Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

genom Düzenleme

7.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54113

⸱

20 Haziran 2016

 ,  , 
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

Bu makalede

Özet

Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir.

Özet

Evrimsel değişimin altında yatan genlerin alellerini tanımlamak, evrimin nasıl ve neden gerçekleştiğini anlamak için çok önemlidir. Bu amaçla, son zamanlarda yapılan birçok çalışma, çeşitli türlerdeki özelliklerin evrimi için aday genleri belirlemeye odaklanmıştır. Bununla birlikte, yakın zamana kadar ilginç aday genleri işlevsel olarak doğrulamak zordu. Genetik mühendisliği için son zamanlarda geliştirilen araçlar, çok çeşitli organizmalarda belirli genleri manipüle etmeyi mümkün kılmaktadır. Bu teknolojinin evrimsel olarak ilgili organizmalarda uygulanması, aday genlerin evrimdeki rolüne dair benzeri görülmemiş bir içgörü sağlayacaktır. Astyanax mexicanus (A. mexicanus), hem yüzeyde hem de mağarada yaşayan bir balık türüdür. Mağarada yaşayan formların çok sayıda bağımsız çizgisi, birbirleriyle ve yüzey balıklarıyla iç içe geçmiş olan ve mağara özelliklerinin genetik temelinin aydınlatılmasına izin veren atasal yüzey balıklarından evrimleşmiştir. A. mexicanus, bir dizi özellikten sorumlu aday genleri tanımlamak için bağlantı analizi de dahil olmak üzere bir dizi evrimsel çalışma için kullanılmıştır. Bu nedenle, A. mexicanus, aday genlerin rolünü test etmek için genom düzenleme uygulaması için ideal bir sistemdir. Burada, yüzey A. mexicanus'taki genleri mutasyona uğratmak için transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALEN'ler) kullanmak için bir yöntem bildiriyoruz. A. mexicanus'ta TALEN'ler kullanılarak genom düzenleme, pigmentasyon genlerinde mutasyonlar oluşturmak için kullanılmıştır. Bu teknik aynı zamanda A. mexicanus'un mağara formlarında evrimleşmiş bir dizi başka özellik için aday genlerin rolünü değerlendirmek için de kullanılabilir.

Giriş

Sürekli evrim genetik temelini anlamak evrimci biyologların kritik bir araştırma hedeftir. Önemli ilerleme özelliklerin evrimini altında yatan lokusların belirlenmesi ve (örneğin 1-3) bu loci içinde aday genlerin saptayarak yapılmamıştır. Ancak, fonksiyonel bu genlerin rolü özelliklerin evrimini incelemek için kullanılan birçok organizmaları zorlu kaldı etmiştir test şu anda genetik uysal değildir. Genom düzenleme teknolojileri çıkması büyük ölçüde organizmaların geniş bir genetik uygulanabılirliği artmıştır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ve kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPRs) (Örnek 4-11 için) organizmadan genler hedefli mutasyon üretmek için kullanılmıştır. Bir evrimsel ilgili sisteme uygulanan bu araçları, evrimsel biyologlar evrimin genetik temeli çalışma yol devrim potansiyeline sahip.

Astyanax mexicanustan iki şekilde bulunur balık türüdür. Bir nehir yaşayan yüzey formu (yüzey balık) ve çoklu mağaralarda yaşayan formları (cavefish) A. mexicanustan cavefish (12 gözden) yüzey balık atalarından evrimleştiği. Cavefish popülasyonu gibi okullaşma davranışının kaybı, artan saldırganlık, duruş ve hiperfajya 13 beslenme değişiklikleri gibi davranış damak tadınızı ve kafatası neuromasts ve değişikliklerin sayısında artış, azalma ya da pigmentasyon kaybı, gözlerde kaybı da dahil olmak üzere özellikleri bir dizi geliştiğini -19. Cavefish ve yüzey balıkları interfertile, ve genetik haritalama deneyleri mağara özellikleri 1,20-26 için lokus ve aday genleri tanımlamak için yapılmıştır. Bazı aday genler diğer türlerin 21 model organizmalarda veya aşırı ifadesinin 27 veya geçici demonte u tarafından, hücre kültürü 1,19 mağara özellikleri katkıda işlevsel rolü için test edilmiştirA. morpholinos 28 şarkı mexicanustan. Bununla birlikte, bu yöntemlerin her biri, bir sınırlama vardır. A. Bu genlerin mutant alelleri oluşturma yeteneği mexicanustan cavefish evriminde işlevini anlamak için kritik önem taşır. Bu nedenle, A. mexicanustan genom düzenleme teknolojileri uygulanması için ideal bir aday organizmadır.

