Yöntem makalesi

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

DOI:

10.3791/54077

⸱

2 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 2PWG Genetics Pte Ltd.

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minipiglerin sinovyal sıvısı ve kemik iliğinden izole edilen ve şırınga aspirasyonu kullanılarak noninvaziv olarak toplanan mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) kuran bir protokol sunulmuştur. Hücresel fenotipleme, hücre izolasyonu ve MSC'lerden türetilen kemik iliği ve sinovyal sıvıların in vitro kültivasyonu sonrası akış sitometrisi kullanılarak gerçekleştirildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kemik iliği ve sinovyal sıvı dahil olmak üzere çeşitli doku kaynaklarından izole edildikten sonra oluşturulmuştur. Son zamanlarda, sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerin çok soylu farklılaşma potansiyeline ve immünomodülatör özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir, bu da bu hücrelerin doku mühendisliği ve sistemik tedaviler için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu çalışma, hücre fenotiplemesi ve in vitro kültürleme için hücre yüzeyi belirteçlerini analiz etmek için minipiglerin kemik iliği ve sinovyal sıvısından türetilen MSC'lerin basit ve invaziv olmayan izolasyonu için bir protokol sunmaktadır. Cinsel olarak olgun altı aylık minipigler kullanılarak, bir kemik iliği çıkarıcı kullanılarak iliak kret kemiğinden kemik iliği çıkarıldı ve sinovyal sıvı femorotibial eklemden aspire edildi. Her iki kaynaktan da örnek toplama prosedürleri non-invazivdi. MSC'lerin hasat edilen hücre kaynaklarından etkili bir şekilde izole edilmesi ve minipiglerden stabil MSC'lerin genişletilmesi için in vitro kültür koşullarının oluşturulması ve sistemik otolog tedavilerin uygulanması için protokoller sağlanmaktadır. Hücre fenotiplemesi için, her iki hücrenin hücre yüzey belirteçleri akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi. Sonuçlarda, MSC'ler minipiglerin sinovyal sıvısından izole edildi ve sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerin kemik iliği kaynaklı MSC'lere benzer bir morfolojiye ve hücre fenotipine sahip olduğunu gösterdi. Bu nedenle, non-invaziv olarak elde edilen sinovyal sıvı, değerli bir MSC kaynağıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipotent mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) mezenkimal hücre soyları olarak sınıflandırılabilir ve MSC'ler kemik iliği, göbek kordonları, plasentalar, yağ dokusu, dermal cilt, iskelet kası, kıl folikülleri, sinovyal membranlar ve dişler gibi çeşitli doku kaynaklarından oluşturulmuş ve izole edilmiştir1-5. Şu anda, sinovyal kaynaklı MSC'lere dikkat edilmiştir, çünkü bu hücreler kemik fraksiyonu, osteoartrit ve romatoid artrit (RA) gibi eklem hastalıklarının tedavisine yardımcı olabilir ve MSC'lerin hasarlı kıkırdak veya kemikteki rejeneratif potansiyeli nedeniyle, ayrıca bağışıklık modülasyonu veya otoimmün hastalıkların tedavisine yardımcı olabilirler

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri Gyeongsang Ulusal Üniversitesi Biyomedikal Deney için hayvan Merkezi tarafından onaylanmıştır.

Hayvan Prosedür 1. Hazırlıklar

  1. kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan MKH non-invaziv toplama yetişkin dişi mini-domuzlarda hazırlayın. Anestezi ve örnek koleksiyonuna bir gün önce mini-domuzlarda klinik muayene gerçekleştirin.
    1. tam kan sayımı testleri kullanılarak vücut ısısı, solunum hızı ve kalp hızı ve domuz davranışları ve hematolojik durumların gözlenmesi için dahil fizik muayene, klinik olarak normal bir hayvan sağlayın.
      Not: klinik olarak sağlıklı mini-domuzlarda için parametre aralıkları 11 olan - so....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik İliği ve mini-domuzlarda ve sinoviyal sıvıdan alınan MSC kurulması

