Biz kurbağa ve semender ve oosit yaşayan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozomları izole etmek için basit teknikleri sunuyoruz. Biz faz kontrast ya da diferansiyel girişim kontrast ve nasıl situ hibridizasyon veya immunofluorescent boyama floresan için bunları düzeltmek için tarafından "canlı" bu kromozom gözlemlemek açıklanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kurbağalar ve Salamanderler Yaşayan Oositlerinin Dev Lampbrush Kromozomların İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Biz kurbağa ve semender ve oosit ya da unlaid yumurta, bulunan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozom (LBCs) çalışmak için yöntemler açıklanmaktadır. Bağımsız LBCs uzunluğu en fazla 1 mm olabilir ve çapı 0.5 mm, dev bir çekirdekte kendisini bulunur. kromozomların büyük boyutlu ışık optik mikroskop ile aktif genlerin eşsiz gözlemleri izin, ama aynı zamanda özel teknikler, çekirdeğin izole nükleer zarfı kaldırarak ve bir mikroskop lamı üzerine kromozom yaymak için gereklidir. Ayrıca, germinal vesicle (GV) olarak adlandırılan oosit çekirdeği, çekirdek aktin kısmi jelleşme izin verir ve LBCs hassas yapısını koruyan bir ortamda izole edilir. Bu adım kuyumcuya forseps kullanarak bir mikroskop altında elle yapılır. Sonraki nükleer zarf kuyumcu forseps ile tekrar el kaldırılır. çekirdek içindeki hızlı bir şekilde dağılma, bir ortama transfer ediliraktin jel RBDÖ ve hasarsız LBCs bir mikroskop lamı üzerine yerleşmek için izin verir. ince ayrıntılar Brown hareketi tarafından gizlenmiş olmasına rağmen bu noktada LBCs ve diğer nükleer organeller, faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile görülebilir. yüksek çözünürlüklü mikroskobik gözlem veya moleküler analiz için, tüm hazırlık slayt sıkıca hassas LBCs takmak için santrifüj edilir. Paraformaldehid kısa tespit sonra immunofluorescent boyama ya da in situ hibridizasyon takip edilir. LBCs bir transkripsiyonel olarak aktif durumda olan ve onların büyük boy konfokal ya da süper çözünürlük mikroskopi kullanılarak bireysel gen düzeyinde moleküler analiz izin verir.
Giriş
Çoğu omurgalıların, keseliler ve plasentalı memelilerin önemli hariç, büyük yolky yumurta üretmek. onların bazen muazzam boyutlarına rağmen, bu yumurtalar dişi yumurtalıkta ise hala nihai bir boyut ulaşmak tek hücrelerdir. Yumurtalık yumurta oosit denir ve her biri tipik sadece germinal vezikül veya GV gibi erken 19. yüzyıldan beri bilinen tek ve dev bir çekirdeğe içerir. Ortak laboratuvar kurbağalar, Xenopus laevis ve Xenopus tropicalis 1 Oositler, 1.2 mm ve 0.8 mm sırasıyla (Şekil 1) bir maksimal çapı ulaşır. Çapı 0.4 mm (Şekil 2, 3) - Bu iki kurbağa olgun oosit gelen GV 0.3 vardır. Salamande....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Genel kurbağalar ve semenderler hakkında bilgi yanı sıra hayvanların kaynakları, aşağıdaki web sitelerinden bulunabilir: Xenbase (http://www.xenbase.org) ve Sal-site (http://www.ambystoma.org). Bu protokol Bilim Carnegie Kurumu Embriyoloji Anabilim Dalı hayvan bakım kuralları takip eder.
1. Çözümler
- Karıştırılarak 1 M NaHCO 3 deiyonize ya kloru giderilmiş H2O L 10, 1 M CaCl2 ve 10 ml 10 ml ekleyin: 10 L "kurbağa suyu" emin olun.
- 1 L% 20 paraformaldehid Üyeler: 4 mM Na 2 1 L CO 3 yapın. Kimyasal bir kaput çözünmesi yaklaşık 80 o C toz paraformaldehid ve ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Dev lampbrush kromozomlarını inceleyen bir kurbağa ya da semender oosit izole ederek başlar. Şekil 1, kurbağa, Xenopus överden çıkarıldıktan sonra tamponlu tuzlu su çözeltisi içinde, olgun oosit, bir grubu gösterir. Bu oositler, oda sıcaklığında gün iyi durumda kalır. Çekirdeği (ya da germinal vesicle) daha sonra ya bir tuz çözeltisi (Şekil 2) ya da yağ içinde, takı forsepsle bir oosit (Şekil 3) çıkarılır. yağ izole çekirdeğin n.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kurbağalar ve salamanders el-izole GVs gelen "yaşam" LBCs ilk gözlemler floresan immün önce ve FISH önce, Amerikan biyolog William Duryee, faz kontrast ve DIC mikroskopi giriş önce 19 tarafından yaklaşık 80 yıl önce yapılmıştır. gerçekçi bir şekilde bunları düzeltmek için, ve temel morfolojisi bozmadan moleküler teknikler uygulamak için, cam slaytlar LBCs takmak için teknikler bireysel gen düzeyinde gerekli gelişimini kromozom yapısı ve transkripsiyon detaylarını araştırmak için LBCs avantajları. Bu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından R01 GM33397 ödül numarasıyla desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. J.G.G., Amerikan Kanser Derneği Gelişimsel Genetik Profesörüdür.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
in situ
anılır;< Yağ Yapıştırıcı PCR ve hibridizasyon odalarında
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehit (reaktif sınıfı, kristalli) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Birçok protokoldeki uyarılara rağmen, konsantre bir çözelti RT'de süresiz olarak saklanabilir |
| Etil 3-aminobenzoat metansülfonat | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Bazen MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 daire konik nokta 3-0 sütürler | VWR ve nbsp olarak | 95057-000 | |
| Paraplast (parafin mumu) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| em>p-Fenilendiamin | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Jelatin | Bakkal | Ticari Knox jelatin iyi çalışıyor | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Altın Mühür kapak camı 22 x 22 mm # 1 1/2 (0.16 - 0.19 mm kalınlık) | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 63786-01 | Bu lameller süper çözünürlüklü mikroskopi için önerilen kalınlıktır |
| Dumont forseps #5 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Parafin yağı (hafif) | EMD Chemicals | PX0047-1 | GV'leri izole etmek için |
| (25 & L) | BioRad | Frame-Seal Kaydırma Odaları #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silikon izolatörler | Grace-Biolabs | katalog bağlantısından seçin | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin kavanozları ve boyama kapları | Elektron Mikroskobu Bilimleri | katalog bağlantısından | seçinhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
Kaynaklar
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
