Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fibula Sinir Yaralanması Yöntem: Güvenilir Testi tanımak ve Test O Tamir Nöromüsküler Junctions Faktörleri

16.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54186

⸱

11 Ağustos 2016

 ,  , 
1Carilion Research Institute, Virginia Tech, 2Carilion School of Medicine, Virginia Tech, 3Department of Biological Sciences, Virginia Tech

Bu makalede

Özet

Farelerde kas reinnervasyonunu ve dolayısıyla nöromüsküler kavşakların rejenerasyonunu güvenilir bir şekilde incelemek için bir sinir yaralanması yöntemi geliştirdik. Bu teknik, ortak fibular sinirin basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir ameliyatla yaralanmasını içerir. Kas reinnervasyonu daha sonra ekstansör digitorum longus kasının tam olarak monte edilmesiyle değerlendirilir.

Özet

nöromüsküler bileşke (NMJ) yaşlanma, yaralanma ve hastalık sonucu zararlı yapısal ve fonksiyonel değişikliklere uğrar. Nedenle, bakım ve onarım NMJs katılan hücresel ve moleküler değişiklikleri anlamak için şarttır. Bu amaçla, güvenilir ve sürekli olarak farelerde NMJs rejenere incelemek için bir yöntem geliştirdik. o diz yakın gastroknemius kası tendonun lateral başının üzerinden geçerken Bu sinir yaralanması yöntemi yaygın fibula siniri ezme içerir. 70 günlük dişi fareler kullanarak, motor aksonlar 7 gün sonrası ezmek içinde önceki postsinaptik hedefleri reinnervate başlar göstermektedir. Bunlar tamamen 12 gün önceki sinaptik alanları yeniden işgal. Bu yaralanma yöntemin güvenilirliğini belirlemek için, bireysel 70 günlük dişi fareler arasında reinnervation oranları karşılaştırıldı. Biz tekrar innerve olmuş postsinaptik sitelerin sayısı 7, 9 fareler arasında benzer olduğunu buldu ve 12 gün sonrası crush. olmadığını belirlemek içinBu yaralanma deneyi, kas moleküler değişiklikleri karşılaştırmak için kullanılabilir biz kas nikotinik reseptör (y-AChR) ve kas özel kinaz (MuSK) gama alt-biriminin seviyeleri araştırılmıştır. gama-AChR alt birim ve MuSK yüksek aşağıdaki denervasyon regüle ve NMJs reinnervation aşağıdaki normal seviyelere geri oluştururlar. Biz bu genlerin ve kasların innervasyonu durumu transkript seviyeleri arasında yakın bir ilişki bulundu. Biz bu yöntem NMJ ve diğer sinaps tamir katılan hücresel ve moleküler değişiklikler anlayışımız hızlandırmak inanıyoruz.

Giriş

Genç yetişkin ve sağlıklı hayvanlarda, nöromüsküler kavşak (NMJ), bir α-motor aksonun sinir ucu olan presinaps ile nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (AChR'ler) seçici olarak toplandığı ekstrafusal kas lifinin özelleşmiş bölgesi olan postsinaps arasında oldukça kararlı bir bağlantıdır1. Pre- ve post-sinaptik aparatların neredeyse mükemmel bir şekilde atanması, uygun nörotransmisyon, α-motor nöronların ve kas liflerinin hayatta kalması ve motor fonksiyon için gereklidir. Ne yazık ki, NMJ'nin işlevi yaşlanma, amyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi hastalıklar, otoimmün hastalıklar ve kasların ve periferik sinirlerinyaralanması 2-5'ten olumsuz etkilenir. Bu hakaretler genellikle presinaptik sinir uçlarının dejenerasyonuna neden olur, kasları denerve bırakır ve motor becerileri önemli ölçüde değiştirir. Bu nedenle, NMJ'yi korumak ve onarmak için işlev gören moleküllerin tanımlanması bir öncelik haline gelmiştir. Periferik sinirler hedefleri rejenere edip reinnerve ettiğinden, rejenere NMJ'lerle ilişkili moleküler değişiklikleri tanımlamak için periferik sinir yaralanması modelleri kullanılmıştır.

