Method Article

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

DOI:

10.3791/54148

⸱

July 25th, 2016

 ,  , 
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics, University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir üç boyutlu (3-D) bir ortamda büyüyen hücreler 2-B ortamları (örneğin, şişeler ya da bulaşıklar için) hücre ekimi üzerinde belirgin bir iyileşme göstermektedir. Burada dönen duvar-damar (RWV) Biyoreaktörlerde tarafından sağlanan mikrogravite altında kültüre insan bağırsak mukozasının bir çok hücreli 3-D Organotipik modelinin gelişimini betimler.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu (3-D) bir ortamda büyüyen hücreler çok 2-B ortamlarında hücre yetiştirme boşluklar (örn., Matara veya yemekler) köprü potansiyeline sahip çünkü. Aslında, yaygın şişelerde ya da bulaşıklar için yetiştirilen hücreler de-ayırt ve türetildikleri dokuların özel özellikleri kaybederler kabul edilmektedir. (A) statik model ve biyoreaktörler kullanılarak, (b) modeller: Şu anda, yerli ekstraselüler matriks (ECM) taklit eden hücreler iskelelerinin içine numaralı seribaşı 3-D kültür sistemleri iki tür temelde vardır. İlk atılım statik 3-D modelleri oldu. Böyle dönen duvar-gemi gibi biyoreaktörler kullanılarak 3-D modelleri (RWV) biyoreaktörle daha yeni bir gelişme vardır. RWV Biyoreaktörlerin orijinal konsept 1990'ların başında NASA'nın Johnson Uzay Merkezi'nde geliştirilen ve hipoksik, nekrotik çekirdek geliştirme gibi statik modellerin sınırlamaları aşmak inanılmaktadır. RWV biyoreaktörler th aşmak olabilirbesin ve oksijenin etkili yayılmasına imkan akışkanlar dinamiği sağlayarak sorundur. Bu biyoreaktörler desteklemek ve onların havalandırma kaynak türüne göre farklılık kültür damarlarının iki farklı biçimleri döndürmek için hizmet veren bir döndürücü tabanının oluşur: Bir eş eksenli merkezi oksijenatör, ya da (1) Yavaş Torna Yanal Gemiler (STLVs) (2 düz, silikon kauçuk gaz transferi membranı yoluyla oksijenasyonu ile) Yüksek Boy Oranı gemiler (HARVs). kabarcık oluşumunu ve buna bağlı türbülans kaçınarak Bu gemilerin verimli gaz transferine izin verir. Bu koşullar modeller kültür kabı içinde ağırlık (yerçekimi) azaltılmış laminer akış ve minimal kesme kuvveti ile sonuçlanır. Burada RWV biyoreaktör tarafından sağlanan bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan lenfositler, mikrogravite altında kültüre endotelyal hücreler ve fibroblastlar oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D organotipik modelinin geliştirilmesi açıklanmaktadır. </ P>

