Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Özet

Burada, naif ve kronik lenfositik koryomenenjit virüsü ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T (T_reg) hücrelerinin fenotipini analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, T_reg hücrelerinin baskılayıcı aktivitesini değerlendirmek için bir süreç sunuyoruz.

Özet

Bir transkripsiyon faktörü olarak Foxp3 ifade eden düzenleyici T (T _reg) hücreleri, CD4 ⁺ T hücrelerinin alt kümeleridir. T _reg hücreleri bağışıklık yanıtını düzenleyerek immün tolerans ve homeostasis bakım çok önemli rol oynarlar. _Regülatör T hücrelerinin temel görevi efektör T (T _EFF) hücrelerinin çoğalması ve IFN-y, TNF-a ve IL-2 gibi sitokinlerin üretimini baskılamaktır. T _eff hücrelerin fonksiyonunu inhibe _regülatör T hücrelerinin yeteneği inatçı bir patojen enfeksiyon ve kanser gelişimi sırasında gelişmiş olduğu gösterilmiştir. Dinlenme veya iltihaplı koşullar altında _regülatör T hücrelerin fonksiyonunu fare ya da insan _regülatör T hücreleri kullanılarak in vitro bastırma edilen çeşitli testler öne sürülmüştür değerlendirmektir. Bu çalışmanın temel amacı, fenotip ve dinlenme arasındaki baskılayıcı fonksiyon farklılıkları ve aktive olmuş T _reg karşılaştırmak için bir yöntem geliştirmektirHücreler. Aktive T _reg hücreleri izole etmek için, fareler, lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) klon 13 (CL13) ile LCMV kronik zorlanma enfekte edildi. LCMV CL13-enfekte edilen farelerin dalak izole _regülatör T hücreleri naif farelerden izole edilen _regülatör T hücreleri dinlenme ile karşılaştırıldığında aktive fenotip ve geliştirilmiş baskılayıcı aktivitesini sergiledi. Burada, T _reg hücrelerini dinlenme aktive T _reg hücreleri ayırt etmek ex vivo fenotip analizi için temel protokol açıklar. Ayrıca, tam olarak aktif _regülatör T hücrelerin baskılayıcı aktivitesi ölçümü için bir protokol açıklar.

Giriş

Düzenleyici T (T _reg) hücreleri kendi gelişimi ve işlevi ¹ için bir transkripsiyon faktörü olarak forkhead kutusu P3 (Foxp3) ifade eder. Buna ek olarak, _regülatör T hücreleri, CD25 ^2, lenfosit aktivasyonu geni 3 (ara-3) ^3, glukokortikoitin yol açtığı tümör nekroz faktörü reseptör ^4, ve sitotoksik gibi çeşitli başka molekülleri ifade T-lenfosit-ilişkili protein 4 (CTLA-4) ^'5 yüzeylerinde ya da hücre içi bölgeye. Bu tür virüsler ^6,7, bakteriler ^8,9, ve parazitler ^10-12 veya kanser gelişimi ^13,14 sırasında olduğu gibi patojenlerin çeşitli kronik enfeksiyon sırasında, T _reg hücreleri gelişmiş baskılayıcı fonksiyon gösteren, aktif hücrelerin içine ayırt hale hedefleme efektör CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücreleri. Kağıtların bir dizi genişletilmiş ve aktive _regülatör T hücreleri, bozulmuş CD8 ⁺ T hücresi yanıt vermeyen katkıda sürmüşlerdirarkadaş retrovirüs (FV) enfeksiyonu ^15-17 sırasında e. FV kaynaklı _regülatör T hücrelerinin IFN-y ya da Granzim B ekspresyonu ve CD8 ⁺ T hücrelerinin ^15-17 sitotoksik reaktivite inhibe eder. Ayrıca, bir herpes simpleks virüsü enfeksiyon modelinde, bu virüse spesifik CD8 ⁺ T hücreleri ve immünopatojenik CD4 ⁺ T hücrelerinin ^18-20 infiltrasyonu ile ciddi doku hasarının genişleme sonuçlandı CD4 ⁺ CD25 ⁺ _regülatör T hücrelerinin tükenmesinin bildirilmiştir.