Periferik sinir yaralanması modelleri genellikle belirli sinir dallarının ya tamamen kesilmesini ya da ezilmesini içerir6. Bir kesiyi takiben, endoneurial tüpün yeniden düzenlenmesi gerekir, bu da aksonal rejenerasyonu ve hedef hücrelerin ve dokuların reinnervasyonunu geciktirir. Bu tür yaralanmaların ciddiyeti aynı zamanda aksonların orijinal yollarından uzaklaşmasına neden olarak orijinal hedeflere ulaşamamalarına neden olur. Bu, endoneuriumun bitişik kaldığı ve yenilenen aksonların verimli ve uygun şekilde yeniden büyümesi için bir yol sağladığı ezilme yoluyla yaralanan sinirlerin aksine. Ayrıca aksonların orijinal kas lifi ortaklarını bulmasına ve yeniden sinirlendirmesine izin verir. Yaralanma modelinden bağımsız olarak, aksonların hedefleri yeniden oluşturması ve yeniden sinirlendirmesi için meydana gelmesi gereken bir dizi hücresel ve moleküler değişiklik vardır. Bir yaralanmadan sonra, hedefe yakın sinir segmenti parçalanır ve Wallerian Dejenerasyonu7 adı verilen bir işlemle çıkarılır. Bu işlem, Schwann hücrelerinin, rejeneratif faktörler salgılayan, miyelini temizleyen ve yaralanma bölgesine makrofajlar toplayan miyelinli olmayan hücrelere yeniden programlanmasını ve farklılaşmasınıiçerir 8. Makrofajlar sırayla miyelin ve aksonal kalıntıların temizlenmesini tamamlar, aksi takdirde rejenere akson9'un büyümesini engeller. Paralel olarak, motor ve duyusal nöronlar, kopmuş aksonlarının yenilenmesini teşvik etmek için gerekli mekanizmaları aktive eder. Yenileyici akson hedefe ulaştığında, bir büyüme konisinden bilgiyi düzgün bir şekilde iletebilen (motor aksonlar için) veya alabilen (duyusal aksonlar için) bir sinir ucuna dönüşmelidir10. Bu bağlamda, alfa-motor aksonlar, büyüme konilerinin, hedef kas lifi11 üzerindeki post-sinaptik bölgeye neredeyse mükemmel bir şekilde karşı çıkan tamamen işlevsel bir presinaptik sinir ucuna farklılaşmasıyla sonuçlanan bir dizi iyi düzenlenmiş değişikliğe uğrar.

Siyatik, tibial ve aksesuar sinirler, aksonal ve NMJ rejenerasyonu12-14'ü incelemek için birincil seçenekler olmuştur. Bununla birlikte, hayvanlar arasında ve farklı koşullar altında NMJ'lerin yenilenmesiyle ilişkili hücresel ve moleküler değişiklikleri incelemek için bu modelleri kullanırken bir takım dezavantajlar vardır. İlk olarak, siyatik sinir, arka bacak kaslarının çoğunu besler ve yaralanma hem hareketi hem de hissi önemli ölçüde sınırlar. Bu nedenle, egzersizin etkisini tek başına veya diğer faktörlerle birlikte incelemek için bu yöntemi kullanmak mümkün değildir. Ek olarak, siyatik sinir oldukça kalın bir yapıdır ve bu nedenle tüm aksonları tamamen yaralamak için büyük miktarda sıkıştırma kuvveti gerektirir. Bu da, daha yüzeysel aksonların tam transeksiyonu ile sonuçlanabilirken, daha derin yatan aksonların endoneurial tüpünü sağlam bırakabilir ve bu aksonlar arasında rejenerasyon hızı ve sadakatinde önemli bir değişkenlik yaratabilir. Bu sinirin tam transeksiyonu, birçok aksonun aynı kas lifleriyle yeniden bağlanamayacağı göz önüne alındığında daha az arzu edilir. Meseleleri karmaşık hale getiren siyatik sinir, terminal sinir dallarının hem sayısı hem de köken yeri açısından içsel anatomik değişkenliğe sahiptir. Bu nedenle aynı bölgeyi lezyona bağlamak çok zordur. Tibial sinir daha küçük ve yaralanmaları ezmek için daha uygun olsa da, bu sinir dalı için bir lezyon bölgesi olarak hizmet edecek hazır bir yer işareti de yoktur.