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilim adamları, farklı iskele türlerini (örneğin., Laminin, kollajen tip I kollajen IV ve fibronektin) ve geliştirmek için büyüme faktörlerinin kokteyller araştırmak başladı 3 boyutlu bir model inşa ilk atılım 1980'lerin başlarında bildirildi hücre-hücre ve "statik" 3-D modelleri 1-7 ECM etkileşimlerinde. O zamandan bu yana, bu modellerin temel sorun orta ve doku yapıları 8 içinde besin transferi ve oksijen sınırlamalar olmuştur. Kan damarlarının ağları çevreleyen sürekli bir besin akışı ve oksijen alır, in vivo ortamda hücrelerin aksine, bu modellerin statik yapısı hücrelerine sınırlı bir şekilde dağılımını engellemektedir. Örneğin, boyutu bir kaç milimetreyi aşan, in vitro statik modellerde üretilen hücre agrega değişmez hipoksik, nekrotik çekirdeği 9 gelişecektir. RWV biyoreaktörler Bu sorunu aşmak olabilirbesin ve oksijen 10-12 verimli yayılmasına imkan akışkanlar dinamiği sağlayarak. Ancak, bugüne kadar, RWV biyoreaktörler kullanarak çalışma bir veya iki hücre tipinin 13-17 dahil sınırlı kalmıştır. Ayrıca yerine doğal dokuların benzer bir mekansal yönlenmelerinin, bu hücreler, hücre agregatları oluşturdu. Bu sınırlamalar başlıca nedeni entegre bir şekilde hücreleri dahil etmek mümkün bir iskele eksikliği olmuştur. Bugüne kadar RWV biyo-reaktörlerde kullanılan iskeleleri esas olarak sentetik mikro-, borulu silindirler veya küçük yaprak 13-15,19-23 arasında birkaç istisna dışında 16-18 ile, oluşur. Bunlar, bir bileşim ve esneklik manipüle edilemez ve hangi hücrelerin yüzeyine bağlı oldukları sert malzemelerdir. Bu nedenle, bu modellerin entegre bir şekilde değerlendirmek için bir sistem sağlamak olası değildir, çeşitli hücre gibi stromal hücreleri gibi bileşenler (örneğin., Fibroblastlar, bağışıklık ve endotelyal hücreler) bu should yakından insan dokusu taklit etmek için iskele içinde dağıtılabilir.

Burada bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan endoteliyal hücrelerde oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D organotipik modelinin geliştirilmesi tarif eder ve fibroblastlar 24. Bu hücreler mikrogravite altında RWV biyoreaktör 13,25-30 tarafından temin kültürlenmiştir. Bizim 3-D modelinde ECM çok belirgin, kültür ortamına benzer bir ozmolalite (örn., Kültür sırasında ihmal difüzyon başlıkları) ve hücrelerden ve diğer ilgili hücre dışı matris proteinleri dahil yeteneği gibi özellikleri, hem de sahip uygun sertlik biyoreaktörler 24 kullanılır. Biyolojik sistemler çok karmaşık ve son birkaç yıldır,, izolasyon onları okuyan ziyade çevreleriyle hücre etkileşimleri incelenmesi yönünde mukozal araştırma odak bir kayma olmuşturn. Özellikle, Bağırsak hücre hayatta kalma ve farklılaşmasını etkileyen hücre-hücre etkileşimleri önemi iyi 31-34 belgelenmiştir. Özellikle, epitel hücreleri ve bunların niş arasındaki iletişim epitel hücre genişlemesi ve farklılaşması 35 üzerinde derin bir etkisi vardır. Gerçekten de, yaygın olarak kabul edilen tek değil, hücre-hücre hem de hücre-ECM etkileşimleri 3-D kültür modellerinde epitelyal hücrelerin bakım ve farklılaşma için kritik öneme sahiptir. Önceki çalışmalar kollajen I 24,36,37, laminin 38 ve fibronektin 39 yerli mukozaya benzer uzaysal oryantasyon elde etmek için bağırsak epitel hücrelerini etkileyen vesile olduğu gibi bu bağırsak ECM proteinleri göstermiştir. Araştırmacılar kompleks hücresel ve yapısal mimari yeniden niyetinde olmadığını Böylece, yeni teknolojilerin gelişmesi, bizim 3-D modeli 24 gibi, bu bağırsak fenotipik çeşitlilik gereklidir taklit edebilirve bağırsak mikro-işlevi. Bu modeller, yeni oral ilaçlar ve aşı adaylarının gelişimi ve değerlendirilmesinde önemli bir araç oluşturmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik deyimi: Tüm kan örnekleri protokol numarası HP-00040025-1 katılan gönüllülerden toplanmıştır. Maryland Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi bu protokolü onayladı ve bu yazıda yer alan çalışmalar için sağlıklı gönüllülerden kan örneklerinin koleksiyonu yetkili. Bu çalışmanın amacı, gönüllülere açıklanmış ve tüm gönüllüler bilgilendirilmiş verdi, kan beraberlik önce rızasını imzaladı.

