Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Özet

Fotostabil siyanin boyaları, enerji transferi ile hibridizasyonun izlenmesi için oligonükleotidlere bağlanır.

Özet

Bu protokol, 2'-alkin sentezi için bir yöntem olup, standart fosforamidit kimyası kullanılarak otomatik katı faz sentezi ile deoksiribonükleik asit (DNA) ipliklerini modifiye göstermektedir. Oligonükleotidler sonrası sentetik bakır katalize tıklama kimyası kullanılarak iki yeni ışığa siyanin boyalar ile etiketlenir. Her iki verici ve alıcı boya sentezi tarif edilir ve art arda üç aşamada gerçekleştirilir. Onlar melezleme yoluyla yakın getirildiğinde çevreleyen mimari DNA ile, bu iki boyalar bir enerji transferi uğrar. Bu nedenle, iki tek zincirli DNA şeritlerin tavlama flüoresan renk değişikliği ile görüntülenir. Bu renk değişimi, flüoresan spektroskopisi ile karakterize değil, aynı zamanda, doğrudan bir el ultraviyole (UV) lambası kullanılarak gözlemlenebilir. Çift floresan renk okuma kavramı bu oligonükleotid probları moleküler görüntüleme, özellikle açıklanan pho için mükemmel araçlar yapartostable boyalar kullanılır. Böylece, görüntüleme sondaları ışıkla ağartma önlenir ve biyolojik işlemler daha uzun bir zaman süresi için, gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Giriş

Moleküler görüntüleme canlı hücrelerin içinde biyolojik süreçleri anlamak için temel bir tekniktir. ^1-3 gibi kimyasal-biyolojik uygulamalar için floresan nükleik asit bazlı prob geliştirilmesi genişleyen bir araştırma alanı haline gelmiştir. Bu floresan sondalar hücre görüntüleme için uygun araçlar haline birkaç gereksinimlerini karşılamak gerekir. İlk olarak, uygulanan boya yüksek kuantum verimleri ile floresan sergilemelidir büyük Stokes kaymalar ve en önemlisi, yüksek photostabilities in vivo görüntüleme uzun süreli izin vermek. Ve ikincisi, onlar güvenilir bir floresan okuma göstermelidir. Konvansiyonel kromofor-söndürücü sistemler floresan yoğunlukları basit değişikliklerle tek bir floresan renk okuma dayanmaktadır. ⁴ Bu yaklaşım nedeniyle hücre içi bileşenleri veya düşük sinyal-gürültü oranları otofloresansı yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçların riskini taşımaktadır nedeniyle diğer com tarafından istenmeyen soğutulması içinTüm unsurların. ⁴

Biz son zamanlarda iki farklı kromoforlar kullanarak ikili floresan renk okumalarını gösteriyor "DNA trafik ışıkları" kavramına bildirildi. ^5-6 kavramı floresan değiştirir alıcı boyasına donör boya enerji transferi (ET) dayanmaktadır renk (Şekil 1). Bu daha güvenli bir okuma sağlar ve bu şekilde flüoresan görüntüleme sondaları için güçlü bir araç sunar. floresan boyalar ile oligonükleotid Etiketleme iki farklı yaklaşım ile elde edilebilir. Boyalar mukabil değiştirilmiş fosforamidit yapı taşları kullanılarak bir katı faz üzerinde, kimyasal DNA sentezi sırasında dahil edilebilir. ^7, bu yöntem, standart fosforamidit ve koruma kaldırma koşulları altında stabil olan boyalar ile sınırlıdır. Bir alternatif olarak, sentez sonrasında modifikasyon yöntemleri oligonükleotid kimyasında kurulmuştur. Burada, bizim yeni Fotoğrafların birinde sentezini göstermekmasa enerji transferi çiftleri ^8,9 ve azidler ve alkinlere (CuAAC) arasındaki bakır katalize 1,3-sikloadisyon kullanılarak DNA'nın sonrası sentetik etiketleme. ¹⁰

Protokol

Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. ve bu sentezlerde kullanılan kimyasalların çeşitli zehirli ve kanserojendir. tipik olarak, bir laboratuvar önlüğü giyen emniyet gözlükleri ve eldiven gibi organik kimya laboratuvarlarında, gerekli olan tüm uygun güvenlik uygulamalarını kullanın.