Burada A. genom düzenleme için bir yöntem özetlemektedir mexicanustan Talens kullanılmıştır. Bu yöntem, fenotip ve ilgi 29 genlerin kararlı mutasyonları ile balık hatları izole etmek için mozaik enjekte kurucu balık değerlendirmek için de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bütün hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygun olarak ve Iowa Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Maryland Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. TALEN Tasarım

  1. Bir TALEN tasarım web sitesine giriş istenen hedef dizisi. (Örneğin https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Giriş boşluk / tekrar dizi uzunlukları seçildi.
    1. "Dizi" etiketli kutunun içine genomik dizisi kopyalayın.
    2. "Özel Spacer / RVD Uzunlukları sağlayın" sekme içinde boşluk uzunluğu ve dizi uzunluğunu seçin.
      Not: 15 baz çiftlerinin Spacer uzunlukları ve iyi 15-17 iş dizi uzunlukları tekrarlamak ve montaj az karmaşık hale getirmektedir.
  2. Bir TALEN çiftini seçin. benzersiz sınırlama enzimi noktasının etrafında tasarlanmış TALEN çiftleri kısıtlama enzimi tarafından genotipleme sindirilmesi izinBir PCR ürünü,.
  3. Tasarım primerler gibi Primer3 30-32 gibi web sitesini kullanarak TALEN hedef alanını çevreleyen genomik bölgeyi yükseltmek için. bir kısıtlama enzimiyle genotipleme olduğunda, astar tasarımı bir kere kısıtlayıcı enzim merkezi ihtiva eden bir bölümünün yükseltilmesi için. Bölgenin büyütülmüş ve A içinde mevcut olan herhangi polimorfizmlerini tespit etmek TALEN yapı önce dizilenmiştir önerilir mexicanustan laboratuar popülasyon mikro enjeksiyon için kullanılmak üzere.

(TALEN Kit Protokolü Modifiye) 2. TALEN Meclisi 33,34

Ek ayrıntılar ve sorun giderme için protokol 34 bkz.

