Yöntem makalesi

Antik Biyolojik Topluluklar barındırmıştır İç Araştırma Dondurulmuş Çekirdek dış bölümünden Eksojen Malzeme Kaldırma

8.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54091

⸱

3 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

Bu makalede

Özet

Kriosfer geçmiş çevre koşullarında kalıcı korunmuş organizmalar erişim imkanı sunmaktadır. Bir protokol toplamak ve toprak ve buz permafrost çekirdeklerini dekontaminasyonunda sunulmuştur. Eksojen kolonilerin ve DNA yokluğu tespit mikroorganizmalar sondaj veya işleme malzeme yerine, kontaminasyonu temsil ettiğini göstermektedir.

Özet

Kriyosfer, geçmiş çevresel koşullar altında varlığını sürdüren korunmuş organizmalara erişim sağlar. Aslında, bu donmuş materyaller geniş zaman dilimleri boyunca koşulları yansıtabilir ve içinde bulunan biyolojik materyallerin araştırılması eski ortamlar hakkında fikir verebilir. Bu ekosistemleri uygun şekilde analiz etmek ve donmuş topraklardan ve buzdan anlamlı biyolojik bilgiler elde etmek için, donmuş numunelerin uygun şekilde toplanması ve işlenmesi gereklidir. Bu, özellikle mikrobiyal ve DNA analizleri için kritiktir, çünkü mevcut topluluklar modern olanlardan çok benzersiz bir şekilde farklı olabilir. Burada, donmuş çekirdekleri başarılı bir şekilde toplamak ve dekontamine etmek için bir protokol sunulmaktadır. Hem dış yüzeyi doping yapmak için kullanılan kolonilerin hem de eksojen DNA'nın yokluğu, donmuş çekirdekleri başarılı bir şekilde dekontamine ettiğimizi ve tespit edilen mikroorganizmaların, çekirdeklerin delinmesinden veya işlenmesinden kaynaklanan kontaminasyondan ziyade malzemeden kaynaklandığını göstermektedir.

Giriş

Krayosfer (örneğin, permafrost topraklar, buz özellikleri, buzul kar, firn ve buz) Son çevresel koşullar altında devam organizmaların ne tür bir bakış sunuyor. Bu yüzeyler birikimi beri dondurulmuş korunmuş eski binlerce yıl, kendi mikrobiyal topluluklar, yüzlerce onlarca olabilir çünkü, antik çevre koşullarını yansıtacak. uygun bu ekosistemleri analiz ve donmuş örneklerin donmuş toprak ve buz, uygun toplama ve işleme anlamlı biyolojik bilgileri ayıklamak için gereklidir. 21. yüzyıl için iklim projeksiyonları Arktik ve alt Kutup bölgelerine 1 belirgin bir ısınma potansiyeli işaret gibi bu son derece önemlidir. Özellikle, İç Alaska ve Grönland yaklaşık 5 ° C ve sırasıyla 2100 2,3 ile 7 ° C, sıcak bekleniyor. Bu önemli ölçüde toprak ve su mikrobiyal topluluklar ve bu nedenle, ilgili etki beklenirbiojeokimyasal süreçler. Sıcak sıcaklıklar ve değişen yağış rejimi, potansiyel bir kalın, mevsimsel çözülmüş (aktif) yol açan birçok alanda 2-5 permafrost bozulmasını 6,7, dondurulmuş toprakların çözülme ve gibi büyük buz kütlelerinin erime katman başlatması bekleniyor zemin buz, buz dilimleri ve segregasyon buz 8. Bu dramatik bu ekosistemlerde bitki ve hayvan biyolojik çeşitlilik yanında biyokimyasal özelliklerini değiştirmek istiyorum.