Boyaların 1. Sentezi

. Her iki boya da reaksiyonun aynı türleri tarafından sentezlenebilir 2 Bu reaksiyonların genel bir görünüşünü göstermektedir, Şekil Not:.

1. 1- (3-azidopropil) sentezi -4- (2- (1-metil-1 H-indol-3-il) vinil) piridin-1-yum iyodür (boya 1)
   1. 1- (3-iyodopropil) -4-metilpiridin-1-yum iyodür sentezi (Şekil 2A, aşama a)
      1. Eritin 466 mg kadar 4-pikolin ve 5.91 g 20 mi tepe boşluğu cam şişede, 10 ml asetonitril 1,3-Diiyodopropan ve bölmeli kapak ile sıkıca kapatın.
      2. 16 saat boyunca 85 ° C'ye ısıtın.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir.
      4. Geriye kalan yağa etil asetat ve 20 ml ilave edilir ve 3 dakika için bir 120 W ultrasonik banyoda karışımı tedavi.
      5. süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak ve etil asetat ile beş kere yıkayın. Vakum O / N altında katı ürün kurutun.
   2. 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-yum sentezi (Şekil 2A, Aşama B)
      1. 900 mg 1- (3-iyodopropil) 20 ml bir tepe boşluğu şişede asetonitril 12 ml -4-metilpiridin-1-yum iyodür eritin sodyum azid 376 mg ekleyin ve bir septum kapak ile sıkıca kapatın.
      2. 16 saat boyunca 85 ° C'ye ısıtın.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir.
      4. Kalıntıya 15 ml diklorometan ekleyin.
      5. süzerek çıkarın ve elde edilen çökelti atın.
      6. Bir çürümeyi kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarınli evaporatör kahverengi bir yağ olarak ürün elde edildi.
   3. 1-metil-1 H-indol-3-karbaldehid sentezi (Şekil 2A, Aşama c) '
      1. atıl gaz (argon) altında, bir geri akış kondansatörü ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 50 ml 10 mi saf dimetilformamit içinde 1.45 g indol-3-karbaldehid, 1.52 g potasyum karbonat ve 2.70 g dimetil karbonat çözülür.
      2. 19 saat boyunca 130 ° C de karıştırdıktan.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya buz karışımı dökmek için izin verir.
      4. Sulu tabaka, 150 ml etil asetat ile üç kez ekstrakte edin.
      5. Organik tabakaları birleştirin, su ile yıkama, sodyum sülfat üzerinde kurutun ve bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında 50 ° C'de çözücüyü çıkarın.
   4. Kavrama 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1 H-indol-3-il) vinil) piridin-1-yum iyodür (boya 1) (Şekil 2A, Aşama D)
      1. argon altında ve nem dahil edilmeden çalışır. DissolBir geri akış yoğunlaştırıcısı ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 20 ml 4 mi etanol içinde 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-yum ve 48 mg 1-metil-1 H-indol-3-karbaldehid ve.
      2. 4 saat 80 ° C'de 0.07 ml piperidin ve ısıtılır.
      3. Oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
      4. süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak ve dietileter ile üç kez yıkayın.
      5. Süpernatana dietileter ekleyin ve süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak. dietileter ile üç kez yıkayın.
      6. çökeltiler birleştirin.
2. 1- (3-azidopropil) sentezi -4- (2- (1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-il) vinil) kinolin-1-yum iyodür (boya 2)
   1. 1- (3-iyodopropil) -4-metilkuinolin-1-yum iyodür sentezi (Şekil 2B, aşama a)
      1. Eritin 715 mg kadar 4-metilkinolin ve 5.91 g 20 mi tepe boşluğu cam şişede, 10 ml asetonitril 1,3-Diiyodopropan ve bölmeli kapak ile sıkıca kapatın.
      2. Sıcaklık16 saat boyunca 85 ° C arasındadır.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir.
      4. Geri kalan yağ, etil asetat ile 20 ml ilave edilir ve 3 dakika için bir 120 W ultrasonik banyoda karışımı tedavi.
      5. süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak ve etil asetat ile beş kere yıkayın. Vakum O / N altında katı ürün kurutun.
   2. 1- (3-azidopropil) -4-metilkuinolin-1-yum sentezi (Şekil 2B, adım b)
      1. 900 mg 1- (3-iyodopropil) 20 ml bir tepe boşluğu şişede asetonitril 12 ml -4-metılkuınolın-1-yum iyodür eritin sodyum azid 333 mg ekleyin ve bir septum kapak ile sıkıca kapatın.
      2. 16 saat boyunca 85 ° C'ye ısıtın.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir.
      4. Kalıntıya 15 ml diklorometan ekleyin.
      5. süzerek çıkarın ve elde edilen çökelti atın.
      6. Solvent u kaldırnder kahverengi bir yağ olarak ürünü elde etmek üzere bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç.
   3. 1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid sentezi (Şekil 2B, Aşama C)
      1. atıl gaz (argon) altında, bir geri akış kondansatörü ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 50 ml 10 mi saf dimetilformamit içinde 1.45 g 2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid, 0.996 g potasyum karbonat ve 1.77 g dimetil karbonat çözülür.
      2. 19 saat boyunca 130 ° C de karıştırdıktan.
      3. daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya buz karışımı dökmek için izin verir.
      4. Sulu tabaka, 150 ml etil asetat ile üç kez ekstrakte edin.
      5. Organik tabakaları birleştirin, su ile yıkama, sodyum sülfat üzerinde kurutun ve döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın.
   4. 1- (3-azidopropil) bağlanmak -4- (2- (1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-il) vinil) kinolin-1-yum iyodür (Şekil 2B, adım d) '
      1. arg altında çalışmave nem dahil edilmeden. yuvarlak dipli şişe ile donatılmış bir 20 ml, 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilkuinolin-1-yum ve 59.7 mg 1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid 4 mi etanol içinde çözülür geri akış kondansatörü.
      2. 4 saat 80 ° C'de 0.06 ml piperidin ve ısıtılır.
      3. Oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
      4. süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak ve dietileter ile üç kez yıkayın.
      5. Süpernatana dietileter ekleyin ve süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak. dietileter ile üç kez yıkayın.
      6. çökeltiler birleştirin.

