Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Evrimsel değişimin altında yatan genlerin alellerini tanımlamak, evrimin nasıl ve neden gerçekleştiğini anlamak için çok önemlidir. Bu amaçla, son zamanlarda yapılan birçok çalışma, çeşitli türlerdeki özelliklerin evrimi için aday genleri belirlemeye odaklanmıştır. Bununla birlikte, yakın zamana kadar ilginç aday genleri işlevsel olarak doğrulamak zordu. Genetik mühendisliği için son zamanlarda geliştirilen araçlar, çok çeşitli organizmalarda belirli genleri manipüle etmeyi mümkün kılmaktadır. Bu teknolojinin evrimsel olarak ilgili organizmalarda uygulanması, aday genlerin evrimdeki rolüne dair benzeri görülmemiş bir içgörü sağlayacaktır. Astyanax mexicanus (A. mexicanus), hem yüzeyde hem de mağarada yaşayan bir balık türüdür. Mağarada yaşayan formların çok sayıda bağımsız çizgisi, birbirleriyle ve yüzey balıklarıyla iç içe geçmiş olan ve mağara özelliklerinin genetik temelinin aydınlatılmasına izin veren atasal yüzey balıklarından evrimleşmiştir. A. mexicanus, bir dizi özellikten sorumlu aday genleri tanımlamak için bağlantı analizi de dahil olmak üzere bir dizi evrimsel çalışma için kullanılmıştır. Bu nedenle, A. mexicanus, aday genlerin rolünü test etmek için genom düzenleme uygulaması için ideal bir sistemdir. Burada, yüzey A. mexicanus'taki genleri mutasyona uğratmak için transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALEN'ler) kullanmak için bir yöntem bildiriyoruz. A. mexicanus'ta TALEN'ler kullanılarak genom düzenleme, pigmentasyon genlerinde mutasyonlar oluşturmak için kullanılmıştır. Bu teknik aynı zamanda A. mexicanus'un mağara formlarında evrimleşmiş bir dizi başka özellik için aday genlerin rolünü değerlendirmek için de kullanılabilir.
Giriş
Sürekli evrim genetik temelini anlamak evrimci biyologların kritik bir araştırma hedeftir. Önemli ilerleme özelliklerin evrimini altında yatan lokusların belirlenmesi ve (örneğin 1-3) bu loci içinde aday genlerin saptayarak yapılmamıştır. Ancak, fonksiyonel bu genlerin rolü özelliklerin evrimini incelemek için kullanılan birçok organizmaları zorlu kaldı etmiştir test şu anda genetik uysal değildir. Genom düzenleme teknolojileri çıkması büyük ölçüde organizmaların geniş bir genetik uygulanabılirliği artmıştır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ve kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPRs) ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bütün hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygun olarak ve Iowa Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Maryland Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. TALEN Tasarım
- Bir TALEN tasarım web sitesine giriş istenen hedef dizisi. (Örneğin https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Giriş boşluk / tekrar dizi uzunlukları seçildi.
- "Dizi" etiketli kutunun içine genomik dizisi kopyalayın.
- "Özel Spacer / RVD Uzunlukları sağlayın" sekme içinde boşluk uzunluğu ve dizi uzunluğunu seçin.