  1. Hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre TALEN kiti gerekli plazmidler sırası.
  2. reaksiyonlar A ve B için 1 reaksiyonlar tekrar değişkenli diresidues (RVDs) 1-10 ve Reaksiyon A. hedef vektör pFUS_A RVDs dahil 11- dahil # (N-1) ve th kurmakN talen bölgesindeki RVDs sayısı e hedef vektör pFUS_B Reaksiyon B (n-1).
    1. Her reaksiyon ekleyin: Her RVD (100 ng / | il), hedef vektör (100 ng / | il), 1 ul Bsa I kısıtlayıcı enzim, 1 ul Sığır Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ihtiva eden her bir plazmid, 1 ul ), 1 ul ligazı, 20 ul toplam hacim su ul 10x ligaz tamponu ve x 2 ul. Örneğin, bakınız Tablo 1.
      Not: yarım reaksiyonları da kullanılabilir.
    2. Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve döngüyü çalıştırın: 10x (37 ° C / 5 dk + 16 ° C / 10 dk) + 50 ° C / 5 dk + 80 ° C / 5 dk.
  3. nükleazı ile reaksiyonları inkübe edin. Her reaksiyon için 1 ul 25 mM ATP ve 1 ul nükleaz ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C 'de reaksiyonlar inkübe edin.
  4. Tepkiler Transform.
    1. Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü.
      Not: Ev yapımı yetkili carşın kullanılabilir. Bununla birlikte, düşük yetkinlik hücreler koloni eksikliği ile sonuçlanabilir.
      1. kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. Beş dakika süre ile buz üzerinde inkübe edin. 42 ° C'de 30 saniye boyunca inkübe hücreleri.
      2. 2 dakika boyunca buz üzerinde tüpler yerleştirin. Katabolik baskı (SOC) ile Süper Optimal suyu 125 ul ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de tüpler çalkalayın.
    2. Plaka spektinomisin (50 ug / ml) LB plakaları üzerine dönüştürülmüş hücreler, 100 ul, X-gal ve izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG). 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün.
  5. Her reaksiyon için 2-3 Beyaz koloniler ve primerlerin pCR8_F1 ve pCR8_R1 (Tablo 2) kullanılarak koloni PCR ile kontrol edin.
    1. reaktiflerin bir ana karışımı olun. Örneğin, bakınız Tablo 3.
    2. Bir koloni seçin ve bir PCR tüp dibine onu yayma ve daha sonra spektinomisin ile 2 ml LB içine koloninin kalıntılarını koymak(50 ug / ml). koloniye ile tüpe ana karışımı 15 ul yerleştirin.
    3. Aşağıdaki PCR programını çalıştırın (Tablo 4)
    4. elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde PCR (tüm birimi çalıştırın) kontrol edin. Doğru klonlar, beklenen boyutta bir bant gibi bir yayma ve bantların bir merdiven olacaktır. Uygun smear örneği için 34,33 bkz.
    5. bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün.
  6. üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep.
  7. Sıra pCR8_F1 ve pCR8_R1 ile TALEN dizisini kontrol etmek için. Daha önce tarif edilen metotlar 35 izleyin.
  8. dizisi ile doğrulandı doğru klonlar kullanarak, hedef vektörü içine A ve B vektörleri ve son RVD gelen RVDs yerleştirir reaksiyon 2. (TALEN kiti) kurmuştur.
    1. Reaksiyonun 2 (Tablo 5) karışımı hazırlayın.
      Not: HaEğer reaksiyonları kullanılabilir.
    2. Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 37 ° C / 10 dk + 16 ° C / 15 dk + 37 ° C / 15 dk + 80 ° C / 5 dk.
  9. Tepkiler Transform.
    1. Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü.
      1. kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Isıtma 42 ° C'de 30 saniye boyunca hücrelerin şok.
      2. buz üzerinde tüpler yerleştirin. SOC 125 ul ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C 'de çalkalayıcı bir inkübatör içinde tüpler yerleştirin.
    2. Plaka ampisilin (100 ug / ml), X-gal ve IPTG ile LB levhaları üzerine dönüştürülmüş hücreler 100 ul. 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün
  10. Her reaksiyon için 1-3 Beyaz koloniler ve koloni PCR ile primerler TAL_F1 kullanarak TAL_R2 (Tablo 2) ile kontrol edin.
    1. polimeraz master, su ve primer olarak bir çözeltisini yapmakTablo 3'te tarif edilmiştir. Bir koloni almak ve bir PCR tüpünün dibine smear ve ampisilin (100 ug / ml) ile 2 ml LB içinde koloninin kalıntılarını koydu. koloni tüpe çözeltisi 15 ul koyun.
    2. PCR programı (Tablo 6) çalıştırın.
    3. elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde PCR edin. Doğru klonlar bulaşmasını ve bantların bir merdiven olacak. Uygun smear örneği için 34,33 bkz.
    4. bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün.
  11. üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep.
  12. Dizi TAL_F1 ve TAL_R2 daha önce tarif edilen metotlar 35 aşağıdaki TALEN sekansını kontrol etmek için.

