Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Abstract

Dev virüslerin izolasyonu bu dev virüsler protistler ilgili özellikle, viroloji, bu yeni dönemde büyük ilgi olduğunu. Dev virüsler protistlerin birçok tür için potansiyel patojenik olabilir. Onlar Megavirales son zamanlarda açıklanan sipariş aittir. Pis su örneklerinden izole edilmiş yeni bir soy Faustovirus memeli patojen Afrika domuz ateşi virüsü uzaktan ilişkili olduğunu. Bu virüs aynı zamanda amoebal ana bilgisayar Vermamoeba vermiformis, sağlık su sistemlerinde yaygın protistler özgüdür. Onun genotip koleksiyonunu büyütmek ve pan-genomu incelemek amacıyla yeni Faustovirus genotiplerin izole devam çok önemlidir. Bu amip ko-kültür bakteriyel ve fungal kirletmesini önlemek için antibiyotik ve antifungal kombinasyonlarının kullanımının geliştirilmesi ve virüs çoğalmasını lehine ek suşlarının izole edilmesi için yeni bir strateji geliştirildi. Biz de yeni bir starvatio uygulamayaN, orta V korumak virüs ko-kültür için uygun koşullarda vermiformis. Son olarak, sitopatojenik bir etkiye tespit etmek için, zaman alıcı, akış sitometrisi yerine mikroskopik gözlem kullanılmıştır. Biz daha iyi bir ortam, ev sahibi özgüllük ve genetik içeriğini anlamak için, bu yöntemin etkinliğini kanıtlayan ve böylece Faustoviruses toplanması genişletilmesi, kanalizasyon örneklerinden iki izolatı elde edilmiştir.

Introduction

Dev virüsler, Megavirales sipariş ait özellikle keşif, tamamen partikül büyüklüğü ve genom karmaşıklığı açısından virüslerin dünyayı değiştirdi. Virüsler, daha önce küçük işletmeler olduğu düşünülen ve Mimivirus tüm kuralları kırmaya ortaya çıktı. ¹ Metagenomic veri ortamında, ^2-5 değil, aynı zamanda insanlarda sadece dev virüslerin aynı anda her yerde göstermektedir. ⁶ Bu nedenle, hala ihtiyaç vardır büyük ölçekte bu virüslerin aramak için. Bu dev virüslerin çeşitlilik insan numuneleri ^12,13 ve çevresel örneklerde çeşitli tarama ile, dünya çapında da ^7-11 fakat su ortamlarının çeşitliliği ve bunlarla ilişkili sedimanlar sadece örnekleme ile değerlendirildi. ^7,9 Acanthamoeba polyphaga mimivirus oldu fagositik protistler, öncelikle Acanthamoeba spp kullanarak ko-kültür tarafından izole edilmiştir. ^14-16 dev virüslerin bütün bir koleksiyonu da o vardıbilimsel topluluk Acanthamoeba spp araştırma ve izolasyon prosedürü kısıtlamak yapılan bu belirtilen protist host, izole. Açıkça tek bir ana türün bu güven virüslerin büyük bir kısmı gözardı ediliyor sonuçlandı. Dev virüs, CroV, son derece hareketli deniz protozoon Kafeterya roenbergensis ile izole edilmiş olması, ^17,18 yeni soyları ya da dev virüslerin aileleri keşfetmek için protozoa daha geniş kullanma ihtiyacını ortaya koymaktadır. Reteno ve diğ., Daha önce hiç kullanılmamış olan hücre bilgisayarlar gibi diğer protozoa seçmek başardı ve dev virüslerin yeni Asfar ile ilgili soy (Yeni adlandırılan Faustovirus) izole edilmiştir. ¹⁹