Buzul buz ve sinjenetik permafrost sediment ve buz özellikleri kimyasal ve özellikleri oluşan zamanda orada yaşamış neler temsil eden bir çevrenin biyolojik kanıtlar tuzak var. Örneğin, İç Alaska, Illinoisan ve Wisconsin hem sürekli donmuş mevcut olan yaşlı ve özellikle bu permafrost mevcut IMPA biyolojik ve jeokimyasal kanıtlar içeriyor (YBP) önce 150.000 yıl modern kalma eşsiz yerleri sağlarbiyolojik çeşitlilik üzerindeki geçmiş iklim değişikliklerinin ct. Sonuç olarak, bu çökeltiler binlerce yıl boyunca biyojeokimyası ve biyolojik çeşitliliğin bir kaydını sağlar. Alan düşük sedimantasyon oranları vardır ve glaciated olmamıştı yana, bozulmamış numuneler dikey tünellerde toprak profili veya yatay sondaj içine toplama ve analizi, her iki sondaj için erişilebilir. Daha da önemlisi, geniş kayıtlar özellikle bu bölgede 9-14 içinde permafrost benzersiz biyokimyasal özelliklerini vurgulamak olduğunu mevcuttur. Özellikle, DNA analizinin uygulama hem kaybolmamış ve antik buz ve donmuş toprak örneklerinde biyolojik çeşitliliğin varlığını ve kapsamını tahmin etmek için belirli organizmalar tarafından işgal antik çevre şartlarının bağlantı ve habitat keşif sağlar.

Her çalışma bir differe kullanılan rağmen Önceki çalışmalar, memeliler, bitki ve YBP 11, 15-19 50k kalma örneklerinden mikroorganizmalar üzerinde iklimsel etkilerin belirlediknt metodoloji toplamak ve sürekli donmuş veya buz çekirdeği dekontamine. Belirli metodoloji yabancı nükleik asitler ayrıca örneklerden elenen olup olmadığını açıklığa kavuşturmak etmedi ama bazı durumlarda, sondaj çekirdek, 16, 20-21 sterilize edildi. Diğer çalışmalarda, bakteriyel 22 dekontaminasyon işlemleri etkinliğini ölçmek için kullanılmıştır 15 (örneğin, Serratia) ve flüoresan mikro küreler izole eder.

Bu deney geri yaklaşık 40k YBP kalma permafrost örneklerinden mikrobiyal topluluklar araştıran daha geniş bir çalışmanın parçası oldu. Çalışmanın bu bölümünün özel hedefi başarıyla buz ve donmuş toprak çekirdeklerini dekontamine oldu. Bildiğimiz kadarıyla, herhangi bir metodoloji dondurulmuş çekirdek dış kısmından yabancı nükleik asitlerin ve ilgili nükleazlar ortadan kaldırmak için tasarlanmış çözeltilerin kullanımı entegre edilmiştir. Bu bu çözümler, piyasada yaygın olmasına rağmen biry moleküler deneyler için laboratuvar araçlarını temizlemek için kullanılan.

Çekirdekler dekontamine Bir kez genomik DNA, Griffiths ve ark., 23. ve towe ve ark., 24 ile geliştirilmiş protokollerin kullanılması ile ekstre bir spektrofotometre kullanılarak ölçülür ve reaksiyon başına 20 ng elde edilecek şekilde steril DNA içermeyen su ile seyreltildi. 600 saniye, 95 ° C'de 45 döngü izledi: Bakteriyel 16S rRNA gen rRNA genleri primerler Arch 349F ve kemer 806R ve aşağıdaki koşullar altında TM Arch 516F 26 sondası ile amplifiye edilmiştir primerleri 331F ve 797R ile amplifiye edilir ve BacTaq 25 ve arkeal 16S prob edilmiştir 30 saniye, 60 saniye boyunca 57 ° C, ve 30 saniye süreyle 40 ° C'de son uzatma ile 25 saniye için 72 ° C, 95 ° C. Tüm qPCR reaksiyonlar çift kopya halinde gerçekleştirilmiştir. 20 ul reaksiyon hacmi 20 ng DNA, primerler 10 uM, prob 5 um ve qPCR Reaksiyon karışımı 10 ul dahildir. Standartlar foPseudomonas sırasıyla fluorescens ve halobakteriyum salinarumun bakteri ve arke qPCR genomik DNA kullanılarak hazırlanmıştır r. Her iki log fazına kadar büyütülmüştür. Plaka sayımları gerçekleştirilmiştir ve DNA izole edildi. Genomik DNA, bir varsayımı ve genom başına 16S rRNA geninin altı kopyasını H. bir spektrofotometre ile nicelleştirilmiştir salinarım ve P. sırasıyla 27-28, fluorescens. bakteriyel ve arke genlerin kopya sayısı standart eğri baz alınarak hesaplanmıştır, tedaviler arasındaki eşitsiz varyanslar için hesap log-dönüştürülmüş ve ANOVA ile değerlendirildi.