DNA Strands 2. Sentezi

Not: bir DNA sentezleyicisi üzerinde M. Caruthers ¹¹ tarafından tarif edildiği gibi, DNA şerit sentezi, bir katı faz üzerinde fosforamidit yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. synthesizer işleyişi sentetik işlem öncesi test edilir ve reaktif ise yenilenengerekli.

1. Prearrangements
   1. amidite seyreltici (ekstra kuru asetonitril) 1.2 ml ticari olarak temin 2'-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) içinde çözülür. Bir sentezleyici flakon şişe içinde çözüm getirin ve synthesizer içine vida.
   2. Hiçbir argon gazı sızıntısı var olduğundan emin olmak için (üreticinin talimatlarına göre) bir "sızıntı testi" gerçekleştirin. "Sızıntı testi" başarısız olursa, daha sıkı şişede sıkın.
   3. Katı Faz Sentez odasına bağlayan tüp doldurarak Başbakan Cu çözüm.
   4. asetonitril ile tüm satırları yıkayın.
2. DNA iplikçikleri sentezi
   1. Üreticinin protokolden istemleri takip DNA dizisi ve bağlantı yöntemi girmek bağlı bilgisayar kullanın. cu yapı bloğunun birleştirme aşaması geleneksel 7 darbeleri ile 40 sn ile karşılaştırıldığında (her darbe 16 ul olan) 7 darbeleri ile 168 saniye süreryapı taşları olarak fosforamidit.
   2. İlk taban 1 umol değiştirilmiş katı faz olarak CPG (kontrollü gözenekli cam) ihtiva eden bir sütun monte synthesizer (DNA sentezi 5 '' 3 ila gerçekleştirilir).
   3. DNA sentezleyici ¹¹ sentezi başlar.
3. Sentezlenen DNA iplikçiklerinin Çalıştırma
   1. Vakum O / N altında sentezlenen DNA ipliklerini içeren sütunlar kurutun.
   2. sütun açıp bir reaksiyon şişenin içine CPG serbest bırakmak için bir pense kullanın. oligonükleotid korumasını kaldırmak ve CpG DNA teli serbest bırakmak için konsantre edilmiş sulu amonyak çözeltisi 700 ul ekle.
   3. 18 saat 50 ° C'ye kadar şişeyi kapatın ve patlama önlemek için, reaksiyon kabı üzerinde bir güvenlik kapağı uygulanır ve ısı.
   4. 30 dakika boyunca 30 ° C'de indirgenmiş basınç altında (100 mbar) altında santrifüjleme ile amonyağın ayrılması.
   5. CPG gelen filtrasyon başlatın: Santrifüj gemi 11.000 xg fo atR3 Min. üstteki sıvı kısmı alınır ve 0.45 um'lik bir gözenek büyüklüğüne sahip bir santrifüj cihazının içine aktarın. 4 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
   6. Bu sırada 3 dakika boyunca 11.000 x g'de 20 saniye ve santrifüj CpG, girdaba iki kez damıtılmış suyun 300 ul ekle. 4 dakika boyunca 1.000 xg'de santrifüj cihazı ve santrifüj içine süpernatant aktarın. iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın.
   7. 0,1 mbar ve 25 ° CO / H santrifüj Birleştirilen sulu çözeltilerden su çıkarın.