Sternokleidomastoid kası besleyen aksesuar sinir dalı (kraniyal sinir XI'in bir parçası) da NMJ'lerin15 rejenerasyonunu incelemek için kullanılmıştır. Bu sinir özellikle çekicidir, çünkü sternokleidomastoid kasındaki NMJ'ler, diğer kaslardaki NMJ'lere kıyasla canlı hayvanlarda daha kolay görüntülenebilir. Ancak siyatik ve tibial sinirlere benzer şekilde, bu siniri aynı yerde yaralamak için kullanılabilecek belirli bir dönüm noktası yoktur, bu da onu deneysel bir kohortun bireysel hayvanları arasında NMJ'lerin rejenerasyonunu karşılaştırmak için bir model olarak sınırlar. Tutarsız bir lezyon bölgesi, NMJ reinnervasyon oranlarında değişkenliğe neden olur. Bu eksiklikler nedeniyle, burada sunulan prosedür, rejenere NMJ'leri incelemek için farklı bir periferik sinir dalının yaralanmasını kullanır.

Ortak peroneal sinir olarak da adlandırılan ortak fibular sinir, onu hayvanlar arasında ve farklı tedavilerde NMJ'lerin rejenerasyonunu incelemek için güvenilir bir sinir haline getiren birçok özellik içerir. Ortak fibular sinir, dizdeki gastroknemius kasının lateral başının tendonu üzerinden geçtiği için öngörülebilir bir anatomik seyre sahiptir ve kesişme lezyonlar için stabil bir dönüm noktası görevi görür. Sinire, ilgilenilen kaslara yakın ancak anatomik olarak ayrılmış küçük ve minimal invaziv bir kesiden erişilir. Burada sunulan bulgular, rejenere motor aksonların, 70 günlük genç yetişkin dişi farelerde fibular siniri ezdikten 8 gün sonra ekstansör digitorum longus (EDL) kasındaki NMJ'leri yeniden oluşturmaya başladığını göstermektedir. Daha da önemlisi, reinnervasyon paterni ve oranı aynı yaş ve cinsiyetteki hayvanlar arasında tutarlıdır ve bu nedenle NMJ'leri korumak ve onarmak için gereken hücresel ve moleküler değişiklikleri anlamamızı önemli ölçüde hızlandıracak güvenilir bir yaralanma modeli sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış NIH kurallar ve hayvan protokol çerçevesinde yürütülmüştür.

Cerrahi 1. hazırlanması Hayvanlar

  1. steril 1 ml insülin şırınga ile ketamin (90 mg / kg) ve deri altı enjeksiyon yoluyla inguinal ksilazin (10 mg / kg) karışımı ile fareler anestezi. Taşıyıcı çözeltisi% 0.9 tuzlu su, 17.4 mg / ml ketamin ve 2.6 mg / ml ksilazin içeren bir karışım içerir. yürürlüğe girmesi için ilaç beklerken kafeslerde geri hayvanları yerleştirin.
    Not: yükleme dozu prosedür süresince yeterli anestezi sağlamıyorsa, yükleme dozunun% 25 ek enjekte edilebilir.
  2. Monitör hayvanlar sürekli solunum oranları ve uyarılma seviyelerinin uygun depresyon kontrol etmek için enjeksiyon sonrası. yeterince anestezi zaman hiçbir tepki ortaya çıkarmak gerekir bir arka ayak tutam ile uyarılma seviyesini kontrol edin.
    NOT: Bu genellikle 3-5 alır25 ila 30 g ortalama bir genç yetişkin fare için min. Hayvan de 10 dakika sonrası enjeksiyonundan sonra yanıt ise, anestezi yükleme dozunun% 25 ek enjekte edilebilir.
  3. kuruluğunu önlemek için hayvanın gözlerine vazelin ve hafif mineral yağ oftalmik merhem sürün. temiz, düz bir yüzey üzerine kafes ve yerden hayvanları kaldırın. ekstremitenin sadece yanal yönünü açığa bir elektrikli saç düzeltici kullanarak pelvise ayak istenen arka ekstremite tıraş.
  4. 1 dakika için traş sitesine bir kimyasal saç çıkarıcı uygulanır. El ile laboratuvar mendil kullanarak tüylerden. laboratuvar ile temizleyin depilated alan etanole batırılmış mendil.