Not: Orta takviyesi hazırlığı için Tablo 1'e bakınız. 3-D kültür ortamının hazırlanması için Tablo 2'ye bakınız.

Kültür Gemiler hazırlanması 1.

  1. 50 ml'lik kabın dolum bağlantı kapağını çıkarın ve steril kültür ortamına 50 ml (ör. RPMI) ile doldurun. laminar kaput steril koşullar altında tüm prosedürleri uygulayın.
  2. Kapağı değiştirin ve% 70 etanol ile herhangi bir yüzeyde herhangi dökülen orta silin.
  3. gemi inkubasyon izin verOda sıcaklığında O / N, en az 15 dakika boyunca yedi.
  4. Kültür ortamı atılır ve 3-B kültür ortamında 30 ml ilave dolum kapısının kullanın.
  5. % 70 etanol ile herhangi bir yüzeyde herhangi dökülen orta silin.

Hücreler 2. Hazırlık

  1. Insan epitel hücre çizgisi (HCT-8) 24,40.
    1. RPMI kültür hücreler 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 50 mg / ml gentamisin, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES (tampon ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu FBS ile takviye edilmiş ) (ek 1). % 70 ortak akışkanlığa da 1 oranında bölünmüş hücreleri: 5'tir.
  2. İnsan kolonik fibroblastlar (CCD-18Co hücreleri) 24,41.
    1. Ek 1 ile zenginleştirilmiş Bazal Eagle ortamı içinde kültür hücreleri Akışların birleştiği yerde hücreler, 1 oranında bölünmüş hücre. 3.
  3. İnsan Umbilikal Ven Endotelyal (HUVEC) hücreleri 24,42.
    1. Endotel Bazal Ortamda (EBM) Kültür hücrelerinin ortamı 100 ug / ml heparin, 3 ug / ml endotel hücre büyüme takviyesi (ECGS) ile zenginleştirilmiş ve 1 ek% 70 ortak akışkanlığa, 1 oranında bölünmüş hücreler de. 2.
  4. Lenfositler / Monositler
    1. Standart teknikler 43 kullanılarak yoğunluk gradyan santrifüj ile kandan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) izole edilir.
      1. Kısaca, 10 ml'lik bir pipet kullanılarak, dikkatli bir şekilde seyreltilmiş kan 30 ml ilave (1: 1, kan: Fosfat tamponlu tuz (PBS)) yoğunluk santrifüj, 10 mL ortam ihtiva eden bir 50 mL konik tüp içine. santrifüj aşamasından sonra, lenfositler ve monositler yoğunluk santrifüj medya ve plazma katmanları arasında "beyaz" katmanında ikamet edecek.
      2. Bir transfer pipet kullanarak beyaz tabakayı toplayın. yoğunluk santrifüj medya koleksiyonu sınırlayarak granülosit kirlenmesini önlemek. 43 yıkandıktan sonra, Uolarak se PBMC ya da sıvı N 2 kriyoprezerve.
        Not: PBMC, büyük ölçüde, dendritik hücreler ve diğer hücre tipleri arasında, küçük bir oranda, lenfositler ve monositler oluşur vurgulamak önemlidir.
  5. % 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de, standart kültür koşulları altında tüm hücreleri büyütün.