Lenfositik koryomenenjit virüsünün klon 13 suşu ile kronik olarak enfekte olan fareler (LCMV CL13) ^21-24 yaygın kronik virüs enfeksiyonu esnasında efektör T hücrelerinin _(EFF) ve _regülatör T hücrelerinin fenotip ve işlevini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Kalıcı LCMV enfeksiyonunun sırasında virüs spesifik T _EFF hücreleri kademeli olarak efektör fonksiyonunu kaybeder ve tükenmiş T (T _exh) hücreler haline gelirler. Diğer yandan, T_REG hücreleri virüs-belirgin T hücre tepkisine ²⁵ önleme yeteneklerinden güçlendirir. T _eff hücrelerinin çalışması kapasitesinde azalma, T _eff hücreleri üzerinde inhibe edici reseptör artışı, antijen-sunan hücrelerin değişmiş fonksiyonu, bağışıklık sitokinlerin üretimi ve artan frekans veya _regülatör T gelişmiş fonksiyonu olarak çeşitli faktörler tarafından açıklanabilir hücreler ^26. T hücresi bastırılmasıyla ilgili faktörler arasında, programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) -expressing T _exh hücreleri ve _regülatör T hücreleri yaygın antijene kalıcılık ve baskılayıcı çevre işaretlerinden olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu T _reg hücrelerinin PD-1 yolunun ve ablasyon abluka gelişmiş T hücre fonksiyonuna neden olduğunu bildirdi ve LCMV kronik enfeksiyon ²⁷ sırasında viral yük azaltıldı. Ayrıca, _regülatör T hücreleri LCMV ^23,25 ile farelerin kronik enfeksiyon sırasında aktive edilir ve baskılayıcı fonksiyonu ²⁵ güçlendirilmiştir. PD-1 yüksek _regülatör T hücreleri hem de T _exh hücre ifade edilir, ve PD-1 _regülatör T hücreleri tarafından ifade seviyesi, T hücre proliferasyonunu ²⁵ inhibe etme baskılayıcı fonksiyonu gücü ile ilişkilidir.

Burada, LCMV CL13 ve naif farelerden izole dinlenme T _reg hücreleri ile enfekte edilen farelerin izole aktive T _reg hücrelerinin özelliklerini karşılaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, aktive edilmiş T-hücrelerinin ayrılmasında _reg ve ex vivo fenotipi incelenmesi, hem de in vitro olarak da bastırma etkinliğini ölçmek için bir dizi işlemden açıklar.

Protokol

Bu çalışmada, fareler Yonsei Üniversitesi Yonsei Laboratuar Hayvan Araştırma Merkezi belirli bir patojen içermeyen tesiste muhafaza edildi. Tüm hayvan deneyleri Yonsei Üniversitesi Yonsei Laboratuar Hayvan Araştırma Merkezi Uluslararası Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri kullanarak Kore Gıda ve İlaç İdaresi kurallarına uygun olarak yapılmıştır.

Çözümler 1. hazırlanması

1. RPMI içinde% 1% 2 ve penisilin-streptomisin fetal sığır serumu (FBS) seyrelterek% 2 RPMI ortamı hazırlamak
2. tam RPMI ortamı hazırlayın. RPMI ortam FBS% 10, penisilin-streptomisin,% 1 L-glutamin,% 1 ve 50 uM 2-merkaptoetanol ekleyin.
3. flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) tamponu hazırlayın. FBS% 2 ile çok, ek fosfat tamponlu tuz (PBS) yapmak için.
4. T hücre izolasyonu tampon hazırlayın. Bunu yapmak için, FBS% 2 ve 2 mM ethylenediaminetetraa PBS ile ekasetik asit elde edildi.

