silico analiz yoluyla tanımlanan varsayılan sonlandırıcıların hacmi, nispeten kısa bir zaman diliminde tamamlanabilen klonlama stratejilerinin kullanılmasını gerektirir.

PGR-Blue plazmid, tüm reaksiyon adımlarının tek bir mikro-santrifüj tüpünde aynı anda gerçekleştirilmesine izin vererek klonlama prosedürünü basitleştirmek için Golden Gate Assembly (GGA) kullanmak üzere yeniden tasarlanmış PGR plazmidinin bir modifikasyonudur. 2,3 Pozitif kolonileri tanımlama kolaylığını artırmak için renk seçimi plazmide dahil edildi. Başarılı bir ligasyon, arabinoz içeren plakalar üzerinde büyütüldüğünde görünür ışıkta beyaz/sarı ve mavi (450 nm) veya ultraviyole (UV) ışık altında floresan yeşil olmalıdır. Kesilmemiş pGR-mavisi bir mavi kromo proteini (amilCP) içerdiğinden, değiştirilmemiş bir plazmit içeren koloniler görünür ışık altında mavidir. Bu basitleştirme, kolaylaştırılmış protokolle birlikte, araştırmacıların biyoinformatik tanımlamadan biyolojik doğrulamaya üç ila dört gün içinde geçmelerini sağlar. Bu sistemin tasarım doğası hem araştırma laboratuvarında hem de eğitim ortamlarında faydalı olabilir.

pGR-Mavi plazmid, sonlandırıcı kuvvetin nicelleştirilmesine izin verir. 4 Yeşil floresan proteini (GFP) ve kırmızı floresan proteini (RFP) üretmek için tek bir arabinoz ile indüklenebilir promotör kullanılır. Sonlandırıcı, GFP dizisinden sonra, ancak RFP dizisinden önce plazmide klonlanır, böylece RFP proteininin transkripsiyonu durdurulur. Sonlandırıcının gücü, üretilen GFP'nin üretilen RFP'ye oranı ile belirlenir.

Vizyon ve Değişim5 raporu, Bilim, Teknoloji, Mühendislik ve Matematik (STEM) eğitiminin araştırmaya dayalı deneyimleri sınıfa dahil etmesini önerdi. 6 Ancak bu, belirli bir zaman dilimi içinde sınırlı becerilere sahip öğrenciler tarafından yapılabilecek protokollerin geliştirilmesini gerektirir. Protokol üç gün gibi kısa bir sürede tamamlanabilirken, aynı zamanda bir Kurs Araştırma Deneyimi (CRE) oluşturmak için her önemli adımın ayrı bir haftalık (2-3 saat) laboratuvar döneminde gerçekleştirilebileceği şekilde tasarlanmıştır. Bu şekilde kullanıldığında, prosedür üç ila altı hafta sürecektir ve Genetik, Hücre Biyolojisi veya Biyoinformatik alanlarında hem giriş hem de ileri düzey kurslar için uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tasarımı ve Uygun Sticky saplı Sipariş oligonükleotidler

  1. Serbestçe kullanılabilir çevrimiçi programları kullanarak genomik analiz yoluyla potansiyel rho-bağımsız sonlandırıcılar tanımlayın. 7
  2. Iki iplikçikli DNA ile çalışırken, sonlandırıcı yönü, test edilecek belirler. 7 PGR-Mavi plazmid, sadece en (ileri şerit) yön 3 '5' lige sonlandırıcılar doğrular.
    1. , Ücretsiz online yazılım kullanarak PGR-Blue test için APE, örneğin dizisi yeniden yönlendirmek için onun tersine tamamlayıcı bir alt (ters) iplik terminatör dönüştürün.
  3. oryantasyon doğru olduğu belirlendikten sonra, üst telin sonuna 5 'yapışkan sonu "5'-CGAC-3"' ekleyin. . Alt şeridinin sonuna 5 'yapışkan sonu "5'-CCGC-3"' Ekle 8 Bu o bağlanan insert uygun olarak eklenecektir sağlayacaktıryönlendirme GGA kullanılmıştır.
  4. dizileri belirlendikten sonra, ticari tek iplikli oligonükleotidler olarak sipariş.