Talens 3. mRNA transkripsiyonunu

  1. 37 ° C'de 2 saat boyunca 2 ul Sac I ile dizi-belirlenmiş şablon 4 ug Digest.
  2. Elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde Sac I ile sindirilmiş plasmid 2 ul çalıştırın. Doğru sindirilir Plazmidler tek bant gösterecektir.
  3. PCR saflaştırma kiti protokolü sonra, kalan Sac I ile sindirilmiş plasmid saflaştırılır. Elüsyon önce yıkama çözeltisi ile iki kez yıkanır. nükleaz içermeyen su 30 ul içinde yıkayın.
  4. T3 mRNA üretimi için standart bir protokol izleyin.
    1. Lineerleştirilmiş şablonun 0.5 mikrogram ile yarım reaksiyonları kurmak (yukarıda hazırlanan). 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. DNase (kiti içinde bulunur), 0.5 ul ilave edin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Üreticinin talimatlarını izleyerek mRNA arındırın. 30 ul nükleaz içermeyen su içine Zehir.
  6. mRNA kontrol etmek için elektroforez ile% 1.5 agaroz jel çalıştırın.
    1. RNaz kontaminasyonu ortadan kaldırmak ve% 1.2 jel hazırlamak için bir ürün ile jel aparat temizleyin.
    2. Karışım 1 ul mRNA + 4-# 181; l nükleaz içermeyen su + 5 ul glioksil yükleme boyası. 30 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin. jel çalıştırmadan önce buz üzerinde santrifüj tüplerine kısaca ve yer.
  7. nükleik asit konsantrasyonlarının ölçülmesi için bir yöntem kullanarak yoğunlaştırma kontrol edin ve -80 ° C'de parçalar halinde saklayın RNA. RNA / dondurulmuş birden fazla çözülmüş değildir, öyle ki, bir kısım boyutu seçin.
    Not: 500-1000 ng konsantrasyonlar / nl genellikle elde edilir. RNA bütünlüğü korunur (a bant yerine jel üzerinde yayma tarafından değerlendirilir) daha düşük bir konsantrasyonda RNA sürece kullanılabilir.

TALEN mRNA ile 4. enjekte Astyanax mexicanustan Embriyolar

  1. Enjeksiyon için Araçlar hazırlayın.
    1. bir petri içine balık su (sodyum bikarbonat ve deniz tuzu pH 7.4 ve iletkenlik 700 mS ile şartlandırılmış su)% 1.2 agaroz dökerek enjeksiyon plakaları dökün. balık kuyu olmak için çıkıntılar olan bir kalıbın (plastik parça yerleştirinçanak içinde yumurta). 4 ° C'de agaroz sertleşmiş kalıp ve mağaza çıkarın. Kalıpta ayrıntılar 36 için bkz.
    2. üreticinin talimatlarına göre bir iğne çektirmenin kullanarak enjeksiyon için iğne çekin.
      Not: Uygun iğne uzunluğu enjeksiyonlar için önemlidir. çok uzun olan iğneler enjeksiyonlar için çok esnek olacaktır. çekerek iğne protokol iğneler çekmek için kullanılan ekipman ile değişecektir. Uygun bir iğne bir örnek bizim ekipman için, uzunluğu 5-6 cm iğne çekin. Şekil 1'de gösterildiği ve kırıldığı zaman yaklaşık 0.011 mm ucunda bir dış çapa sahip olduğu. Ancak, iğneler açılış genişliğini belirlemek için (adım 4.3.4) kalibre edilmelidir. Iğneler çekmek için bir örnek program Tablo 7'de bulunabilir.