Topluluk kompozisyon 16S rRNA geni sıralanması akış hücreleri ve köprü büyütme teknolojilerini kullanarak ve 'mikrobiyal ekoloji içine nicel anlayışlar' (QIIME) 29 ile toplulukları analiz edilerek belirlenmiştir. İleri ve ters okur birbirine katıldı ve daha sonra diziler, filtre endeksli edildive yüksek kaliteli temsilcileri bir referans veri tabanı ile dizi uyum yoluyla de novo operasyonel taksonomik birimler (OTU) atama için seçildi. Hizalanmış dizilerin taksonomik atama için ayrı bir referans veri tabanı ile karşılaştırılmıştır. Bir filum düzeyinde OTU tablo genel toplum kompozisyonunu belirlemek için oluşturuldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Ekipman Hazırlama ve Permafrost Core Collection

  1. Ekipman hazırlama ve saha örnek toplama ve saklama dişli
    1. varil üst içine sürücü adaptörünü takarak ve yerine kilitlemek için kolu çevirerek numune toplama için burgu birleştirin. Sürücü adaptöre üzerine adaptör tüpü pin ve adaptör tüpüne motoru pin. varil üzerinde kesicileri takın.
    2. örnekleri herhangi bir bulaşmayı azaltmak için hafif hizmet takım elbise, nitril eldiven ve maske takın. Kulak koruma ve Permafrost Tüneli (Şekil 1) girdikten sonra güvenlik için sert bir şapka giymek.
    3. Tünel girin ve örnekleri (Şekil 1B) toplamak için bir yer seçin.
      Not: dikey veya yatay sondaj yeri için, malzeme (örneğin buz veya permafrost) dondurulur dair kanıt var bilinen bir alanı seçmek, bilinen hiçbir büyük kök sistemleri vardır ve hiçbir bilinen çakıl yoktur. Hepsini silBir örnek toplama önce alandan bitki materyali yaşayan. dikey veya yatay sondaj ise nispeten düz ve burgu ile erişilebilen bir alan seçin.
    4. % 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile sterilize edilmiş bir plastik malzeme ile zemin katmanlama bir iş istasyonu hazırlayın.
    5. bu burgu uzaklaştırıldıkça çekirdekleri tutmak için bir oluk sağlamak için boyuna iş istasyonunda yarı 10 cm çapında, polivinil klorür (PVC) boru kesme yerleştirin. % 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile PVC boru dekontamine.
    6. iş istasyonu yakınında,% 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile püskürtülerek burgu dekontamine. Bir silme ile burgu çözümler çıkarın.
  2. Buz ve permafrost çekirdek toplama ve depolama
    1. örnek duvarın bir alanı seçin (1.2.1 bakınızNot).
    2. % 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile silerek dondurulmuş duvar alanının yaklaşık 10 cm çapında dekontamine.
    3. Bu örnek alan dik olacak şekilde ilgi alanına dekontamine burgu yükseltmek ve duvara (Şekil 1C, D) temizlenmiş yüzüne sondaj başlar.
    4. Dikkatle numune toplama alanından burgu çıkarın. motordan burgu ayırın ve temiz bir çalışma istasyonu steril PVC boru üzerinde burgu yerleştirin. Dikkatle dondurulmuş çekirdekler steril PVC boru (Şekil 1E) üzerine kaydırın şekilde burgu eğin.
    5. % 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile eldiven dekontamine.
    6. Steril eldiven ile buz ve donmuş toprak çekirdeği Pick up ve steril torbalar içine koyun.
    7. sevk veya işlenmiş kadar bir soğutucu ya da soğuk bir odada çekirdeği koyun.
    8. Sh0 ° C'nin altındaki bir ısıda tutmak için kuru buz kullanılarak, dondurulmuş çekirdek ip.
    9. Hemen -80 ° C 'de çekirdek saklayın.