2. Tavlama Oligonükleotidler (Dondurularak kurutulmuş DNA Sadece geçerlidir)

  1. 100 uM bir konsantrasyona nükleaz içermeyen su içinde Tek tek oligonükleotidler yeniden askıya.
  2. 1 M NaCl ve 100 mM Tris-HCI pH 7.4: 10 x dupleksleştirme tamponu sağlayın. Tavlama tamponu birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Dupleksleştirme tamponu yapılır ve oligonükleotidler yeniden süspanse edildikten sonra, tavlama 8 başlar.
  3. Her terminatör test edilecek, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne ultra saf su 16 ul ekleyin.
  4. Her mikrosantrifüj tüpüne 10x tavlama tampon 2 ul ekleyin.
  5. İstenilen terminatör gelen üst iplik oligonükleotid 1 ul (100 uM) ekleyin.
  6. İstenen terminatör arasında alt iplik oligonükleotid 1 ul (100 uM) ekleyin.
  7. kaynar su ba oluşturunsıcak bir plaka üzerinde musluk suyu ve yerin yaklaşık 400 ml içeren bir 1000 ml'lik beher kullanarak inci.
  8. float adım 2.6 mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin ve 4 dakika boyunca kaynatın. 4 dakika sonra, ısı plakası rahatsız edecek, ancak boru ayrılıp su banyosunda yavaş yavaş soğumaya O / N (18 saat) 8 yüzer. -20 ° C'de tavlanmış terminatörleri saklayın.

3. Golden Gate Meclisi (Standart Mix - Maliyet Etkin)

  1. tavlı terminatör 40 nM seyreltme yapın. tavlanmış sonlandırıcılar karışımı (100 mM) 1 ul nükleaz ücretsiz su 124 ul ekleyin.
    1. buz üzerinde 30 10,000 xg'de sn ve mağaza için santrifüj örnekleri.
  2. PCR için yeni bir tüp uygun kullanılan içine, nükleaz içermeyen su 6 ul ekleyin.
  3. 1 Ticari DNA ligaz tamponu ul [300 mM Tris-HCI (pH 7.7-7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, ve 10 mM ATP] ekleyin. Buz üzerinde sonraki tüm adımları uygulayın.
  4. eklemekPGR-Blue (35-50 ng / | il) mikrosantrifüj tüpüne, hedef plazmid 1 ul.
  5. mikrosantrifüj tüpüne 40 nM tavlanmış sonlandırıcılar 1 ul ekle.
  6. mikrosantrifüj tüpüne 0.5 ul ticari yüksek sadakat Bsal restriksiyon endonükleaz ekleyin.
  7. mikrosantrifüj tüpüne ticari DNA ligazı 0.5 ul ekle.
  8. 120 saniye boyunca 10,000 x g'de Reaksiyon karışımı santrifüjleyin. Sonra termalcycler doğrudan tüp yerleştirin.
  9. 37 ° C'de 15 dakika 1 döngü, ardından 16 ° C'de 1 dakika, ardından 37 ° C'de 1 dakika 20 döngü: PCR programı çalıştırın. Numunelerde hemen veya -20 ° C'de dondurularak saklayın. 8

4. Golden Gate Meclisi (Ticari Master Mix - Zaman Verimli)

  1. Bu 40 nM terminatör DNA konsantrasyonu sulandırır 2. adımda oluşturduğunuz sonlandırıcılar tavlı 100 mcM 1 ul nükleaz ücretsiz su 124 ul ekleyin.Yeni bu adımı gerçekleştirin, 1,5 ml'lik ependorf tüp etiketli.
  2. PCR için yeni bir tüp uygun içine, nükleaz serbest su 14 ul ekleyin. Yeni tüp buna göre etiketlenmiş olduğundan emin olun.
  3. mikrosantrifüj tüpüne Ticari Master Mix Tampon 2 ul ekleyin.
  4. mikrosantrifüj tüpüne PGR-Mavi plazmid 1 ul (35-50 ng / | il) ilave.
  5. mikrosantrifüj tüpüne 40 nM tavlanmış sonlandırıcılar 2 ul ekle.
  6. mikrosantrifüj tüpüne Ticari Master Mix 1 ul ekleyin.
  7. 120 saniye boyunca 10,000 x g'de 40 nM tüp santrifüjleyin. Sonra termalcycler doğrudan tüp yerleştirin.
  8. 55 ° C'de 15 dakika 1 döngü, ardından 37 ° C'de 60 dakika 1 döngü: PCR programı çalıştırın. Kullanım örnekleri -20 ° C 'de hemen veya dondurulması ve depolanması.