Kolajen gömülü hücrelerin 3. hazırlanması

  1. ekler sayısını belirlemek deneysel koşullar numaraları göre gerektiğinde set-up olmak. 6-çukurlu bir plaka gözlerine insertlerin uygun sayıda yerleştirin.
  2. HUVEC ve fibroblast bir süspansiyon hazırlamak:
    1. PBS içinde iki kez şişeler yıkayın ve% 0.05 tripsin-tetrasodyum etilendiamintetraasetat (Tripsin-EDTA) ile tripsin,% 0.25 (1x) kullanarak hücreleri ayırmak. Hücre kültürü yüzey alanının tamamını kapsayacak kadar tripsin solüsyonu ekleyin. Sıyrılma, genellikle 15 dakika ile 5 dakika içinde meydana gelir
    2. ToplamakDulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM)% 30 FBS ortamı 30 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içinde müstakil hücreleri.
    3. 10 dakika boyunca 500 xg'de tüp santrifüjleyin.
    4. DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
    5. Tripan mavi boya 20 ul ile yeniden süspanse hücre 20 ul seyreltilmesiyle yaşayan hücrelerin sayısı. Hücre karışımı ile hemasitometre yükleyin. Canlı PBMC'ler açık beyaz olacaktır; cansız PBMC boya kazanmak ve mavi olacak.
      1. 8 x 10 7 hücre ml - - ​​5 konsantrasyonda DMEM% 30 FBS ortamı içinde her hücre tipi yeniden süspanse 1.
  3. hücre içeren kollajen jel hazırlanması
    Not: Her bir kap hücre içeren kollajen jel ~ 5 ml hazırlanmasını gerektirir.
    1. 50 ml'lik konik bir tüp içinde 50 ug / ml gentamisin, 2 mM L-glutamin ve% 10 ısı ile inactivat ile takviye edilmiş 1 X DMEM ortamı ekleyerek kollajen karışımının hazırlanmasıEd FBS artı 3 mg / ml sığır kollagen-l, 10 ug / ml laminin, 40 ug / ml kolajen IV, 10 ug / ml fibronektin, 2 ug / ml heparin sülfat proteoglikan, 15 mM NaOH (fizyolojik pH değerinin elde edilmesi).
    2. Tüp kapatılır ve karışım tamamen homojenize kadar birkaç kez ters yüz edilerek karıştırılır. kabarcık oluşumunu önlemek.
      ÖNEMLİ: jelleşme önlemek için buz karışımı tutun.
      1. Kritik adım: Karışım bir asidik görünüm (sarı renkli) oluşursa, karışımın nötralize edilmesi için, steril 1 N NaOH ve bir kaç damla ekleyin.
    3. Sırası ile zenginleştirilmiş-kollajen karışımı (yukarıda tarif edilmiştir) ile, 2.0 x 10 6 hücre / ml - 1.2 ve 1,5-1,0 yoğunluğunda konsantre HUVEC ve fibroblastlar ekleyin. tüpleri kapatın ve karışım tamamen homojenize kadar birkaç kez ters yüz edilerek karıştırılır. kabarcık oluşumunu önlemek. ÖNEMLİ: jelleşme önlemek için buz karışımı tutun.
    4. hücre içeren kollajen 5 ml - 4 eklemeher ekleme jel, önce bir 6 kuyu-plakasının içine yerleştirilir ve 1 saat boyunca çok az veya hiç hareket kaputu gelify bırakıldı.
    5. 2 saat daha - 1 saat sonra, 1 için bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör 6 oyuklu plaka aktarın.
    6. başlık 6 oyuklu plaka dönün ve steril bir forseps yardımıyla ve aseptik kesme neşter bir membran hücre ihtiva eden jel ayırma elemanından. küçük kareler halinde müstakil jel (~ 5 x 5 mm) kesin.
    7. dolum bağlantı noktasını kullanarak 50 ml HARV olarak küçük hücreli içeren kareler ekleyin.
  4. HCT-8 epitel hücrelerinin bir süspansiyonu hazırlanması:
    1. PBS içinde iki kez şişeler yıkayın ve Tripsin-EDTA tedavisi ile tripsin,% 0.25 (1x) kullanarak hücreleri ayırmak. Hücre kültürü yüzey alanının tamamını kapsayacak kadar tripsin solüsyonu ekleyin. Sıyrılma, genellikle 10 ila 15 dakika içinde meydana gelir.
    2. DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml müstakil hücreleri toplamak.
    3. Santrifüj10 dakika boyunca 500 xg'de tüp ihtiva Uge DMEM% 30 FBS ortamı.
    4. DMEM% 30 FBS ortamı 30 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
    5. 3.2.5 tarif edildiği gibi canlı hücre sayısı.
    6. 10 7 hücre ml'lik bir konsantrasyonda DMEM% 30 FBS ortamı içinde HCT-8 epitel hücreleri tekrar - 1.
    7. dolum bağlantı noktasını kullanarak 50 ml HARV halinde konsantre HCT-8 epitel hücrelerinin 1 ml ilave edilir.
  5. gemi neredeyse dolana kadar doldurma bağlantı noktasını kullanarak, (~ 20 ml) ilave 3-D kültür ortamı ekleyin.
  6. Kapağı değiştirin ve% 70 etanol ile dolgu liman dudağını silin.
  7. RWV her şırınga limanında bir şırınga yerleştirin: yer 3 içeren 5 ml'lik şırınga - 4 tek limanda 3-D kültür ortamı ml ve diğer limanda 5 ml boş şırınga.
  8. orta yaklaşık aynı hacimde başka şırınga bağlantı noktası üzerinden enjekte edilir iken boş şırınga içine çekerek herhangi bir görünür kabarcıklarını çıkarın.
  9. ves yerleştirindamarları biyoreaktör, gücü açın ve dakikada yaklaşık 13 ila 14 rotasyonlar için hızını ayarlayabilirsiniz.
    Not: Kritik adım: Rotasyon hızı böylece damar duvarları ile temas kaçınarak, damar içinde yörüngedeki hücreleri korumak için bir deney sırasında birkaç kez ayarlanması gerekebilir.
  10. RWV biyoreaktör tarafından sağlanan 37 ° C, mikrogravite altında,% 5 CO2, kültür hücreleri.
  11. Taze 3-D kültür ortamı ile yaklaşık 30 ml değiştirerek 4 gün - her 3 değiştirin kültür ortamı.
  12. 4 gün sonra (± 1 gün) sonra, biyoreaktörden damarları çıkarın ve kaplar (x 10 7 / kabı 2) ila lenfositler / monositlerin ekleyin.
  13. Ek bir 5 gün (± 1 gün) boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 geri biyoreaktör kapları.
  14. Ek 5 gün (kültürün gün 9) sonra, damarların (2 x 10 7 / damar) ile lenfositler / monositler eklemek ve 12 adede kadar ek gün için kültürleri devam ediyor.
  15. Taze 3-D kültür ortamı ile yaklaşık 30 ml değiştirerek 4 gün - her 3 değiştirin kültür ortamı.