3. "tıklamak" Prosedür

1. (0.1 [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin - 50 ul iki kez damıtılmış su, sodyum askorbat çözeltisi 25 ul (su içinde 0.4 M), 34 | il Tris ekleme DMSO içinde M / tBuOH 3: azid 1), 114 ul (0.01 DMSO içinde M / tBuOH 3: 1) ve bir tetrakis 17 ul (asetonitril) bakır (I) heksaflorofosfat çözeltisi (0.1 DMSO içinde M / tBuOH 3: 1) liyofilize alkin ile modifiye edilmiş DNA örneğine.
2. 1.5 saat boyunca 60 ° C 'de örnek inkübe edin.
3. Oda sıcaklığına soğutun.
4. 150 ul _Na2EDTA (su içinde 0.05 M) ve 10 ml'lik bir tüp DNA numunesi ve transfer 450 ul sodyum asetat (su içinde 0.3 M) eklenir.
5. 10 mi etanol (% 100) ilave edin ve 16 saat boyunca -32 ° C'de saklayın.
6. 15 1000 xg'de dk ve süpernatant kaldırmak için santrifüj gemi.
7. 2 ml soğuk etanol (% 80) ile DNA pelletini yıkayın.
8. indirgenmiş basınç altında kuru pelet.

4. HPLC saflaştırma

Not: ayrılmadan önce DNA ipliklerini HPLC düzgün çalıştığından emin olun, yeterli çözücü mevcuttur ve sütun temiz. tampon / asetonitril başlangıç ​​konsantrasyonu ile sütun durulayın.

1. HPLC şişeye iki defa damıtılmış su ve transfer 250 ul Ham DNA pelet çözülür.
2. boya 1 ve Gradi asetonitril% 15% 0 asetonitril gradyanı ile 45 dakika HPLC çalıştırmak Başlangıç boya 2. asetonitril 17% 0 ile% asetonitril ent 260 nm (DNA emme) ve 459 nm (boya 1) veya 542 nm (boya 2) kontrol ederek koşmak izleyin. Her iki dalga boyu kanalları emilmesini gösteren fraksiyonların toplayın.
3. 3-Hidroksipikolinik asit (3HPA) ve diammoniumhydrogencitrate oluşan bir matris kullanılarak matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi ile şu kütlesi toplanan fraksiyonları edin.
   1. su içinde diammoniumhydrogencitrate çözeltisi (100 g / L), 100 ul asetonitril ve su 1: 1 kanşımı olarak doymuş 3-HPA solüsyonu 900 ul karıştırılarak matrisi hazırlayın.
   2. hedef DNA prob 1-2 ul pipet ve hava kurumaya bırakın.
   3. örnek 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matris 0.2 ul ekleyin ve kristalleşir kadar karıştırın.
   4. MALDI kütle spektrometresi gerçekleştirin.
   5. Doğru kitle sergileyen HPLC kesirler birleştirin.