    3. bir yumurta geçmesine açılış yeterince büyük ve böylece pipet kırarak embriyo transferi için cam pipetler hazırlayın. kırık ucu kadar Alevartık keskindir.
      Not: A. ile çalışırken cam pipetler ve cam kase kullanmak önemlidir mexicanustan yumurta ve embriyo onlar yapışkan ve plastik uyacaktır olarak.
  2. 1-hücreli Sahne Yumurta toplayın.
    1. Irk A. mexicanustan standart protokoller 37 Aşağıdaki.
      Not: Örneğin, balık 14 ışık tutulur eğer: 10 karanlık döngüsü ve ışıklar kapalı olarak ve ZT14 ışıkları olarak ZT0 ile Zeitgerber zaman (ZT) kullanılarak, ZT15 ve ZT19 tarihleri ​​arasında yüzey balık yumurtlamak. Tam yumurtlama zamanı her laboratuar için tespit edilmelidir.
    2. çiftleşme öncesi 3-4 gün balık fazla besleme ve taze suya balık koyarak yumurtlama neden olur. Sıcaklık 2 ° F kaldırın. Not: Bizim ilk su sıcaklığı yaklaşık 74 ° F.
    3. 1 hücre aşamada yumurta elde etmek için her 15 dakikada kontrol karanlıkta yüzey balık yumurta toplamak. yumurta yüz yüzeyi balık tek bir çift elde edilebilir.
    4. Toplamakcam kase yumurta plastik yüzeylere yapışmasını önler ve sıralama mikroskop altında yumurta gözlemleyerek ve tek bir hücre olan yumurta toplama yoluyla enjeksiyondan önce 1 hücre aşamasında embriyoların izole etmek. (PH ve iletkenlik için işlem görmüş yetişkin balıklar yer aldığı bir hazne suyu,), taze sistem suda yumurta tutun.
  3. TALEN mRNA enjekte.
    1. toksisite ve etkinlik TALEN çift değişir gibi enjeksiyon için uygun konsantrasyonu belirlemek için toplam mRNA (çiftteki her talen eşit miktarlarda) farklı miktarlarda enjekte edilir. 400-800 pg olan toplam mRNA konsantrasyonlarını enjekte ederek başlayın. Seyreltilir ve 1.5 NL enjekte edilmesi için istenen konsantrasyonlara mRNA birleştirir.
    2. Yük iğnenin arkasına mRNA seyreltilmiş ve bir mikro-enjektöre iğneyi takın.
    3. forseps kullanarak iğne kırın.
    4. iğne kalibre edin. Örneğin, 10 kez çıkarma ve bir mikro kapiller gerilemesi toplar. 10 x 100 atılabilir 1.081 l, 32 mm mikro kılcal, damla 1.5 nl / 1 enjeksiyon için 0.5 mm mikro kılcal doldurmalıdır. Gerektiğinde enjeksiyon zamanı ve basıncını ayarlayın.
    5. tek hücre içine iğne takın ve mRNA enjekte edin. değil sarısı içine, hücre içine doğrudan mRNA enjekte edilir.
    6. cam kase enjekte embriyolar toplayın. 23-25 ​​° C embriyolar tutun. ölü embriyolar düzenli enjeksiyonu takiben ilk birkaç gün için (bulutlu ve düzensiz şekilli hale embriyolar) çıkarın. kontrol (uninjected) ve enjekte edilen levhalardan ölü ve deforme embriyoların rekor numaraları.
      Not: Artan mRNA konsantrasyonu artmış toksisite ve embriyo deformite / ölüme yol açabilir. Bu nedenle, randıman karşı toksisiteyi enjekte mRNA iyi konsantrasyonunu belirlemek için dengelenmelidir.