Splenik Lenfositler 2. izolasyonu

1. Daha önce tarif edildiği gibi ¹⁹ saf ya da LCMV CL13 enfekte farelerden dalak çıkarın ve% 2 RPMI ortam, 10 ml ihtiva eden x 15 mm'lik Petri kaplara 60 mm koyun.
   NOT: Bu çalışma deneylerde, 5, 6 haftalık için C57B1L / 6J dişi fareler kuyruk veninden intravenöz enjeksiyon yoluyla LCMV CL13 2 x 10 ⁶ plak oluşturucu birim (pfu) aldı. Gün 16 sonrası enfeksiyon (16 d pi) ²⁵ fareler Kurban. Analiz ge-uyumlu naif fareler aynı gün idi.
2. 50 ml'lik bir tüp içine, bir hücre süzgeci yerleştirin ve% 2 RPMI ortam, 2 ml ile durulayın. 70 mikron hücre süzgecinden üzerinde dalak yerleştirin ve bir şırınga pistonu kullanarak eziyet. % 2 RPMI ortam 2 ml hücre süzgecinden yıkayın ve 50 ml'lik bir tüp çıkarın.
3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de% 2 RPMI ortam ve santrifüj tüpü doldurmak. Süpernatantı atın ve tekrar süspansiyonACK yokedici tamponda 1 ml hücre topağı. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
   NOT: Yukarıda belirtilen ACK parçalama tampon hacmi bir dalak içindir. toplanmış dalak örnekleri için buna göre hacmi büyütmek.
4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de% 2 RPMI ortam ve santrifüj tüpü doldurmak. Süpernatant atılır ve tam RPMI ortamında 1 x 10 ⁷ hücre / ml'lik bir yoğunlukta hücreler tekrar süspansiyon.
   NOT: tripan mavi ve sadece hemasitometre kullanarak lekeli olmayan hücreleri canlı sayısı ile canlı hücre sayımı, leke hücreleri için.

Dalak Konvansiyonel T (T _dönüşüm) Hücreler ve T _reg Hücreler 3. Fenotiplendirme

Not: _regülatör T hücre izolasyonu önce, çeşitli antikorlarla hücrelerin boyanması ve akış sitometrisi ile analiz ederek saf ya da enfekte olmuş farelerde izole edilmiş dalak lenfositleri fenotipinin inceleyin.

1. hücreler 50 ul transferYeni bir U tabanlı, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, toplam dalak lenfositler arasındaki (5 x 10 ⁵ hücre) ve oyuk başına FACS tampon 150 ul ekle. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
2. süpernatant atın. Hücre topağı karıştırın ve oyuk başına FACS tampon 200 ul ekle. 4 ° C'de (2 kez), 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
3. Aşağıdaki antikorlar ve reaktifler ile göz başına FACS tamponu 50 ul lekeleme hücre yüzey markörleri için antikor kokteyli hazırlanır. Anti-CD4, mor bir boya, anti-CD25 yeşil boya, anti-PD-1, mor bir boya, anti-CD8 PerCP Cy5.5 boyası ve hücre canlılığı saptama reaktif maddesi yakın kızılötesi (IR), floresan reaktif boya.
   Not: Aktifleştirilmiş _regülatör T hücrelerinin fenotipi analiz etmek için, anti-CD103 ^23,25 hücre yüzey markör boyanması için ilave edilebilir.
4. oyuk başına antikor kokteylinin 50 ul hücre pelletini. 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. ile iki kez hücreleri yıkayın4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FACS tamponu.
5. Son yıkama aşamasından sonra, süpernatant süzün ve üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlanan sabitleme tampon 100 ul ile 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca hücrelerin tespit.
6. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile (üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlandı) permeabilizasyon yıkama tamponu ile iki kez hücreleri yıkayın.
7. hücre içi Foxp3 boyama için antikor çözeltisi hazırlayın ve anti-Foxp3 antikor çözeltisi 50 ul hücre pelletini.
   Not: daha CTLA bu aşamada eklenebilir T _{Dönüşümün} ve _regülatör T hücreleri, fenotipleri analiz etmek.
8. 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edilir ve adım 3.6 tekrarlayın. Son yıkama aşamasından sonra, FACS tampon 200 ul hücre pelletini ve ²⁵ akış sitometresi ile hücrelerin fenotipini inceleyin.
9. Kapısı canlı hücre nüfuslarıyon. CD4 ⁺ veya CD8 ⁺ T-hücreleri arasında PD-1 ⁺ hücrelerinin ^- LCMV CL13 enfeksiyonu sırasında T _dönüşüm hücrelerin fenotipleri analiz etmek için, Foxp3 sıklığını inceleyin.
   NOT: Deneysel sonuçlara dayanarak, Foxp3 yüzdesi ^- PD-1 ⁺ LCMV CL13 ile 16 d pi CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hem hücre popülasyonlarının% 50'den fazla olduğunu.
   1. _Regülatör T hücrelerinin frekansı ve fenotipleri analiz etmek için, CD4 ⁺ T-hücreleri arasında FoxP3 ⁺ ya Foxp3 ⁺ PD-1 ⁺ hücrelerinin frekansları inceleyin.
      Not: Deney sonuçlarına göre, Foxp3 ⁺ veya Foxp3 ⁺ PD-1 ⁺ hücrelerinin yüzdesi, sırasıyla, CD4 ⁺ T hücresi popülasyonunda fazla% 20'dir.