Bu viral soy üyelerini genişletmek amacıyla yeni Faustovirus genotiplerin izole etmek için bir girişim olarak, bizim izolasyon prosedürleri modifiye ve yeni Faustoviruses hasat edebilen çevresel örnekleri ekrana onları kullandı. Daha sonraYeni izolatları karakterize etmek için tüm protokol nitelendirdi. Biz Vermamoeba vermiformis, daha önce ilk Faustovirus prototip E12. ¹⁹ halen ana özgü olduğunu Faustovirus Bu protistlerin izolasyonunda kullanılan insan ortamlarda bulunan en yaygın serbest yaşayan protistler, ^20-22 değerlendirildi. Bizim laboratuvar amip lizis veya viral büyüme gösterdi hiçbir girişimde diğer dev virüsleri büyümeye çünkü bilinen dev virüslerin hiçbiri, bu amip için patojenik olduğunu biliyordum. Bu nedenle, söz konusu inanıyoruz V. vermiformis yeni Faustoviruses izole etmek bilinen en iyi ve en eşsiz hücre desteğidir.

Protocol

1. Örnek Toplama Farklı ortamlarda ve bölgelerden gelen 70 örnekleri toplamak. Saint Pierre de Meyzoargues (Fransa), Marsilya (Fransa) Parc Borely gölden 15 numune köyünden 5 kirli su örnekleri;: Bu durumda, aşağıdaki kullanın 15 deniz suyu 25 nehir suyu örnekleri Alpler (Fransa) Marsilya SAMENA (Fransa), kayalık girişlerden sediman numuneler ve nihayet, La Ciotat kanalizasyon 10 numune (Fransa). herhangi bir tedavi olmaksızın oda sıcaklığında, bir dakika boyunca, aşılanmasından önce homojenleştirme vorteksleyin örnekleri. 2. İzolasyon Prosedürü Kör Kültür Usul ve Numune Aşılama için Hazırlık ev sahipliği Kullanım V. ko-kültür için bir hücre desteği olarak vermiformis (suş CDC19). (Proteaz pepton, maya özütü-glikoz ortamında 30 ml 75 cm 2 hücre kültürü şişesi içinde, py 28 ° C 'de muhafaza amipG). Tablo 1'de PYG kompozisyon kontrol edin. Not: 48 saat sonra, amipler normal sayım kullanılarak sayım slaytlar (ör Kovaslides) ile nicelendirilir. 10 dakika boyunca 720 x g'de santrifüj ile 5 x 10 5 6 hücre / ml, ve topak amipler 10 arasında bir konsantrasyonda Hasat hücreleri. Aspirasyon ile süpernatantı alın ve steril Page'in amoebal tuzlu (PAS) Tablo 1'de 30 ml amipler pelet yeniden askıya. Bu durulama işlemi tekrarlayın. Yaklaşık 10 6 amipler / ml'lik bir konsantrasyonda bir antibiyotik ve anti-mantar karışımı ile starvasyon ortamı 30 ml amip yeniden askıya. açlık orta kese içine alma veya çarpma olmadan hayatta kalmak mümkün kılan amip için bir hayatta kalma ortamı olduğunu. Tablo 1 'de bir bileşim edin. Not: antimikrobiyel madde karışımı 10 ug / ml, vankomisin, 10 ug / ml, imipenem, 20 ug / ml siprofloksasin, 20 μ ihtivaug / ml doksisiklin, ve 20 ug / ml, vorikonazol. Bu karışım azaltmak veya viral çarpma değiştirebilir bakteriyel ve fungal kontaminasyonu azaltmak için görev yaptı. Doğrudan nemli bir ortam ihtiva eden bir torba içine ıslak kompres yerleştirilmesi ile (amiplerin yapışmasını destekleyen bir 96-çukurlu plaka düz dipli 200 ul amip tek tabaka üzerine, her numune için 25 ul inoküle ve nemli bir ortamda 30 ° C'de inkübe ) buharlaşmayı önlemek için plaka. Bu primo-kültürdür. Herhangi bir örnek aşılaması olmayan amip iki kuyu bırakın; Bu negatif kontrol olarak görev yapar. Üç gün boyunca bu primo-kültür inkübe edin. Üç gün ilk aşılama, alt kültür herhangi mikroskobik gözlem olmadan yukarıda açıklandığı gibi taze amip üzerinde primo-kültür plakası sonra. primo-kültürü ile aynı koşullar altında üç gün yeni bir plaka inkübe edin. inkübasyon bu üç gün sonra th için aynı şekilde son kültür gerçekleştirmeE primo- ve alt kültür. iki gün boyunca son kültür inkübe edin. Sonra algılama geçin. Otomatik Akış Sitometrisi ile liziz algılama Not: akışı ile birleştiğinde Kör kültür sitometri izolasyon önceki standart sisteminden farklıdır. Daha duyarlı, hassas ve otomatik olduğunu. algılama amaçlı, en yüksek hızda ve mikroskopik gözlem olmadan lizis algılamak için geliştirilen yeni bir teknikle uyguladı. Bu teknik, bir tarama örneklerinin avantajlıdır ve daha büyük tekniklere kıyasla daha iyi bir duyarlılığa sahiptir. 