2. Permafrost ve Buz Çekirdekli İşlem

  1. Malzemenin hazırlanması
    1. 4 saat 450 ° C'de bir fırın içinde pişirme ile, steril, nükleik asit, serbest ağır hizmet alüminyum varak, metal raflar, cam, metal forseps, ve cam yünü hazırlayın. kullanılıncaya kadar bu malzemeleri bir kenara koyun.
    2. 0.22 um'lik bir filtreden çözüm geçirilerek% 95 etanol ve ultra saf su sterilize edin.
    3. 4 ° C 'de, -20 ° C ve su saklayın etanol çözeltisi.
    4. % 70 etanol, DNA, dekontaminasyon çözeltisi ve RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile püskürtme eder ve her bir çözelti sonra silinerek plastik bir cetvel sterilize edin.
  2. Bakteriyel kültür hazırlanması
    1. Serratia marcescens'i büyümeye suyu ve tabak hazırlayın.
      1. suyu için 5 gr deneyin birleştirmekptone, 1 g glikoz, 5 g maya ekstresi ve 1 g potasyum fosfat dibazik, ve daha sonra damıtılmış su ilave, plakaları yapmak yukarıdaki karışıma agar 15 g eklemek için 1 L. ulaşmaya. suyu ve plakalar, 15 dakika boyunca 121 ° C 'de 7 ve otoklava pH ayarlamak.
    2. 8 g sodyum klorür, potasyum klorür, 0.2 g sodyum fosfat dibazik 1.44 g ve 0.24 g potasyum fosfat monobazik birleştirerek 1x fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) hazırlayın ve 800 ml ulaşmak için damıtılmış su ilave edilir. 7.4 pH ayarlamak ve 15 dakika boyunca 121 ° C 'de 1 L Otoklav ulaşmak için damıtılmış su ilave edilir.
    3. S. daldırılarak steril bir çerçevenin bulunduğu suyu inoküle Daha önce, -80 ° C'de dondurulmuş olarak saklandı marcescens kültürü. aseptik koşullar altında, seri seyreltilmiş el PBS 9 ml kültürün 1 ml'sinin eklenmesi ve kültür çözeltisi ters çevirin. PBS 9 ml, bu seyreltme 1 ml ilave edilir ve el solüsyonu ters. 10 -9 Dilu kadar sekiz kez daha tekrarlayıntion ulaşılır.
    4. Plaka üzerine suyu 1 ml dağıtmak ve bir hücre dağıtıcı ile yayarak agar plakları üzerine 10 -6, 10 -7 10 -8 ve 10 -9 çözüm yayıldı. seyreltme başına üç nüsha olarak bunu yapın. 4 ° C'de orijinal kültür saklayın.
    5. 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Özgün kültür içindeki hücrelerin sayısını hesaplamak için koloni sayısı. Not: Orijinal kültüründe kolonilerin sayısı bakterilerin büyüme hızına bağlı olacaktır.
    6. Pipetleyin steril 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine orijinal kültürün 250 ul. Önceki adımda koloni sayımı ile tespit edildiği üzere yaklaşık olarak 10 9 hücre / ml elde etmek için 1 x PBS yeterli hacim ilave edilerek, orijinal kültür seyreltilir. 10 dakika süre ile 2500 x g 'de santrifüj ile mikrosantrifüj tüpü içinde hücreleri Pelet.
      Not: 1 x PBS hacmi bakterilerin büyüme hızına bağlı olarak değişir.
    7. steril biohood, Suyu kapalı pipetlemeyin ve PBS tamponu 1x 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. kullanılana kadar 4 ° C ya da yaklaşık iki ay saklayın.
    8. Işlem günü, S. seyreltik Orijinal S. 1 ml ilave adım 2.2.7 marcescens kültürü 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne PBS tampon 1x 39 ml marcescens kültürü.
  3. çekirdekli işlemci ve koruma dişli soğuk oda yer hazırlayın
    1. % 1 çamaşır suyu çözeltisi ile soğuk oda, temiz duvarlar, zeminler ve metal bir masaya soğutma önce.
    2. Yaklaşık soğuk oda ayarlanan sıcaklık -11 ° C.
    3. soğuk oda istenilen sıcaklığa ulaştığında, soğuk oda ve örnekleri herhangi bir bulaşmayı azaltmak için hafif hizmet takım elbise, nitril eldiven ve maske.
      Not: İki düzgün giyimli kişiler bu işlem için gereklidir.