5. Fenotip Kurucu Balık ve TALEN Verimliliği değerlendirin

  1. kurumsal hayvan protokole göre embriyolar Kurban.
    Not: euthanizeHızlı tarafından embriyolar buz üzerinde ürpertici.
  2. Bir transfer pipet kullanarak 0,8 ul PCR şerit tüpler içine embriyolar toplayın.
    Not: Genotiplendirme bireysel embriyolar veya embriyoların havuzları üzerinde gerçekleştirilebilir.
  3. DNA ayıklayın.
    1. 100 ul 50 mM sodyum hidroksit (NaOH) içine yerleştirin embriyolar 4 ° C'ye soğutun, 30 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin.
    2. 1 M Tris-HCI pH 8 1/10 hacmi (10 ul) eklenir.
  4. Adım 1.3 tasarlanan primerler (örnek protokoller için masalar 8 ve 9 bakınız) kullanarak bölgede bir PCR gerçekleştirin. Bireysel embriyolar için DNA 1 ul PCR reaksiyonu için yeterlidir.
  5. uygun kısıtlama enzimi ile elde edilen PCR ürünü sindirimi ve elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde çalıştırıldı.
    1. Örneğin, enjekte edilen embriyolar okülokütanöz albinizm 2 (OCA2) odağı genotipleme için 0 ekleyerek kısıtlama enzimi Bsr kullanıyorum PCR ürünü sindirmek2 saat boyunca 65 ° C'de inkübe tamamlanmış PCR reaksiyonunun 12.5 ul e BSR doğrudan I .5 ul. sindirilmemiş ve bir jel üzerinde sindirilmiş ürünü çalıştırın. Kısıtlama enzimi dayanıklı grupları (yani, sindirimi olmayan bantları) TALEN kaynaklı mutasyon mevcut olan (Şekil 2) olduğunu göstermektedir.
  6. (İsteğe bağlı), daha önce tarif edildiği gibi 29 Her bir bandın şiddeti değerini hesaplamak için jel analizi alet Fiji 38 jel görüntüleri analiz ederek kesilmemiş ürünün yüzdesi belirlenerek yüzde mutasyon oranını hesaplar.
  7. Ta jel ile saflaştırılmıştır sınırlama enzimi dirençli mutant bandını klonlamak ve klonlar, dizileme ile mutant alleli dizisini belirlemek.
    1. Jel kısıtlama üreticinin talimatlarına aşağıdaki dirençli mutant bant enzim arındırmak. TA üreticinin talimatlarına aşağıdaki bant klonlamak. koloniler ve çalkalama 37 ° C'de 1.5 ml LB O / N büyümekinkübatör.
    2. Üreticinin talimatları izleyerek Miniprep kültürleri. sıralaması için DNA gönder.
    3. Böyle maymun gibi bir program kullanarak, vahşi tip dizisine mutant dizileri aynı hizaya getirin.
      1. Kopyala ve APE dosyaları içine de dizileri yapıştırın. "Araçlar" menüsünden "Align İki Diziler" aracını seçin.
      2. Açılır menüleri kullanarak iki DNA dizilerini belirtin.
        Not: klonlanmış dizinin ters tamamlayıcı PCR klonlama vektörü içine çıktı yönüne bağlı olarak kullanılabilir gerekebilir. dizileri hizalamak yoksa, "Align DNA" kutusuna "Rev-Com" kutusunu işaretleyerek adımları tekrarlayın.
  8. Uygun aşamada fenotipleri ve beklenen fenotip 29 için uygun yöntemler (Örneğin, Şekil 3) kullanarak kurucu balık değerlendirin. fenotipleme yöntemleri protoc kullanılarak araştırmacı tarafından hedeflenen gen için beklenen fenotipin dayanacaktırol.