Konsantrasyon _title "> 5. Belirlenmesi

Not: konsantrasyonu DNA bazları ve boya yok olma katsayıları ₍₂₆₀ ε) göre, bir UV / Vis spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de emilimin ölçülmesiyle belirlenir.

1. çift ​​damıtılmış su, 200 ul - 100 DNA çözülür.
2. UV / Vis spektrofotometre DNA solüsyonu 1 ul uygulayın.
3. 260 nm'de emme ölçün. üç kez tekrarlayın.
4. çözeltinin konsantrasyonunu hesaplamak için, ortalama değer alır. Yok olma katsayılarının hesaplanmasında, bütün DNA ipliğinin ε _260nm elde etmek için dört doğal bazlar ¹² ε _260nm ve (doğal üridin olarak kabul edilir) satın alınan yapı bloğu CU ε _260nm ¹² kullanın. Boya 1, kullanım ε _260nm = 10200 L * mol ^-1 * ^cm-1 ve boya 2, kullanım ε _260nm = 13100 L * mol ^{-1 * cm -1. Yok olma katsayıları ve ölçülen absorbans dayalı Lambert-Beers 'hukuk aşağıdaki çözeltisinin konsantrasyonu hesaplayın. 13}

6. Numune Hazırlama ve Spektroskopi

1. Tek iplikli örneklerinin hazırlanması
   1. 200 mM NaCl, 50 mM NADP _tampon içinde tadil edilmiş DNA1 ve DNA2 her 2.5 uM çözeltilerinin ayrı ayrı 1 mi, pH = 7 hazırlayın.
2. Çift iplikli örneklerinin hazırlanması
   1. Bir reaksiyon kabı içinde, 200 mM NaCI, 50 mM NADP _i tampon maddesi, pH = 7 DNA2 2,5 DNA1 uM ve 2.5 uM ihtiva eden bir çözelti, 1 ml hazırlayın.
   2. 10 dakika boyunca 90 ° C'ye kadar güvenli bir kap ve ısı ile kapağı elde edin. Sonra ısıtma kapatın ve RT O / N soğumaya bırakın.
3. absorpsiyon spektroskopisi
   Not: floresan spec için dalgaboyu belirlemek içinSpektroskopisi absorpsiyon spektrumları kaydedilir.
   1. Tek iplikli ölçümleri
      1. 200 mM NaCI, 50 mM NADP _i tampon maddesi, pH = 7 ihtiva eden boş bir ölçüm kaydedilir.
      2. 1 cm kuvars cam küvet içinde DNA1 hazırlanmış çözeltisini ve emilimi kaydedin. Boş veri karşı ölçümü düzeltin. boya emilimi maksimum değerini belirler.
      3. DNA2 için tekrarlayın.
4. floresans spektroskopisi
   1. Tek iplikli ölçümleri
      1. 200 mM NaCI, _I tampon, 50 mM NADP ihtiva eden boş bir ölçüm kaydedin, pH = 7; boya 1 eksitasyon dalga boyu kullanılarak.
      2. 1 cm kuvars cam küvet içinde DNA1 çözeltisini.
      3. floresan spektrumu kaydedin.
   2. Çift iplikli ölçümü
      1. Bir kuvars cam küvet içinde çift iplikli çözüm aktarın.
      2. boya 1 dalgaboyu kullanılarak floresan spektrumu kaydedin.
5. görselleştirme deneyleri
   Dikkat: Uygun göz koruması Gözleri UV hasarını önlemek için giyilmelidir!
   1. Kaydedilen spektrumları gösteriyor ne daha iyi bir anlayışa el UV lambaları (Şekil 5) ile küvetler ışın tedavisi için. çift ​​sarmallı DNA'ya tek floresan renk değişikliği dikkat edin.

Sonuçlar

Şekil 4'te gösterildiği gibi, tek ve çift sarmallı DNA emme ve floresan spektrumu kaydedilir.