    4. Steril malzeme getirmek (örneğin, alüminyum folyo, metal raflar, cam, tepsi, S. marcescens kültür ve miSteril masaya soğuk oda ve yerine crotome bıçak) ve örnekleri.
  4. Bir soğuk oda tesisinde sürekli donmuş ve buz çekirdekli işlemci
    1. bir alüminyum folyo, steril, nükleik asit serbest kağıda bir sürekli donmuş çekirdeği yerleştirin.
    2. Hafif S. seyreltik kültürü ile çekirdeğin dışında inoküle marcescens steril bir köpük fişi (Şekil 2B) elde edilmiştir.
    3. bir tepsi oturur steril metal raf üzerinde çekirdek yerleştirin.
    4. % 70 etanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile çelik mikrotom bıçak sterilize edin.
    5. % 70 etanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile Bireysel temiz bir nitril eldiven ve tepsinin üzerinde 45 ° 'lik açıyla çekirdek tutun.
    6. Bireysel B nazikçe Bireysel A Her scrape sonra çekirdek (döner iken steril bıçak kullanarak, uçları dahil olmak üzere tüm çekirdek dışına yaklaşık 5 mm, kazıma var Şekiller 2C ve 3A, B). gerektiği gibi% 70 etanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile bıçak silin.
    7. Bireysel bir çözüm dökülür olarak çekirdek (Şekil 2D, 3C) döner iken Bireysel B, dikkatli ve hızlı bir şekilde çekirdek üzerinde filtre ile sterilize% 95 etanol dökün var.
    8. Bireysel B hemen filtre ile sterilize suyla durulayın çekirdek var.
    9. yeni bir steril metal raf ile tepsiye kullanılan metal raf değiştirin.
    10. Bireysel bir tepsiye üzerinde 45 ° 'lik açıyla çekirdek% 70 etanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile onun nitril eldiven temiz tutun var.
    11. Bireysel B DNA dekontaminasyon solüsyonu ile tüm çekirdek sprey var.
    12. Bireysel B hemen filtre ile sterilize suyla durulayın çekirdek var.
    13. Bireysel B RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile tüm çekirdek sprey var.
    14. individu varal B hemen filtre ile sterilize suyla çekirdek durulayın.
    15. bir alüminyum folyo, steril kağıda çekirdek yerleştirin ve hafifçe sarın.
  5. Çözülme dış çekirdek
    1. laminer akışı ile steril biohood steril bir cam çanak içinde steril bir metal raf yerleştirin.
    2. S. özgü iki agar tabak koyun Steril raf altındaki cam tabak içinde marcescens çekirdek (Şekil 2E) sıvıyı toplamak için.
    3. Steril metal raf üzerinde çekirdek yerleştirin.
    4. (Ortalama olarak bu, yaklaşık 10 dakika içinde meydana gelir) göbeğin dış yüzeyi yaklaşık olarak 2-5 mm, 23 ° C'de çözülme izin verin. yaklaşık 90 °, her 2 dakika çekirdek getirin.
    5. Steril forseps ve steril cam yünü kullanılarak çekirdeğe tüm yüzeyini çubukla ve S. iki agar plakaları özel aşılamak levha yüzeyi üzerine bu malzemelerin sürme ile marcescens. Orijinal kültürü ile iki yeni plakaları aşılamak dışında dope için kullanılanSoğuk odanın düşük sıcaklıklara maruz kaldı çekirdek.
    6. yakın steril bir cetvel yerleştirerek, ancak çekirdek dokunmadan değil tarafından çözülmüş silindir çekirdeğinin dış boyutlarını ölçün.
    7. Büyük steril torbaya çekirdek yerleştirin ve -80 ° C'de saklayın.
  6. büyüme için kontrol edin
    1. bir hafta boyunca, 23 ° C'de agar inkübe edin.
    2. S. büyümesi için agar inceleyin marcescens kolonileri.
      1. plaka üzerinde hiçbir görünür koloniler varsa, 2.5.3 adıma devam edin.
      2. koloniler plaka üzerinde görünüyorsa, bölüm 2 "Permafrost ve buz çekirdekli işlemci" adım 2.1.1 itibaren tekrarlayın.
    3. dondurucu çekirdek elde ve aseptik olarak steril torbasına aktarın.
    4. bütün çekirdek çözülme için yaklaşık 24-48 saat boyunca 4 ° C 'de, steril bir torbaya çekirdek saklayın.