Not: 15 baz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TALEN çifti enjeksiyonlar (NHEJ) birleştiren homolog olmayan uç boyunca tamir edilebilir iki iplikçikli sonları 39 ile sonuçlanan, dolayısıyla Foki etki dimerizasyonunu spesifik DNA nükleotidini RVDs bağlanması ve sonuçlanır. NHEJ sık sık ekleme veya çıkarma (indeller) neden hataları tanıttı. Indeller TALEN hedef bölgesini çevreleyen bölgenin amplifiye edilmesi ve TALEN aralayıcı bölge içinde kesen bir sınırlama enzimi ile elde edilen amplikon sindirilmesi ile tespit .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Büyük adımlar özelliklerin evrim genetik temelini anlamaya yönelik son yıllarda yapılmıştır. Özellikleri, bir dizi evrimi yatan aday gen belirlenmişse de, bunun nedeni en evrimsel ilginç türlerinin genetik tractability eksikliği, in vivo olarak, bu genlerin test etmek zor kalmıştır. Burada A. genom düzenleme için bir yöntem raporu mexicanustan, bir tür mağara hayvanların evrimi incelemek için kullandı. Genetik haritalama 1,21,23 çalışmaları ve aday gen A mağara şeklinde öze.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Genetik, Kalkınma ve Hücre Biyolojisi ve Iowa State Üniversitesi Bölümü tarafından ve NIH hibe EY024941 (WJ) .Dr tarafından finanse edildi. Jeffrey Essner el yazması üzerine yorum sağladı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman< / güçlü > | |||
| Thermocycler | |||
| Enjeksiyon istasyonu | |||
| Jel aparatı | |||
| İğne çektirme | |||
| Nanodrop | |||
| Adı< / güçlü > | < güçlü> Şirket | Katalog Numarası | Comments< |
| strong>Supplies | |||
| Not: Bildiğimiz kadarıyla, aksi belirtilmedikçe | |||
| Golden Gate TALEN ve TAL Efektör Kiti 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granül) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Mikrobiyoloji Ortamı: LB Et Suyu, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in %50 EtOH | Teknova (Fisher aracılığıyla sipariş edilir) | 50-843-314 | |
| Spektinomisin Dihidroklorür, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Süper Ampisilin (1.000x çözüm) | DNA Teknolojileri | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solüsyonu, kullanıma hazır | Thermo Sci Fermentas Inc (Fisher aracılığıyla sipariş | )FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri kapları | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (Fisher aracılığıyla sipariş edildi) | 50-812-203 | BsaI-HF değil BsaI kullanın (Golden Gate TALEN ve TAL Efektör Kiti protokolünde açıklandığı gibi) |
| BSA | New England Biolabs | kısıtlama enzimleri | |
| 10x T4 ligaz tamponu | Promega (Fisher aracılığıyla sipariş edilir) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master karışımı | Promega (Fisher aracılığıyla sipariş edilir) | PRM7123 | Diğer Taq kullanılabilir, ancak reaksiyon buna göre ayarlanmalıdır |
| Hızlı ligasyon kiti | New England Biolabs (Fisher aracılığıyla sipariş edildi) | 50-811-728 | Tüm TALEN montaj reaksiyonları için Quick Ligase kullanıyoruz |
| One Shot TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Diğer kimyasal olarak yetkin hücreler veya ev yapımı yetkin hücreler kullanılabilir |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Fisher aracılığıyla sipariş edilmiştir) | FERER0451 | |
| Plazmid Güvenli ATP'ye bağımlı DNaz | Merkez Üssü (Fisher aracılığıyla sipariş edilir | )NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti | Qiagen | 27106 | Qiagen kiti, ilk plazmit hazırlığı için kullanılmalıdır (Golden Gate TALEN ve TAL Efektör Kiti protokolünde açıklandığı gibi) |
| QIAquick PCR Saflaştırma Kiti | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Hızlı Çözünen Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Fisher aracılığıyla sipariş edildi) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transkripsiyon kiti | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Temizleme Kiti | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Numune Yükleme Boyası | Ambion (Fisher aracılığıyla sipariş edildi) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (Fisher aracılığıyla sipariş edildi) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Tek Kullanımlık Soda-Kireç Cam Pastör Pipetleri | Fisher | 13-678-6B | |
| Standart Cam Kılcal Damarlar | Dünya Hassas Aletler | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Femtojet Mikroenjektör Eppendorf için Mikro Yükleyici | Uçları (Fisher aracılığıyla sipariş edilir) | E5242956003 | |
| Sodyum hidroksit | Fisher | S318-500 | |
| Tris tabanı | Fisher | BP152-1 |
Kaynaklar
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mut....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