Histoloji 4. Hasat 3-D Kültürler

  1. % 10 formalin 10 ml tampon içeren altı oyuklu plaka Bir transfer pipeti hasat yardımıyla artık olarak adlandırılan her küçük jel fragmanı "yapı" ile. Oda sıcaklığında 3 saat bekleme veya 12 - 4 ° C'de 16 saat.
  2. etiketleme ve her kaset içine biyopsi köpük pedler iki adet ekleyerek doku işleme ve gömme kasetleri hazırlayın.
  3. % 10 formalin tamponda kasetleri daldırın.
  4. Forseps yardımıyla iki köpük ped arasındaki sabit yapıları yerleştirin.
  5. % 10 formalin tamponda kasetleri daldırın.
  6. , Gömme kesit ve 44 boyanması için standart prosedürler ile devam edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce, bir bağırsak epitel hücre hattı ve primer insan lenfositler, yerçekimi koşulları 24 (Şekil 1) altında kültür endotelyal hücreler ve fibroblastlar oluşan insan bağırsak mukoza çok hücreli 3-D Organotipik bir model oluşturduk. Fibroblastlar ve endoteliyal hücreler ben ek bağırsak bazal membran proteinleri 45 (yani., Laminin, kolajen IV, fibronektin ve heparin sülfat proteoglikan) zenginleştirilmiş matris, kolajen gömülü olan ve biy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, primer insan lenfositleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri, hem de intestinal epitelyal hücre hatları 24 de dahil olmak üzere katları hücre tiplerinin oluşan insan bağırsak mukozasının bulasıcı modelinin oluşturulmasını tarif eder. Bu 3 boyutlu modeli, hücreler mikrogravite koşulları 24 altında kollajen zengin hücre dışı matris içinde kültüre edilir.