3. Buz Çekirdek ve Permafrost gelen Nükleik Asit Eldesi için alt örnek alın

  1. buz çekirdeklerinden nükleik asit ekstraksiyon
    1. Hafifçe torbayı (Şekil 2G) ajitasyon buz çekirdeğinden çözülmüş malzemeyi karıştırın.
    2. mikroorganizmaları toplamak için vakum altında 0.22 um filtre ile steril bir kap içine çözülmüş malzeme dökülür.
    3. Aseptik steril forseps ile filtreyi kaldırmak ve steril 2 ml seramik boncuk tüp (1.4 mm) yerleştirin.
    4. -80 ° C'de filtre saklayın.
  2. sürekli donmuş çekirdeklerinden nükleik asit ekstraksiyon
    1. hafifçe çanta yoğurma ile permafrost çekirdeğinden çözülmüş malzemeyi karıştırın.
    2. permafrost iyice karıştırılır edildikten sonra, steril bir scoopula yaklaşık 0.5 gr toplu toprak altörneğini elde etmek ve bir denge üzerinde dik oturur bir darası steril 2 ml seramik boncuk vidalı kapaklı tüp (1.4 mm) yerleştirin.
    3. -80 ° C'de saklayın alınan örnekler.
    4. Numunelerin gravimetrik su içeriğini elde.
      1. Bir steril ile permafrost 10 g ölçünBir denge üzerinde bir daralı teneke e scoopula ve yer. Permafrost ve kalay ıslak kütlenin ölçün.
      2. 24 saat boyunca 105 ° C'de ayarlanmış bir fırında permafrost inkübe edin. Permafrost ve kalay kuru kitle ölçün.
      3. sürekli donmuş kuru kütleye göre sürekli donmuş ıslak kütle çıkartılarak ve sürekli donmuş kuru kütleye bölünmesiyle Gravimetrik su miktarı hesaplanır.
    5. -80 ° C'de saklayın permafrost.