Kaydedilen absorpsiyon spektrumları (Şekil 4, sağ) tek şeritli DNA1 (boya 1) ve tek şeritli DNA2 (boya 2) için 546 nm 465 nm dalga boyunda göster emme maksimumları λ _maks. Tavlanmış DNA1_2 (boya 1 ve boya 2) 469 nm ve 567 nm hem de maksimumu gösterir. Her iki absorpsiyon bir batokromik vard...

Tartışma

Bu protokol azid modifiye floresan boyalar ile CuAAC aracılığıyla DNA sonrası sentetik etiketlemek için tam bir işlemi göstermektedir. Bu boyalar ve alkin ile modifiye edilmiş DNA sentezini ve etiketleme işlemi içermektedir.

Boyaların sentezi dört adımları izler. Tüm ürünler nedeniyle pozitif yük için oldukça basit bir çökeltme ile elde edilebilir ve zaman alıcı kolon kromatografisi gereklidir. merkezi bağlantı adımlar önce azid işlevleri tanıtımı dört yerine beş ardışık reaksiyon adımları b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
synthesis
4-Picoline	Sigma Aldrich	239615
1,3-Diiyodopropan	Sigma Aldrich	238414
Asetonitril	Fisher Scientific	10660131	HPLC sınıfı
Etil asetat	Fisher Scientific	10456870	teknik sınıf
Sodyum azid	Sigma Aldrich	71290	pa sınıfı
Diklorometan	Fisher Bilimsel	10626642	teknik sınıf
İndol-3-karboksaldehit; % 98	ABCR	AB112969
Potasyum karbonat, % 99+	Acros	424081000
dimetilkarbonat	Sigma Aldrich	517127
N, N< / em>-Dimetilformamid, % 99,8, Moleküler Elek	Acros	348435000
Sodyum sülfat	Bernd Kraft	12623.46
Etanol, %99,5	Akros	397690010
Piperidin, %99	Acros	147181000
Dietilether	Fisher Scientific	10407830	teknik sınıf
2-Fenilindol-3-karboksaldehit; %97	ABCR	AB125050
4-Metilkinolin	ABCR	AB117222
DNA sentezi
Expedite 8909 Nükleik Asit Sentezleyici	Uygulamalı Biyosistemler	-
DMT-dA(bz) Fosforamidit	Sigma Aldrich	A111081
DMT-dT Fosforamidit	Sigma Aldrich
DMT-dG(dmf) Fosforamidit	Sigma Aldrich	G11508
DMT-dC(bz) Fosforamidit	Sigma Aldrich	C11108
DNA sentezi için Amidit Seyreltici		Sigma Aldrich
Ultra Saf Asetonitril	Sigma Aldrich	L010400
Cap A	Sigma Aldrich	L840000
Cap B	Sigma Aldrich	L850000
CPG dT Sütun 1.0  &mikro; köstebek	Proligo Reaktifleri	T461010
CPG dA(bz) Sütun 1.0  &mikro; köstebek	Proligo Reaktifleri	A461010
CPG dG(ib) Sütun 1.0  &mikro; köstebek	Proligo Reaktifleri	G461010
CPG dC(bz) Sütun 1.0  &mikro; mol	Proligo Reaktifleri	C461010
amonyak (sulu çözelti)	Fluka Analitik	318612
santrifüj cihazları nanosep 0.45  &mikro; m	Pall	ODGHPC34
5- (Benziltio) -1H-tetrazol (Aktivatör)	Sigma Aldrich	75666
2'-O-propargil deoksiuridinfosforamid	Kimyasal Genleri	ANP-7754
workup
>vakum yoğunlaştırıcı	Christ
tıklama prosedürü
Tetrakis (asetonitril) bakır (I) heksaflorofosfat	Sigma Aldrich	346276
Sodyum asetat	Sigma Aldrich	S2889
(+) - Sodyum L-askorbat	Sigma Aldrich	A7631
EDTA disodyum tuzu	Sigma Aldrich	E5134
TBTA-ligand	-	-	bir literatür prosedürüne göre sentezlenmiştir1
HPLC
HPLC-system	Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spektrometresi	Bruker Daltonics
LC-318 sütunu	Sigma Aldrich	58368
konsantrasyon tayini
ND 1000 Spektrofotometre	nanodrop
numune hazırlama ve spektroskopi
Cary 100 Bio	Varian
Fluoromax-3 florimetre	Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.