CD4 ⁺ CD25 ⁺ _regülatör T hücrelerinin 4. Yalıtım

Not: Tüm reaktifler hacimleri aşağıdaki belirtilen bir içindir1 x 10 ⁷ toplam splenositlerin hücre sayısını başlangıç.

1. saf ve LCMV kronik olarak enfekte olan fareler kullanılarak bölüm 2'de tarif edildiği gibi hücreler hazırlayın. T hücresi izolasyon tamponunda 10 ml ilave edilerek hücreler yıkanır. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Tamamen Süpernatantı atın ve tampon 40 ul hücre pelletini.
2. Manyetik Hücre Ayırma Sistemi kullanılarak, CD4 ⁺ T hücresi zenginleştirme için, biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
3. Tampon 30 ul olmayan CD4 ⁺ T hücrelerinin etiketlenmesi için, anti-biyotin mikro boncuklar 20 ul ve CD25 ⁺ hücrelerinin floresan etiketlemesi için CD25-PE antikorun 10 ul ekle. İyice karıştırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
4. tampon maddesinin 2 ml ilave edilir ve hücre debrisini uzaklaştırmak için yeni bir 50 ml'lik bir tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçer. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler yıkanır.Tamamen Süpernatant atılır ve en fazla 1.25 x 10 ⁸ hücre yoğunluğunda 500 ul tampon içinde hücre pelletini.
5. kolona hücreleri uygulayın ve sütunun geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de tampon ve santrifüj 2 ml ekleyerek sütun yıkayın. Tamamen Süpernatantı atın ve tampon 90 ul izole CD4 ⁺ T hücreleri tekrar süspansiyon.
6. CD25 ⁺ hücreleri manyetik işaretleme için, anti-PE mikro 10 ul ilave edilir, iyice karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
7. tampon maddesinin 2 ml ilave edilir ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler yıkayın. Tamamen Süpernatant atılır ve en fazla 1 x 10 ⁸ hücre yoğunluğunda tampon 500 ul hücre pelletini.
8. CD4 ⁺ CD25 ⁺ _regülatör T hücreleri zenginleştirmek pozitif seçim için kolona hücreleri uygulamak ve colum yıkamatampon maddesinin 2 ml ekleyerek n. yıkandıkları üç kez tekrarlayın.
9. Kolon son yıkama aşamasından sonra boşaldığında, kolona tampon 1 ml ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş CD4 ⁺ CD25 ⁺ piston kullanarak hücrelerin dışarı yıkayın.
10. Tekrar izole CD4 ⁺ CD25 ⁺ _regülatör T hücrelerinin saflığı artırmak için 4.8-4.9 adımları tekrarlayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Süpernatant atılır ve tam RPMI ortamında 2 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda izole CD4 ⁺ CD25 ⁺ _regülatör T hücrelerinin yeniden süspanse edin.
11. Izole edilmiş-CD4 ⁺ CD25 ⁺ _regülatör T hücrelerinin saflığı kontrol etmek için, toplam izole-CD4 ⁺ CD25 ⁺ _regülatör T hücreleri 2 x 10 ⁵ hücre kullanımı. FACS tamponu 50 ul anti-CD4 FITC içeren ve hücre canlılığı, IR-yakını flüoresan reaktif boya saptama reaktif maddesi ile hücreleri Leke.
    NOT: CD25 zaten izolasyonu sırasında PE ile işaretlenmiştir.
12. 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Yıkama işleminden sonra, FACS tampon 100 ul hücre pelletini ve akış sitometrisi ile saflığını kontrol.
13. Kapısı canlı hücre popülasyonu. _Regülatör T hücrelerinin saflığı analiz etmek için, CD4 ⁺ CD25 ⁺ hücrelerinin yüzdesi teyit etmektedir.
    Not: Deney sonuçlarına göre, saflaştırılmış hücreler arasında CD4 ⁺ CD25 ⁺ hücrelerinin yüzdesi yaklaşık% 80 üzerindedir.