4. Permafrost ve Buz Çekirdek nükleik asitlerin Özü

  1. Malzeme hazırlık
    1. 37 ° C, ve otoklav O / N kuluçkalanması,% 0.1 dietilpirokarbonat (DEPC) ile muamele etmek suretiyle çözüm tutmak için sarı şişeleri hazırlayın.
    2. 240 mM potasyum fosfat tampon çözeltisi hazırlayın. potasyum fosfat monobazik 2. 5 g ve potasyum fosfat dibazik, 38.7 g ekleyin. steril su ekleyerek 500 ml son ses seviyesini ayarlayın.
    3. heksadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB) ekstraksiyon tampon ile hazırlayınfer 80 mi su içinde 4.1 g sodyum klorür eritilmesi ve ısıtılarak ve karıştırılarak yavaş yavaş 10 g CTAB ekleyerek. Steril su ilave edilerek, 100 ml nihai hacim ayarlayın.
    4. fosfat tampon çözeltisi eşit hacimlerde ekleyin ve CTAB tamponu ve filtre, bir 0.22 mikron filtreyle sterilize edin. Oda sıcaklığında alüminyum folyo ve mağaza ile şişe kapağı.
    5. 9.35 g NaCI, 100 ml steril suyun bir araya getirilmesiyle 1.6 M sodyum klorür çözeltisi (NaCl) hazırlayın. 1.6 M NaCI çözeltisi ve filtre ile sterilize 10 g polietilen glikol 8000 ekleyin. 4 ° C'de saklayın.
  2. Nükleik asit Griffiths ve diğerleri değiştirilmiş bir versiyonuna göre ekstraksiyon. 22 ve towe ve ark., 23
    1. hafif hizmet takım elbise, nitril eldiven ve maske takın. Temiz laboratuar alanı ve% 70 etanol, DNA, dekontaminasyon çözeltisi ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu pipetler.
    2. Seramik boncuk vida ca 2 ml (buz çekirdeği ya da permafrost toprak örneğinden filtreyi) alt örnek kaldırOda sıcaklığında -80 ° C derin dondurucuda ve çözülme gelen p tüp.
    3. kısaca hekzadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB) ekstraksiyon tamponu ve vorteks 0.5 ml ekleyin.
    4. (25: 24: 1), fenol-kloroform-izoamil alkol, 0.5 ml ilave edilir (pH 8) ve vortexer bir düz panel adaptörü kullanarak 10 dakika boyunca yatay olarak tüpleri çalkalanır.
    5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,100 x g'de Boncuk dayak, santrifüj tüpleri et.
    6. yeni bir steril 1.5 ml'lik tübe Sulu tabaka uzaklaştırılır ve kloroform-izoamil alkol eşit hacimde karışımı (24: 1). 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,100 x g'de santrifüjleyin.
    7. yeni bir steril 1.5 ml'lik tübe Sulu tabaka uzaklaştırılır ve% 30 polietilen glikol 8000 ve 1.6 M NaCI, iki hacim ekleyin. 4 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
    8. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,100 x g'de santrifüjleyin.
    9. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,100 xg'de buz soğukluğundaki% 70 etanol ve santrifüj yaklaşık 500 ul, nükleik asit pelet yıkayın.
    10. 2 saat süre ile, steril bir biohood hava kuru topak. 50 ul DNaz / RNaz içermeyen TE tamponu içinde süspanse (pH 8.0). DNA, örneğin, PCR ve qPCR olarak aşağı doğru uygulama için hazır hale gelir.
    11. spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirleyin.
    12. reaksiyon başına 20 ng elde edilecek şekilde steril DNA içermeyen su ile DNA seyreltilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