2. Cerrahi Prosedür

  1. otoklav veya başka uygun yöntem ile cerrahi aletleri sterilize edin. % 80 etanol / H 2 0 ile cerrahi sitesi ve cerrahi kurulu temizleyin. proviodine cerrahi siteyi dezenfekte edin. cerrahi gemide fare yerleştirin ve uzuv sınırlamalar uyum. tutmakDiz eklemi ile anatomik doğal bir pozisyonda hedef arka bacak hafifçe iç veya dış rotasyon olmadan uzatıldı.
  2. Cerrahi mikroskop altında hayvan ve tahta yerleştirin. yüzeysel noktalarına özellikle kemik diz ekleminde ve tibialis anterior ve gastroknemius kaslar arasındaki sırtın palpasyon yoluyla uygun kesi sitesine yönlendirmek.
  3. kavrama için genel forseps kullanırken bir neşter veya yaylı makas kullanılarak deri yoluyla yaklaşık 3 cm'lik kesi olun. Ortak fibula sinir yatan tabii dik kesi yapmak.
  4. Yüzeyel fasya ile kesi Devam biceps femoris açığa ve vastus lateralis kasları. bağlayan derin fasya boyunca keserek bu kasları ayırın. Bir 1-2 cm kesilmiş yeterli olmalıdır.
  5. pazı geri çekin kaudale ortak fibula siniri açığa mekanik retraktörler kullanarak kas femoris.
  6. onun Inter kadar proksimal sinir Tracegastroknemius kasının lateral başının tendonu ile bölüm bulunur. Not: Poz geri kas ve deri ek manipülasyonunu gerekebilir. Bu kesişme sinir hasarı için kararlı bir dönüm noktası olarak kullanılır.
  7. gastroknemyus tendonun lateral sınırına paralel bir şekilde ipuçları hizalama ince bir forseps ile sinir kavrayın. 5 saniye boyunca sabit, sabit basınç uygulayarak ortak fibula sinir Crush.
  8. Cerrahi kapsamı ile görsel muayene ile sinirin tam ezmek desteklemektedir. Bu yaralanma yerinde saydam görünür. Periferik aksonların floresan proteinleri ifade fareler kullanıyorsanız, floresan yaralanma yerinde kaybolur.
  9. retraktörler çıkarın ve anatomik pozisyonlarında kasları realign. 6-0 ipek sütür ile kesi kapatın. 1-3 basit kesintiye dikişler yeterlidir. Temiz bir kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde fare recuperating yerleştirin.
  10. 2 saat sonrası opera için tüm hayvanları izlemekyon nefes ve anestezi herhangi bir olumsuz reaksiyonlara kontrol etmek için. Ameliyattan hemen kurtarma aşağıdaki subkutan inguinal enjeksiyon yoluyla buprenorfin 0.05-0.10 mg / kg bir başlangıç ​​dozunu. 3 ek doz sonraki 48 saat boyunca her 12 saatte verin. tam iyileşme sonrasında, hayvan bakım tesisine fareler dönün.