5. Dönüşüm ve Koloni Seçimi

  1. Hazırlayın 1 mM concentrat içeren Petri kapları ağar Luria Bankası (LB)ampisilin iyonu (Amp) ve arabinoz (ARB) içindeki bir 10 mM konsantrasyonu. Bu stok çözeltisi, daha sonraki kademelerde kullanım çünkü 1M L -arabinose stok çözeltisi en az 10 ml hazırlayın.
  2. Herhangi bir yüksek verimli kullanın (10 Ağustos - 10 Eylül transformant / mikrogram) kimyasal yetkili E. transformasyon için E. coli (JM109) hücreleri. En iyi sonuçlar için 9 yetkin hücre 50 ul ligasyon reaksiyonunun 3-5 ul ekle. Kimyasal yetkili hücreleri kullanırken, hücreler kullanılıyor özel dönüşüm protokolü uygulayın.
  3. steril L-şekilli "hokey sopası" kullanılarak agar plakaları önceden ısıtılmış LB (Amp / ARB) üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin yarısı (25 ul) yayıldı ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin. Nedeniyle ayrışma ampisilin hızlı oranına, 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe yoktur.
  4. görsel muayene ile renk dayalı koloni seçimi yapın. Başarılı bir ligasyonu / beyaz görünür ışıkta sarı olması ve unde yeşil floresan gerekirr mavi (450 nm) veya UV ışığı. 20 saat - Başarısız bir ligasyon 18 sonra görünür ışık altında mavi renkli bir koloni üretecek.

6. Doğrulama ve Terminator sayısallaştırılması

  1. 1 mM ampisilin ve arabinoz 10 mM 5 ml steril LB-suyu tüpleri hazırlayın. gerekli tüp sayısı, test edilen terminatörler ve kontrol ünitesinin (hücreler ampisilin direnci ile floresan değildir ve kesilmemiş PGR-Mavi plazmidi içeren hücreler) sayısına bağlıdır.
  2. Görünür ışık altında steril bir döngü kullanarak 2-3 / beyaz sarı koloniler (adım 5.4) seçin. Numuneler 37 ° C ve 16-18 saat süre ile 160 rpm'de bir çalkalama sıvılarında inkübe izin verin. fazla 24 saat süreyle bu örnekleri inkübe etmeyin.
    1. İsteğe bağlı olarak, yeterli hücre büyümesinin sağlanması için, 600 nm (OD 600) de optik hücre yoğunluğu belirlemek için bir spektrofotometre kullanmak. Genel olarak, 0.8-1.0 ~ bir OD 600 büyüme 16-18 saat sonra gözlenmiştir.
  3. kullanımsonraki adımlar için steril 96 oyuklu plaka. aseptik bir ortamda ve üç kopya halinde aşağıdaki adımları yürütün. her oyuğa steril LB + Amp / arabinoz suyu (1 mM ampisilin / 10 mM arabinoz) 199 ul ekleyin. üç ayrı kontroller için plaka üzerinde odası bulunmaktadır.
    1. Aşağıdaki üç kontrollerini kullanın: İyi (1) içeren LB + Amp / arabinoz suyu sadece ve iyi (2) (boş) dönüştürülmemiş kompetan hücreler boş olarak hizmet etmek için. ölçümü (3) sonlandırıcı gücü olmayan bir sonlandırma dizisi ile lige kesilmemiş ilk PGR ya içeren PGR-mavisi içeren hücreler (ölçümü için bir referans kontrol) dahil edilmelidir. Plaka okuyucu düzeni için Şekil 1'e bakınız.
  4. Pipet O hücre çözeltisi 1 ul / 96 oyuklu plakanın bireysel çukurlar halinde K et suları.
  5. Bir nefes kapaklı mühür plakaları ve 37 ° C'de 18-20 saat ve 160 rpm çalkalayın.
  6. Bir levha okuyucu ile okuyarak OD 600 belirler600 nm'de absorbans. Aşağıdaki gibi GFP floresan ölçün: uyarma 395 ve emisyon 509. Önlem RFP floresan şöyle: uyarma 575 ve emisyon 605. 18-20 saat sonra OD 600 yaklaşık 0,5 olmalıdır.
  7. büyüme varyasyon normalleştirmek için, denklem kullanmak: figure-protocol-1 GFP ve RFP hem.
  8. normalleşme sonra, denklem kullanılarak göreceli terminatör gücünü belirlemek figure-protocol-2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Golden Gate Meclisi (Şekil 2) kullanılarak GFP ve RFP arasında bağlandı bir sonlandırıcı ile PGR-Mavi içeren hücreleri üretecek. lige inserti ihtiva eden pozitif koloniler rengine göre seçilebilir. Görünür ışık pozitif koloniler / beyaz sarı olacaktır ve yanlış pozitif 37 ° C (Şekil 3) inkübasyon 18-20 saat sonra mavi koloniler üretecektir.