CD8 ⁺ T hücreleri ve CD8 ⁺ T hücrelerinin etiketlenmesi 5. Yalıtım

NOT: Tüm reaktif hacimleri aşağıda belirtilen 1 x 10 ⁷ toplam splenositlerin bir başlangıç ​​hücre sayısı içindir.

1. saf fareler kullanılarak bölüm 2'de tarif edildiği gibi hücreler hazırlayın. T hücresi izolasyon devetüyü 10 ml ekleyerek hücreleri yıkanırer. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Tamamen supernatant atmak ve tampon 40 ul hücre pelletini.
2. Manyetik Hücre Ayırma Sistemi kullanılarak CD8 ⁺ T hücre izolasyonu için, sigara CD8 ⁺ T hücresi etiketlemesi için, biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir.
3. tampon 30 ul anti-biyotin mikro-20 ul ekle. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
4. kolona hücreleri uygulayın ve sütunun geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak. Bunu tamponun üç kez 2 ml ekleyerek sütun yıkayın.
5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Tamamen Süpernatant atılır ve tamponun 2 ml izole edilmiş CD8 ⁺ T hücrelerini yeniden süspanse edin.
6. İzole hücreler saflığını kontrol etmek için FACS tamponu içerisinde antikor çözeltisi 50 ul hazırlar. İzole CD8 ⁺ T cel arasında 2 x 10 ⁵ hücreleri tekrar süspansiyonAntikor çözeltisinin 50 ul mi.
   Not: Anti-CD8 FITC ekleyin antikor çözeltisinin hazırlanması ve hücre canlılığı saptama reaktif maddesi (IR-yakını flüoresan reaktif boya) FACS tampon içine için.
7. 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Yıkama işleminden sonra, FACS tampon 100 ul hücre pelletini, ve akış sitometrisi ile hücre saflığını kontrol.
8. Kapısı canlı hücre popülasyonu. CD8 ⁺ T hücrelerinin saflığını kontrol etmek için, CD8 ⁺ T hücrelerinin yüzdesini teyit etmektedir.
   Not: Deney sonuçlarına göre, arıtılmış, hücreleri arasında CD8 ⁺ hücrelerinin yüzdesi yaklaşık% 90 üzerindedir.
9. Izole edilmiş CD8 ⁺ T hücrelerine PBS ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın. PBS içinde 1 x 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda izole CD8 ⁺ T hücreleri yeniden süspanse edin.
10. CD8 ⁺ T ce etiketlemek içinin vitro bastırma deneyi için LLS, oda sıcaklığında 5 uM'lik bir konsantrasyon elde etmek için PBS içinde hücre çoğalması izleme mor boya seyreltin.
    NOT: Çalışmada kullanılan hücre çoğalması izleme mor boya yaklaşık uyarma ve emisyon zirveleri sırasıyla 405 ve 450 nm.
11. 15 ml'lik bir tüp içinde hücre çoğalması, izleme, mor bir boya (5 uM) ve hücre süspansiyonu (CD8 ⁺ T hücreleri 1 x 10 ⁷ hücre / ml) de eşit hacimde karıştırılır ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edilir. tüpü her 10 dakikada Vortex.
12. Soğuk tam RPMI ortamı ile tüp doldurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tüpü terk. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Tamamen supernatant atmak ve önceden ısıtılmış tam RPMI ortamı ile 2 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.