7-9 lizis tespit etmek için nihai eş-kültür 96 oyuklu plaka kullanınız. sitometresinde açın ve üreticinin protokolüne uygun olarak düşük arka plan gürültüsünü elde etmek için temiz ve durulama çalıştırın. Yüksek Verimli Sampler sitometresi otomatik 96 oyuklu plaka örnekleri yüklemek ve accordin 40 dakika içinde tamamen otomatik satın alma yapmak için akış ile birleştirilen (HTS) başlatınüreticinin protokolüne örn. aşağıdaki gibi HTS ayarlayın: Örnek hacmi 150 ul, hacim 50 ul karıştırma hızı 180, karışımları 5 sayısının karıştırma, her bir numune 400 ul arasındaki yıkama hacmi, oran 2.5 ul / sn, kaydedilen olayların 10.000 sayısını akar. kapısına ilk sırada yer amip nüfusu son ko-kültür mikro-plaka negatif kontrol kuyuları değerlendirmek ve fiziksel özelliklerine göre bu hücre konak yüzdesini belirlemek için. homojen bir amip nüfus ve enkaz ve gürültü tekabül eden bir alt olayların ikinci nüfusa sahip olduğundan emin olun. Not: Bu yolluk prosedürü ileri dağılım ile tahmin boyutuna göre tek hücre, gelen hücre içi enkaz ve topaklar ayırır. Doğru mümkün olan en iyi yolluk prosedürü kullanarak her nüfusun yüzdesini belirlemek için önemlidir. Bu yüzdeler protozoa birçok çeşit kullanılan, özellikle değişebilir, bu nedenle bir negativ olması her zaman önemlidirÖrneklerin geri kalanı için referans popülasyon olarak kullanılabilecek e kontrolü. acquire örnek tıklayarak yolluk başlayın. 10.000 olaylar az olmamak olayların sayısını kaydeder. okunu kullanarak ilgi amip nüfusu yerelleştirilmesine. Bu kapıları tanımlamak için nasıl. Daha sonra otomatik olarak tüm plakayı, yolluk sonra, HTS nokta izin veya 'Home' tıklayarak plaka bulun. boyutu ve yapısı parametrelerine göre veri toplama ve analizi yapın (sırasıyla, FSC (ileri dağılım) ve SSC (yan dağılım)). Not: amip kapılı nüfus kaybını saptamak amip lizis sorumlu patojen ajanın varlığını işaret eder. virüs enfeksiyonu ile ilişkili protozoa liziz analiz cihazı ile işlenir ve güvenilir bir negatif kontrol olarak kullanılan aynı olmayan enfekte olmuş popülasyonlar göre amip nüfusun% 50 liziz bir keyfi olarak tasarlanmış eşik ile tespit edilir. <pclass = "jove_title"> 3. Lizis Algılama sonra Yeni İzolatlarının Karakterizasyonu Ön Boyama Dev Virüslerin Durum Ortaya Çıkardı flow sitometri lizis algılama sonra, kalan amip askıya parçalanmış ko-kültür pipetle. Daha sonra doğrudan 10 dakika boyunca 800 x g'de süspansiyon 50 ul sitosantrifüj. Santrifüj işleminden sonra, saf metanol çözeltisi ile slaytlar düzeltmek. mavi Eozin / Azur ve DAPI boyama ticari hızlı boyama kullanarak slaytlar Leke ve virüs fabrikaları varlığını kontrol etmek için 1,000X büyütme bir ışık mikroskobu altında gözlemlemek. hızlı boyama, birinci eozin çözeltisi içine slaytlar dalma daha sonra bir fosfat tampon çözeltisi ile 45 saniye için slaytlar durulama son olarak 6 saniye Blue Azur ihtiva eden ikinci sabitleme çözeltisi içine slaytlar dalma doğrudan geçmesi ve (4 sn üç kez tekrar) pH 7.2. sonra görünen