3. İzolasyon ve boyanması ekstansör digitorum longus (EDL) Kaslar

  1. izofluran kullanarak hayvanların Kurban. Emici labwipes ile dolu bir 50 ml'lik bir tüp içine 0.5 ml sıvı izofluran koyun. Mühürlü 2500 cm3 odasında hayvan kapaksız tüp yerleştirin. maruz en az 4 dakika yeterlidir. İkili üst kapağında, ayak-tutam, ve kuyruk-tutam reflekslerinin kaybı için test her hayvan perfüzyon başlamadan önce bilinçsiz olduğundan emin olmak için.
  2. Transkardiyal ilk 10 mi 0.1 M PBS ile 16 hayvan serpmek, daha sonra 0.1 M PBS (pH 7.4) içinde% 4 paraformaldehit 25 mi. Heparin (30 ünite / 20g Hayvan ağırlık) / ml) 10 birim perfüzyon sonuçları geliştirmek küçük kapiler yatak kan pıhtılaşmasını önlemek için (PBS ile ilave edilebilir.
  3. karın çevresi etrafında deri yoluyla enine kesmek için makas kullanarak arka bacaklarda kapsayan cilt kaldırmak. Arka bacaklarda ve ayaklarda forseps kullanarak geçmiş cildi aşağı soyun.
  4. kavrayarak ve forseps ile soyulması ile arka bacaklarda yüzeysel kaplamasını çıkarın. Periferik aksonların floresan proteinleri ifade fareler kullanıyorsanız, 50 ml'lik tüplerde% 4 PFA gecede bütün fareler sonrası düzeltmek. PBS ile üç kez yıkayın.
    Not: Sabit farenin 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir. Değilse, bu adımı atlayın ve post-sabitleme hayvanlar olmadan 3,6 adıma geçin.
  5. Mümkün olduğunca sağlam proksimal ve distal tendon tutmak için emin olmak, fare arka bacaklarda EDL kasları 18 parçalara ayır.
  6. en az 1 saat süre ile (1 x PBS,% 0.5 Triton X-100,% 3 BSA ve% 5 keçi serumu ihtiva eden) blokaj tamponunda EDS kasları inkübe edin.
    7. olarak sinir lifi (1.000 1) ihtiva eden tüpler içinde, motor aksonları ve sinir terminalleri, bir yer kasları görselleştirmek için. kasları 1x PBS ile üç kez 10 dakika her biri bir zaman yıkayın. Not: Periferik aksonların floresan proteinleri (XFP) ifade fareler kullanılarak bu adımı atlayın.
  7. tam NMJ innervasyonundan bir pozitif kontrol olarak EDL yaralanmamış karşı taraf Leke. Negatif kontroller, 4 gün sonrası yaralanma, NMJ tamamen Denerve bir zaman noktasında elde edilen bir EDS, hem de yalnızca sekonder antikor ile boyanmış bir EDL içermelidir.
  8. 1 gün sinir lifi ve synaptotagmin-2 algılamak için uygun floresan etiketli sekonder antikor ile kasları kuluçkaya yatmaktadır. kasları 1x PBS ile üç kez 10 dakika her biri bir zaman yıkayın. Not: Bu adım adım 3.10 ile birlikte yapılabilir. Periferik aksonların floresan proteinleri ifade fareler kullanılarak bu adımı atlayın.
  9. postsy görselleştirmek içinNMJ naptic bölgesi, 5 ug / ml, en az 2 saat boyunca blokaj tamponu içinde seyreltilmiş Alexa-555 konjuge alfa bungarotoxin kasların inkübe edin. kasları 1x PBS ile üç kez 10 dakika her biri bir zaman yıkayın.
  10. pozitif yüklü cam slaytlar üzerinde tüm kasları monte etmek için, slayt üzerinde orta montaj dayalı gliserol birkaç damla ekleyin ve lamel ile kaplayın, slayt doğrudan kas yerleştirin. kas düzleştirmek için slayt karşı lamel basın. slayt ve lamel kullanarak laboratuvar mendil çevresinden montaj medya kapalı ıslatın. lamel ve slayt arasındaki kenarları mühür oje sürün.

4. Görüntüleme ve Veri Analizi

  1. NMJs, görüntü 488, 555 ve 633 nm ışık heyecanlandırmak ve 20X ve 40X hedefleri ile yayılan ışığı yakalamak için donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak EDL kas yapısını analiz etmek.
  2. Bütün NMJs görselleştirmek için, optik sn maksimum intensite projeksiyon görüntüler oluşturmakleri ayrı NMJ en yüksek görünen bölgeler düşük uzanan 1 mikron 2 aralıklı. piyasada mevcut görüntüleme yazılımı kullanarak maksimum yoğunluk projeksiyonlar oluşturun.
  3. 1) Tamamen Denerve = postsinaptik sitesi akson ve AChRs arasında akson ile temas,% 5'ten az ko tamamen yoksun: olarak reinnervation oranlarını belirlemek için, NMJs sınıflandırır. 2) Kısmen innerve = akson kısmen akson ve AChRs arasındaki postsynapse,% 5-95 ko çakışıyor. 3) Tüm innervasyonu = öncesi ve sonrası sinaps arasında neredeyse mükemmel appozisyon, akson ve AChRs arasında% 95'ten fazla ko. görüntüleme düzlemine dik yalan veya tamamen görüntüde görselleştirilemediği NMJs hariç. Not: Tüm bu deneyler, en az 3 hayvan ve hayvan başına 50 NMJs incelenmiştir. Sonuçlar 0,05'ten P değerine sahip bir öğrenci t-testi kullanılarak anlamlı kabul edildi.
  4. operatörü kör, ayrı bireyler yapabilirCerrahi ve resim analizi. tedavi gruplarının bilgisi olmadan, analizörü NMJ puanlama ile objektif olabilir. Seçenek olarak ise, resim, randomize ve kaynak hayvan bilgisi olmadan analiz için operatöre sunulabilir.