6. CD4 ⁺ CD25 ⁺ T İn Vitro Bastırma Testi Kurmasub> reg ve CD8 ⁺ T hücreleri

1. Anti-CD3 / CD28 kaplı taneler hazırlamak için, borunun, 15 ml (2.5 ul / 1 x 10 ⁵ hücre) manyetik boncuk uygun hacim transferi. PBS eşit hacimde ilave et ve karıştır. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile yıkayın ve supernatant atın. tam ortam içinde manyetik boncuk (50 ul / oyuk) ile seyreltilir.
2. CD4 ⁺ CD25 ⁺ _regülatör T hücrelerinin kısım 50 ul, U tabanlı, 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu (1 x 10 ⁵ hücre / oyuk). Cevaplayıcı T (T _resp) CD8 ⁺ T hücrelerinin hücre oyuk başına (1 x 10 ⁵ hücre / çukur) 50 ul ekle. oyuk başına seyreltilmiş, anti-CD3 / CD28 kaplı manyetik boncuklar 50 ul ekle.
   NOT: aşağıdaki gibi kontrol kuyuları kurmak bu adımı, etiketli ve: hiçbir anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile "sadece uyarılmamış CD8 ⁺ T hücresi"; "CD8 ⁺ T hücresi yalnızca" anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile; "CD8 ⁺ T hücresi yalnızca"Anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar,". _Regülatör T hücresi sadece "anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile _regülatör T hücreleri, T, farklı bir oranda tam ortam ve CO-kültürlenmiş T _solunum hücreleri ile seyreltilmiş olabilir _Solunum hücreleri: _regülatör T hücreleri (1: 0.25-1: 1).
3. 200 ul toplam hacmine her kuyulara 50 ul ya da ortamın uygun bir hacim. Folyo ile plaka Kapak ve 72 saat boyunca 37 ° C'de bir _CO2 kuluçka makinesi içinde inkübe edilir.

CD8 ⁺ T hücrelerinde 7. analizi CD8 ⁺ T hücre proliferasyonu ve sitokin üretim

1. sitokin üretimi analizi için, kültür, 3 gün sonra, iyi bir plaka her yüzey maddesi ayrılır ve enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile yerine getirir.
   Not: üstteki sıvı kısımlar halinde -70 ° C'de muhafaza edilebilir. Bu deneyde, anti-fare IFN-γ, antikor kaplı plaka IFN-γ üretimi anlaşması tespit etmek için kullanıldıÜreticinin protokolüne ing. Bir tek hücre ^düzeyinde, CD8 ⁺ T hücrelerinin proliferasyon IFN-γ üretimini belirlemek için, hücre içi sitokin boyama yapılabilir.
2. her gözden üst fazın ayrılmasından sonra, 4 ° C'de (3 kez), 2 dakika boyunca 300 xg'de FACS tamponu ve santrifüj ile hücreler içeren plakayı yıkayın.
3. Yıkama işleminden sonra, süpernatant atılır. Prolifere CD8 ⁺ T hücrelerinin boyanması için antikor kokteyli 50 ul hücre pelletini. 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin.
   Not: FACS tampon, anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP Cy5.5 ve hücre canlılığı saptama reajanı (IR-yakını flüoresan reaktif boya) ekleyin, antikor kokteyli hazırlanması.
   NOT: Bu, CD44 veya CD69 gibi çeşitli belirteçler karşı olan ^antikorlar, CD8 ⁺ T hücrelerinin aktivasyonunu teyit etmek için, diğer antikorlar ile birleştirilebilir. CD8 ⁺ T hücreleri zaten hücre çoğalması izleme v ile etiketlenmiş edilmiştir unutmayınAdım 5.10 de iolet boya.
4. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile iki kez yıkanır. Son yıkama aşamasından sonra, supernatant atmak ve sabitleme tampon 100 ul ile 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca hücrelerin tespit.
5. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile iki kez yıkanır. FACS tampon 200 ul hücreleri yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi ile hücre çoğalması izleme mor boya etiketli CD8 ⁺ T hücrelerinin proliferasyonunu ölçer.
   1. Kapı canlı hücreleri arasında CD8 ⁺ T hücresi popülasyonu. Hücre çoğalması, izleme, mor bir boya ve şu denkleme göre, CD8 ⁺ T hücresi seyreltme seyreltme göre ayrılır ve kesintisiz hücrelerin yüzdelerini ölçün. % Önleme = [(T _Reg hücrelerin yokluğunda çoğaldı CD8 ⁺ T hücrelerinin% - _regülatör T hücrelerin varlığında çoğalan CD8 ⁺ T hücrelerinin%) / (% olarak çoğalmıştır CD8 ⁺ T hücrelerininT _reg hücrelerinin yokluğu)] x 100 Ayrıntılı yazılımın ²⁵ flow sitometri kullanarak verileri analiz.