sunulan yöntem sürekli donmuş buzul buz çeşitli Cryosphere ortamlarda toplanan donmuş örnekleri dekontamine için kullanılabilir. Burada, özellikle Mühendislik Araştırma ve Geliştirme Merkezi'nden toplanan buz ve donmuş toprak örneklerinden toplanan verileri sunmak - Fox, AK bulunan Soğuk Bölgeler Araştırma ve Mühendislik Laboratuvarı (ERDC-CRREL) Permafrost Tünel (Şekil 1A ve 1B). Permafrost Tünel Goldstream vadinin yan içine yaklaşık 110 metre uzana...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kriosfer geçmiş çevre koşullarında kalıcı korunmuş organizmalar erişim imkanı sunmaktadır. Iyileşti takson tam tarihi topluluğunu temsil olmayabilir ama, buzul buz ve donmuş toprak örneklerinin analizi elde olanlar seçme süreler 15-16 hakkında değerli tarihi bilgiler elde edebilirsiniz. Örneğin, anlamlı biyolojik bilgi çözülme 33 bir sonucu olarak karbon bisiklet süreçlerini araştıran buz Grönland buz tabakasının 20 anaerobik aktivite araştıran çalışmaların ve sürekli donmuş çalışmalar ç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, ABD Ordusu Mühendis Araştırma ve Geliştirme Merkezi, Temel Araştırma Programı Ofisi aracılığıyla finanse edildi. Bu bilgilerin yayınlanması için izin Mühendisler Şefi tarafından verilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BurguKar, Buz ve Permafrost Araştırma Kuruluşu (SIPRE), Fairbanks, AK
%70 İzopropanolWalmart551116880
%95 Etil Alkol (denatüre) Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
DNA dekontaminasyon solüsyonu, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
RNase dekontaminasyon solüsyonu, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7002
Hafif Hizmet Takım ElbiseKimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
Nitril EldivenFisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
Antiviral MaskelerCurad, WalgreensCUR3845
Steril Numune Torbaları Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
Çelik Mikrotom Bıçağı B-Sharp Microknife, Wake Forest, CRREL
Metal
μ m FiltreCorning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Biyogüvenlik BaşlığıNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
Petri KabıFisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TriptonAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC Agar 181- GlikozFisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC Agar 181- Maya ÖzüFisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotasyum FosfatJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco, Kıvılcımlar, MD214530
NanoDrop 2000 UV Vis SpektrofotometreThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
em>Halobacterium salinarumAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC), Manassas, VA
em>Pseudomonas fluorescensAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC), Manassas, VA
Mikrobiyal DNA İzolasyon KitiMoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
Kulak KorumasıElvexEP-201
Baret
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
Cam YünüPyrex430330
Cetvel
Tartı Kalay Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
Sodyum klorürSigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
Potasyum klorürJT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Potasyum fosfat, monobazikJT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Potasyum fosfat, dibazikJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
Sodyum fosfat dibazik, susuzFisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
50 ml Santrifüj TüpleriCorning, Corning, NY4558
2 ml Mikrosantrifüj TüpleriMoBio Laboratuvarları, Carlsbad, CA1200-250-T
2 ml Seramik Boncuk Tüpleri (1.4  mm)MoBio Laboratuvarları, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Dietilpirokarbonat (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
Hekzadesiltrimetilamonyabromür (CTAB)  Acros Organics, NJ22716-5000
Polietilen glikol 8000  Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
Fenol-kloroform-izoamil alkol (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
SantrifüjEppendorf, Hauppauge, NY5417R
Kloroform-izoamil alkol (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE TamponAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipetlerRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200 ve 1.000 &mikro; l pipetler
Pipet uçlarıRainin, Woburn, MARainin LTS önceden sterilize edilmiş, düşük tutmalı, filtrelenmiş uçlar, 10, 20, 200, 1.000  &mikro; l
VortexorScientific Industries, Bohemya, NYG-560
Vorteks AdaptörüMoBio Laboratuvarları, Carlsbad, CA13000-V1
Şeffaf ŞişeCorning, Corning, NYC1395500
Amber ŞişeCorning, Corning, NYC5135250
Şişe Üstü Filtreler, 0.22  &mikro; mCorning, Corning, NY430513
60 ml ŞırıngaBecton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJBD 309653
Millex Şırınga filtreleri, 0.22 & mu; mEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB
%70 EtanolFisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500seyreltilmiş ve filtre sterilize edilmiş
Isotemp 100 L FırınFisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
Hücre YayıcıFisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
Tek Kullanımlık Aşılama DöngüleriFisher Bilimsel, Pittsburgh, PA22-363-602
, Hannover, NH'de İmalat Edilen NC Raf Tepsi Kullanışlı Boya Ürünleri, Chanhassen, MN 7500-CC Alüminyum Folyo Western Plastics, Temecula, CA 500 ml Şişe, 0.22 <<

Kaynaklar

  1. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
  2. Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
  3. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
  4. Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
  5. Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
  6. Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
  7. Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
  8. Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
  9. Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020(2006).
  10. Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603(2007).
  11. Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
  12. Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
  13. Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
  14. Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
  15. Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
  16. Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
  17. Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
  18. Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
  19. Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
  20. Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
  21. Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
  22. Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
  23. Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
  24. Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
  25. Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
  26. Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
  27. Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
  28. Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647(2012).
  29. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  30. Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
  31. Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
  32. Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
  33. Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
  34. Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042(2010).
  35. Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
  36. Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
  37. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  38. Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
  39. Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Donmu ekirdek DekontaminasyonuKriyosfer AnaliziPermafrost rneklemesiBuz ekirde i lemeSteril TeknikDNA Kontaminasyon KontrolSerratia marcescens TespitiSo uk Oda ProtokolMikrobiyal Topluluk Analizi16S rRNA Dizileme

İlgili makaleler