kaydetme devam, oda sıcaklığında kurumaya bırakın slaytlarüzerinde. DAPI boyama, mevduat sabit kuru slayt üzerine DAPI ticari stok solüsyonu 15 ul İçin. ışıktan korumak ardından gözlem geçin. Elektron mikroskobu slaytlar ilk tespitten sonra, yüzen kültürlerin elektron mikroskobu gözlem yoluyla dev virüsün varlığını değerlendirmek. Mevduat parlayan taburcu ızgara üzerine olumlu örnek 5 ul. oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika boyunca bekleyin. Üzerinde 10 saniye boyunca% 1 amonyum molibdat küçük bir damla dikkatle ızgara ve mevduat kurutun. 5 dakika boyunca kurumaya ızgara bırakın. 200 keV de mikroskopi elektron geçin. tutucu ızgara yerleştirin; mikroskop içine tutucu tanıtmak. İlgili ikonuna tıklayarak vakum genel kontrol edin. Yakın vanalar spot büyüklüğü 5 de gözlem başlar ve x 25.000 büyütme ve. ImageJ veya doğrudan kullanarak dev virüs ölçünsatın alma ekranında bulunan mikroskop ölçüsü aracını kullanarak mikroskop ly. Not: Yaklaşık 200 nm'lik bir kapsid boyutu Faustovirus grubuna örnek sınıflandırır. Moleküler Biyoloji Not: Bu tanımlamanın ardından, moleküler biyoloji testleri elektron mikroskobu altında aynı kapsid boyutu ve görünüme sahip Marseillevirus gelen Faustovirus ayırt etmek için onay için çok önemli olduğunu, aynı konak özgüllüğü olmamasına rağmen. Marseillevirus Vermamoeba üzerinde büyümek değil, Faustovirus Vermamoeba ve bugüne kadar başarısız olmuş gibi Acanthamoeba gibi diğer amip üzerinde büyümek tüm girişimleri özgüdür. Tasarım ve Reteno ark eserlerinde yer alan spesifik primer / prob sistemlerinin uygulama. viral genlerin amplifikasyonu ve sekanslama yoluyla, yeni izole edilmiş virüs daha kesin bir ön sınıflandırma sağladı. eskiüreticinin protokolüne göre otomatik bir ekstraksiyon sistemi ile pozitif kültür örneklerinden yolu DNA. Reteno vd de tarif edildiği gibi PCR bir PCR, gerçek zamanlı gerçekleştirin. 19 Amplifikasyon için kullanılan aynı primerler kullanılarak Dizisi. DNA-idareli RNA polimeraz altbirim 1 genini hedef primerler kullanın: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(ileri) ve Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (ters) ile Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA sonda. 4. Virüs üretimi, saflaştırılması ve Genomu Sıralama uç nokta seyreltme klonlama için tek bir virüs amip kültürünü altkültürü. Üretimi için: PYG 30 mi, 10 Vermamoeba vermiformis ml ve zaten küçük şişelere kuyu transfer izole virüs 5 ml ihtiva eden 20 şişeler hazırlar. tamamlanana kadar 30 ° C'de inkübe edinamip erimesi. Tüm amip parçalanmış kadar ters optik mikroskopi ile her gün gözlemleyin. tam Parçalama işleminden sonra, bir alıcıya tüm şişeler havuz. artıkları yok etmek için 0.45 um filtre ile filtre. 75 dakika boyunca 89.800 x g'de ultrasantrifugasyon sureti ile saflaştırma başlatın. santrifüj başlamadan önce tüplerin ağırlığını kalibre emin olun. Santrifüj işleminden sonra, aspirasyon her tüpten kaldırmak ve santrifüj tekrarlamadan önce, kalibrasyon için kullanılan aynı hacimde PAS pelet yeniden askıya. Yukarıda olduğu gibi, süpernatant kaldırmak ve fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml (PBS) içinde her pelet yeniden askıya. (0.22 um filtre üzerinde filtre PBS, 100 ml sukroz 27.5 g),% 25 sukroz ile üretilir virüs saflaştınlır. sükroz 8 ml ve viral süspansiyonun 2 ml kullanın. 1 saat 15 dakika süre ile 89.800 x g'de santrifüjleyin. 1 ml PBS pelet yeniden askıya. -80 ° C'de saklayın. </li>