Sonuçlar

Biz intravenöz LCMV CL13 2 x 10 ⁶ pfu ile enjekte edilerek kalıcı virüs enfeksiyonu ile fareler üretti. _Regülatör T hücreleri ve kronik virüs enfeksiyonu sırasında T _dönüşüm hücrelerde fenotipik değişiklikler araştırıldı, saf ve enfekte farelerden elde edilen dalak lenfositleri çeşitli antikorlarla boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. CD4 ⁺ T _sohbetler (Şekil 1A, üst panel) ve Foxp3 ^{- -...}

Tartışma

_Regülatör T hücrelerinin sadece küçük bir bölümü, farelerde ve insanlarda mevcut olmakla beraber, bunların bir bağışıklık tepkisi düzenlenmesi ve immün tolerans korumada önemli bir rol oynar olarak işlev anlamak önemlidir. T numarası ve baskılayıcı işlevleri kronik virüs enfeksiyonuna ^15-20 yanı sıra kanser ilerlemesi ^13,14 sırasında hücreler artar _reg. Bu muhtemelen devam antijen uyarılmasına bağlıdır. _Reg hücreleri antijen sebat ve hastalık gelişimi altında faaliy...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
FITC Sıçan Anti-Fare CD4	RM4-5	BD Biosciences	553047
Cytofix/Cytoperm		BD Biosciences	554714
U-Alt Doku Kültürü Plakaları		BD Biosciences	353077
Fiksasyon tamponu		BD Biosciences	554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25	7D4	BD Biosciences	553072
Hücre süzgeci, 70 mm		BD Biosciences	352350
Hücre süzgeci, 40 mm		BD Biosciences	352340
Brilliant Violet 421 Anti-fare CD279 (PD-1)	29F.1A12	BioLegend	135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4	RM4-5	Biolegend	100547
APC Anti-Fare/Sıçan Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773
Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Fare CD8a	53-6.7	eBiosicence	45-0081
Fare IFN-gama Platin ELISA		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640		GE Yaşam Bilimleri	SH30027
PBS (1x)		GE Yaşam Bilimleri	SH30256
ACK Parçalama Tamponu		Gibco	A10492-01
L-Glutamin, 200 mM çözelti		Gibco	25030
Penisilin-Streptomisin, 10.000 U/ml		Gibco	10378-016
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke Kiti		Yaşam teknolojileri	L-34975
CD8a+ T Hücre İzolasyon Kiti, fare		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+ CD25+ Düzenleyici T Hücre İzolasyon Kiti, fare		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS Ayırma Kolonları, LD kolonları		Miltenyibiotec	130-042-901
MACS Ayırma Kolonları, LS kolonları		Miltenyibiotec	130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0)		Promega	V4231
2-Merkaptoetanol		Sigma Yaşam Bilimleri	M7522
Fetal Sığır Serumu		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Menekşe Hücre Proliferasyon Kiti		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II akış sitometresi		BD Biosciences
Flowjo		TreeStar
Hematositomer		Marienfeld üstün