MSC'ler olan (Şekil 2), kemik iliği ve mini-domuzlarda eklem sinoviyal eklem izole edilmiş ve in vitro olarak genişletilmiştir. Sinoviyal sıvı şırınga aspirasyon basit ve primer hücrelerinin in vitro kültivasyonu sırasında yeterli yapışmayan hücreler elde etmek mümkündür. sinoviyal sıvı türetilmiş MSC mo.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mini-domuzlarda, kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan MSC'ler izolasyonu oluşturmak için kullanıldı. yaş, cinsiyet ve hastalık gibi çeşitli fizyolojik koşullar, ortadan kaldırmak için, izogenik arka plan vericilerden mini-domuzlarda doğru hücre kaynağı bağımlı karakterizasyonu değerlendirmek için seçildi. Domuzlar olduğu bilinmektedir anatomik, fizyolojik ve genetik olarak insanlara benzer şekilde, ve özellikle de, boyut eşlemeli organları üretebilir mini-domuzlarda; Bu nedenle, ksenonaklinden 14,15 yerini ve.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni Nesil BioGreen 21 Programı tarafından sağlanan finansal desteği minnetle kabul ediyoruz (No. PJ007969), Kırsal Kalkınma İdaresi ve Ulusal Araştırma Vakfı (hibe no. NRF-2015R1D1A1A01056639) Kore Cumhuriyeti'nin.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gelişmiş Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı (ADMEM)Gibco12491-023MSC kültür ortamı
Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)Gibco14190-144Hücre yıkama ortamı, Ca2+/Mg2+
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco16000-044MSC ortamının bileşeni
GlutamaxGibco35050-061MSC ortamının bileşeni
Penisilin / streptomisinGibco10378-016MSC ortamının bileşeni
Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)SimgaF0291MSC'lerin orta
bileşeni Sığır serum albümininin (BSA)SigmaA6003MSC'lerin orta
bileşeni Tripsin-EDTAGibco25200-072Hücre ayrışma reaktifi 
β-merkaptoetanolSigmaM7522MSC'lerin orta
İzotip antikoruBD PharmingenBD 550616İzotip Kontrolü
CD29 antikoruBD PharmingenBD 552369Integrin beta-1 MSC işaretleyicisi
CD44 antikoruBD PharmingenBD 553133Hücre yüzeyi glikoproteini MSC işaretleyici
CD45 antikoruBD PharmingenBD 340664Hematopoetik kök hücre belirteci
CD34 antikoruBD PharmingenBD 555821Hematopoetik kök hücre belirteci
CD90 antikoruBD PharmingenBD 555595Thy-1 membran glikoprotein MSC belirteci
MHC Sınıf II antikoruSanta CruzSC-32247Antijen sunan hücreler belirteci
Vimentin antikoruSigmaSigma-S6389Tip III ara filament MSC işaretleyicisi
Alkalin fosfatazPromegaS38415-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP) ve nitro mavi tetrazolyum (NBT)
GE Healthcare17-1440-02Yoğunluk gradyan santrifüjleme
Hücre süzgeciBD Falcon35234040 & M Naylon Hücre Süzgeci
15 ml polistiren konik tüpBD Falcon351095Numune toplama ve hücre izolasyonu
35 mm tabaklarNunc153066Hücre kültürü kabı
Kemik iliği çıkarıcıGmbH Medizintechnologie, Almanya1145-1W010TrokaBone, 3.0 x 100 mm
Hematokrit odasıMarinfeld640130Hücre sayma odası
AtropinJeil Pharmaceutical Co, Güney KoreAtropin sülfat
Hidrat AsepromazinSamu Median, Güney KoreAnestezik öncesi yatıştırıcı ve antiemetik ilaç
MedetomidinPfizerAnestezik ve analjezik ilaç
EnrofloksasinBayer Healthcare, AlmanyaAntibiyotikler
Meloksikam, Anti-enflamatuar ve analjezik ilaç
IsofluraneHana pharm, Güney Koreİnhalasyon anestezisi
Povidone iyot ve nbsp;Korea Pharma, Güney KoreSterilizasyon ajanı
EthanolSigmaE7023Sterilizasyon ajanı
HeparinSigmaH3393Anti-pıhtılaştırıcı ajan
FormaldehitSigmaF8775Hücre fiksasyon ajanı
Oftalmolojik merhem  PfizerOksitetrasiklin HCl
Sirkülasyonlu su battaniyesiGaymar IndustriesAnestezi sırasında ve sonrasında ısıtma sistemi
Cilt zımbalayıcıCovidien, ABDSütür cilt kapanması
CO2 İnkübatörThermo Forma3111Hücre kültürü Ekipmanları
Akış sitometresiBD BiosciencesHücre analizörü
MinipigPWG Genetics Korea, Ltd.T tipiMinyatür domuz
karışımıFicoll-Paque Veterinerlik Tıbbı Üzerinde Arjantin Polimiksin B sülfatlı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
  2. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mesenchymal Stem CellsSynovial Fluid MSCsBone Marrow MSCsMinipig MSC IsolationCell Surface MarkersFlow CytometryDensity CentrifugationIn Vitro CultureAutologous TherapyJoint Disease Models

İlgili makaleler