Representative Results

Bu yazıda incelenen sistem iki yeni Faustoviruses izole ederek kavramın kendi kanıtı valide. Test edilen 70 örnek, lizis iki bölüm Güvenilir negatif kontroller aksine, tespit edilmiştir. lizis için negatif kontrol% 86 amip nüfus içeriyordu. Buna karşılık, pozitif örnekler (Saint Pierre de Meyzoargues için ST1) ve (La Ciotat Numune 9 LC9) kapılı amip dramatik bir düşüş gösterdi; amip fazla% 60 kalıntı en yüksek yüzde lize edildi. Bizim yöntemin saptama aşamas…

Discussion

Faustovirus ASFV yakın yeni Megavirales ailesinin ilk üyesi ihtimali ilk Reteno ve diğ., ¹⁹ tarafından önerildi ancak bazı farklılıklar de ayırt edilebilir. Faustovirus Asfarviridae ailesine katılmak gerekip gerekmediğini veya yerine yeni bir varsayılan virüs ailesini oluşturmalıdır belirsizliğine dikkat çekmektedir. Bu konu daha fazla araştırma, kendi morfolojisi özellikle daha kapsamlı karakterizasyonu, ev sahibi aralığı, çoğaltma döngüsü ve gen repertuarı gerektirece…

Materials

LSR FORTESSA cytometer	BD Biosciences	France	649225B4
TECNAI G2 F20	FEI	Germany	5027/11
Optical inverted microscope	leica	France	72643
DNA extraction	Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot	France	L106A0452
PCR Cycler CFX96	Bio rad	France	785BR06298
PYG medium , PAS, Starvation medium	In house laboratory production	Marseille URMITE	x
Amoeba strain CDC-19	ATCC	France	50237
Plates	Cellstar	France	655180
PCR materials, primers.	eurogentec	France	Primers cited in manuscript
glasstic slide 10 with grids	Kova	USA	H899871441F
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain	Merck milipore	France	111955,6,57,109468
Vacuum driven filters	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
DAPI stain	Life Technologies	France	D1306
cytospin  4 cytocentrifuge	Thermo Fisher scientific	France	10522013JT184-31
Single cytology tunnel	Biomedical polymers inc.	France	BMP-cyto-S50
Carbon grids	Euromedex	France	FCF400NI
Ammonium molibdate	VWR internationanl	France	21276185
Flasks	SARSTEDT	Germany	833911
0.22μm filters	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Rapid-flow filters	Nalgene	France	450-0020