Daha önce açıklandığı gibi, bu modelin en önemli özellikleri şunlardır: (i) epitel doku ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, ABD Patent ve Ticari Marka Ofisine bir ABD Geçici Olmayan Patent Başvurusu yapıldığını beyan ederler (Sayı: 13/360,539).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, kısmen, MBS'ye NIAID, NIH, DHHS federal araştırma hibeleri R01 AI036525 ve U19 AI082655 (CCHI) ve AF'ye NIH hibe DK048373 tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dört Döndürücü / Bağımsız Döner Duvar Kabı (RWV) biyoreaktörü SyntheconRCCs-4DQ4 gemiye kadar. Daha fazla veya daha az gemili modeller de mevcuttur.
Tek kullanımlık 50 ml'likSyntheconD-405Kutusu, 4 damarlı
HCT-8 epitel hücreleri ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblastlar ATCCCRL-1459
İnsan Göbek Veni Endotel HücreleriATCCCRL-1730HUVEC
Fibroblast Büyüme Faktörü-Temel SigmaF0291bFGF
Kök Hücre Faktörü SigmaS7901SCF
Hepatosit Büyüme Faktörü SigmaH1404HGF
Endotelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Fare Engelbreth-Holm-Swarm tümöründen izole
edilmiştir Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü SigmaV7259VEGF
Lösemi İnhibitör Faktör Santa Cruzsc-4377(LIF
AdeninSigmaA2786
İnsülinSigmaI-6634
3,3 ', 5-triiyodo-L-tironin ve nbsp;SigmaT-6397T3
Kolera ToksiniSigmaC-8052
FibronektinBD354008İnsan plazmasından
izole edilmiştir apo-TransferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sülfat ve proteoglikanSigmaH4777Farenin bazal membranından izole edilmiştir  Engelbreth-Holm-Swarm tümörü
Kollajen IVSigmaC5533İnsan plasentasından izole
Isı ile aktive edilmiş fetal sığır serumu İnvitrojen10437-028
D-MEM, tozInvitrogen12800-017
10 formalin– PBS Fisher ScientificSF100-4
Sığır tip I kollajen İnvitrojenA1064401
Tripsin-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Sodyum piruvatInvitrogen11360-070
Gentamisin İnvitrojen15750-060
Penisilin / streptominsin ve nbsp;İnvitrojen15140-122
L-GlutaminInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Jambon F-12Invitrogen11765-054
Bazal Orta KartalInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endotel Bazal OrtaLonzaCC-3156EBM-2
Endotel hücre büyüme takviyesiMillipore02-102EKGS
edilmiştir %

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
  2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
  3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
  4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
  5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
  6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
  7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
  8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
  9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
  10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
  11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
  14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
  15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
  16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
  17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
  19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
  20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
  21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
  22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
  23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
  24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
  25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
  26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
  27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
  28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
  29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
  30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
  31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
  32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
  33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
  34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651(2014).
  35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
  36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
  37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814(2014).
  38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
  39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
  40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
  41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
  42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
  43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
  44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064(2014).
  45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
  46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
  47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
  48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
  49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
  50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
  51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Intestinal MucosaMicrogravity CultureRotating Wall Vessel3D Organotypic ModelMulticellular CultureCollagen Gel PreparationCell Isolation TechniqueDual Syringe MethodHistological EmbeddingVillus like Features

Related Articles