Germline İletimi için 6. Ekran

Not: A. mexicanustan 4-8 ayda cinsel olgunluğa erişirler.

  1. vahşi tip balık cinsel olgunluğa kurucu balık çapraz.
  2. Ekran embriyolar veya adımlar 5,1-5,7 yöntemleri kullanarak yetişkin balık (Şekil 4). Yetişkin balıklar için, kuyruk parçası anesthetization aşağıdaki kesilebilir.
    1. fin kırpma sırasında baskıyı azaltmak için tricaine (3-aminobenzoik asit etil ester) içindeki bir çözeltisi içinde balık daldırarak balık anestezisi. fin kırpma ardından, balık taze suya kurtarmak için izin verir. Balık hızla kurtarmak; onlar (normalde yüzme) iyileşene kadar gözleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

TALEN çifti enjeksiyonlar (NHEJ) birleştiren homolog olmayan uç boyunca tamir edilebilir iki iplikçikli sonları 39 ile sonuçlanan, dolayısıyla Foki etki dimerizasyonunu spesifik DNA nükleotidini RVDs bağlanması ve sonuçlanır. NHEJ sık sık ekleme veya çıkarma (indeller) neden hataları tanıttı. Indeller TALEN hedef bölgesini çevreleyen bölgenin amplifiye edilmesi ve TALEN aralayıcı bölge içinde kesen bir sınırlama enzimi ile elde edilen amplikon sindirilmesi ile tespit ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Büyük adımlar özelliklerin evrim genetik temelini anlamaya yönelik son yıllarda yapılmıştır. Özellikleri, bir dizi evrimi yatan aday gen belirlenmişse de, bunun nedeni en evrimsel ilginç türlerinin genetik tractability eksikliği, in vivo olarak, bu genlerin test etmek zor kalmıştır. Burada A. genom düzenleme için bir yöntem raporu mexicanustan, bir tür mağara hayvanların evrimi incelemek için kullandı. Genetik haritalama 1,21,23 çalışmaları ve aday gen A mağara şeklinde öze...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Genetik, Kalkınma ve Hücre Biyolojisi ve Iowa State Üniversitesi Bölümü tarafından ve NIH hibe EY024941 (WJ) .Dr tarafından finanse edildi. Jeffrey Essner el yazması üzerine yorum sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman< / güçlü >
Thermocycler
Enjeksiyon istasyonu
Jel aparatı
İğne çektirme
Nanodrop
Adı< / güçlü >< güçlü> ŞirketKatalog NumarasıComments<
strong>Supplies
Not: Bildiğimiz kadarıyla, aksi belirtilmedikçe
Golden Gate TALEN ve TAL Efektör Kiti 2.0AddgeneKit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granül)FisherBP9724-500
Fisher BioReagents Mikrobiyoloji Ortamı: LB Et Suyu, MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15 in %50 EtOHTeknova (Fisher aracılığıyla sipariş edilir)50-843-314
Spektinomisin Dihidroklorür, Fisher BioReagentsFisherBP2957-1
Süper Ampisilin (1.000x çözüm)DNA Teknolojileri6060-1
ThermoScientific X-Gal Solüsyonu, kullanıma hazırThermo Sci Fermentas Inc (Fisher aracılığıyla sipariş)FERR0941
IPTG, Fisher BioReagentsFisherBP1620-1
Petri kaplarıFisher08-757-13
BsaINew England Biolabs (Fisher aracılığıyla sipariş edildi)50-812-203BsaI-HF değil BsaI kullanın (Golden Gate TALEN ve TAL Efektör Kiti protokolünde açıklandığı gibi)
BSANew England Biolabskısıtlama enzimleri
10x T4 ligaz tamponuPromega (Fisher aracılığıyla sipariş edilir)PR-C1263
GoTaq Green Master karışımıPromega (Fisher aracılığıyla sipariş edilir)PRM7123Diğer Taq kullanılabilir, ancak reaksiyon buna göre ayarlanmalıdır
Hızlı ligasyon kitiNew England Biolabs (Fisher aracılığıyla sipariş edildi)50-811-728Tüm TALEN montaj reaksiyonları için Quick Ligase kullanıyoruz
One Shot TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E.coliInvitrogenC4040-06Diğer kimyasal olarak yetkin hücreler veya ev yapımı yetkin hücreler kullanılabilir
Esp 3IThermo Sci Fermentas Inc (Fisher aracılığıyla sipariş edilmiştir)FERER0451
Plazmid Güvenli ATP'ye bağımlı DNazMerkez Üssü (Fisher aracılığıyla sipariş edilir)NC9046399
QIAprep Spin Miniprep KitiQiagen27106Qiagen kiti, ilk plazmit hazırlığı için kullanılmalıdır (Golden Gate TALEN ve TAL Efektör Kiti protokolünde açıklandığı gibi)
QIAquick PCR Saflaştırma KitiQiagen28104
GeneMate LE Hızlı Çözünen AgaraoseBioExpressE-3119-125
Sac IPromega (Fisher aracılığıyla sipariş edildi)PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transkripsiyon kitiAmbionAM1348M
Rneasy MinElute Temizleme KitiQiagen74204
NorthernMax-Gly Numune Yükleme Boyası Ambion (Fisher aracılığıyla sipariş edildi)AM8551
EliminaseDecon (Fisher aracılığıyla sipariş edildi)04-355-32
Fisherbrand Tek Kullanımlık Soda-Kireç Cam Pastör PipetleriFisher13-678-6B
Standart Cam Kılcal DamarlarDünya Hassas Aletler1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
Eppendorf Femtotips Femtojet Mikroenjektör Eppendorf için Mikro YükleyiciUçları (Fisher aracılığıyla sipariş edilir)E5242956003
Sodyum hidroksitFisherS318-500
Tris tabanıFisherBP152-1
farklı şirketlerden gelen malzemeler kullanılabilir edildi, ile sağlanmıştır

Kaynaklar

  1. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
  2. Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
  3. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  4. Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
  5. Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
  6. Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
  7. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  8. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  9. Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
  10. Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105(2012).
  13. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  14. Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
  15. Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
  16. Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
  17. Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
  18. Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
  19. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  20. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
  21. Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).
  22. Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108(2012).
  23. Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281(2013).
  24. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
  25. Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
  26. Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
  27. Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
  28. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823(2013).
  29. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).
  30. Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
  31. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).
  32. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  33. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).
  34. Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
  35. Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
  36. Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
  37. Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  39. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
  40. Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647(2014).
  41. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307(2014).
  42. Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  43. Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
  44. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  45. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  46. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  47. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TALEN Genom D zenlemeGen MutasyonuEmbriyo EnjeksiyonumRNA Haz rlamaPCR AnaliziRestriksiyon SindirimiFenotipik AnalizOCA2 GeniEvrimsel Biyoloji
genom Düzenleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.