Koloni seçiminden sonra, bir plaka okuyu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde en önemli adım sıralamaya uygun oligonükleotid tasarımı önceliklidir. oligonükleotitler, uygun yapışkan uçları GGA bütünleşik hale getirilmesi olası olduğundan emin olmak için, üst ve alt iplikler hem de 5 'uçlarına eklenen olmalıdır. Ayrıca, bakan sağ olduğu soldan bakan sonlandırıcılar (alt iplikçikteki transkripsiyonu durdurmak sonlandırıcılar) yönünü değiştirmek için önemli olan GFP ve RFP ifade bakan sağ olduğundan (üst ipliği sonlandırıcı (üst iplikçikteki transkripsiyonu sonlandırır) ) yönünde. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomik ve Evrimsel Bilim ilerlemek faj Avcılar (SEA-fajlar) Programın - Yazarlar Aktif Öğretim Genom Konsorsiyumu (GCAT) ve HHMI-Fen Eğitimi İttifak ile Malcom Campbell ve Todd Eckdahl kabul etmek istiyorum.

Bu proje Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (P20RR016460) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (P20GM103429) hibe tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma hibe # IIA-1457888 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir. Ayrıca kurumsal (Ouachita Baptist Üniversitesi) fonları JD Patterson Yaz Araştırma Bursu ile sağlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pGR-Mavi PlazmidAddgene68374
pGR-PlazmidAddgene46002
AeraSeal-(Steril Levhalar)Excel ScientificBS-25Yalnızca Steril Levhalar
10x T4 DNA ligaz TamponuNEB
BsaI-HFNEBR3535SHF olmayan enzim işe yarar ancak ısıya daha az kararlıdır.
NEB Golden Gate Montaj KarışımıNEBE1600SCommerial Master Mix protokolde atıfta bulunulmuştur.
T4 DNA ligazNEBM0202S
Yuvarlak Mikrosantrifüj Yüzer RafNova Tech InternationalF18875-6401
Ampisilin sodyum tuzuSigma AldrichA9518
L-(+)-ArabinozSigma AldrichA-3256D-Arabinoz, pBAD promotörünü indüklemez
Luria Base (LB) - Et suyu, MillerSigma AldrichL1900
Luria Tabanı (LB) - Ağar, MillerSigma AldrichL2025
Tecan-Infinite M200 Plaka OkuyucuTecan
Mix & Yetkili Hücrelere Git - Suş JM109Zymo ResearchT3005Şirket tarafından önerilen dönüşüm protokolü
ApE'yi kullanın: Bir plazmid editör yazılımıhttp://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Moleküler SınıfPromegaH5121
Sodyum Klorür (Kristal/Biyolojik, Sertifikalı)Fisher ChemicalS671
Ticari Oligonükleotid senteziEntegre DNA Teknolojileri (IDT)http://www.idtdna.com/site
Mikrotest Doku Kültürü Plakaları - 96 kuyulu (Steril)Falcon35-3072
mikobakteriyofaj "Bernal13"Gen BankasıKJ510413
Nükleaz Serbest SuEntegre DNA Teknolojileri (IDT)IDT004
Steril, L-şekilli Hokey-Stick HücreYaşam Bilimleri Ürünleri6444-S1
Nano-Damla 2000c UV-Vis SpektrometresiThermo Scientific2000c
ARNold: Rho'dan bağımsız transkripsiyon sonlandırıcılarının tahmini için bir web aracı.
http://rna.igmors.u-psud.fr/

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
  2. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  3. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  4. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  5. Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
  6. Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
  7. Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
  8. Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
  9. Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
  10. Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
  11. Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
  12. Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
  13. Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Terminat r Do rulamasTerminat r G c KantifikasyonuBiyoenformatik Terminat r Tan mlamaOligon kleotid TavlanmasFloresans Oran AnaliziKoloni Rengi TaramasArabinoz nd klenebilir Promot rGFP RFP Normalizasyonu

İlgili makaleler