5. Nicel PCR

  1. izofluran ve servikal dislokasyon kullanarak hayvanların Kurban. Cildi ve 3.3 adıma göre bacak kaslarını örten yüzeyel fasya çıkarın. tibialis anterior ve 3.4 adıma göre EDL kasları parçalara ayır.
  2. Flaş sıvı nitrojen üzerinde 1.5 ml tüp bütün tibialis anterior ve EDS kasları donma. kısmen sıvı azot içine daldırıldığında, bir ön-soğutulmuş havan içinde tüp ve yerden doku çıkarın. bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz haline dondurulmuş kas öğütün.
  3. Bir ticari olarak temin edilebilen RNA ekstraksiyon reaktifi içine donmuş kas tozu çözmek ve ticari olarak temin edilebilen bir kit üreticisinin I'e göre olan RNA ekstraksiyonu ve genomik DNA giderme gerçekleştirmeknstructions.
  4. üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilir ters transkriptaz karışımı ile ters transkripsiyon gerçekleştirin.
  5. qPCR uygun temizlik genler kullanılarak ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak gerçekleştirin (malzeme tabloya bakınız). (Malzeme tabloya bakınız) PCR yürütmek için piyasada mevcut olan kantitatif PCR termal döngü kullanın.
  6. 58 ° C olarak ayarlandı tavlama sıcaklığı. Taq polimeraz / SYBR yeşil karışımı imalatçısının şartnamesine ek bisiklet parametrelerini ayarlamak. Primer özgüllük için test dimer oluşumunu astar 95 ° C ila 65 ° C ila 0.5 ° C artan artar oluşan termal döngü programına bir son erime eğrisi aşamasını içerir.
  7. Kontrol geni olarak 18S RNA kullanılarak ΔΔCT yöntem 21-2 göreceli mRNA ekspresyon seviyelerini belirlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ortak fibula sinir, aynı zamanda, peroneal sinir olarak adlandırılan bacak (Şekil 1A) ön yönüne fibula başının etrafında sallanır popliteal fossada yukarıdaki siyatik sinirin, doğar. yüzeysel ve derin fibula sinir içine dalları birbirine ayak ve ayak dorsifleksör tedarik (anterior tibialis, extensor digitorum longus ve brevis ve ekstansör halluces longus kasları) ve ayağın everters (peroneus kaslar) Orada olmuyor. Bu sinir de ayak ve bacağın alt yarısının lateral sırtına...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda sunulan yöntem nöromüsküler kavşaklar (NMJ) tamir katılan mekanizmaları tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunar. o diz yakın gastroknemius tendonu üzerinden geçerken Bu yöntem yaygın fibula siniri ezme içerir. Bir forseps ile sinir sıkışmasının sadece 5 saniye sonra, tam bir dejenerasyonu yaralanması 4 gün sonra belirtilen olduğunu göstermektedir. genç yetişkin farelerde, alfa-motor aksonlar 12 gün yaralanmamış farelere olanlardan ayırt edilemez presinaptik sitelerin Reformasyon sonuçlanan, post-yaralanma 7 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, deneylerle ilgili entelektüel katkıları ve el yazması hakkındaki yorumları için Valdez laboratuvarı üyelerine teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KetaminVetOne501072
XylazineLloyd Inc. 003437 
Buprenorfin  Zoopharm1Z-73000-150910 
NairNair
Kim-wipesKimtech34155
Elektrikli Tıraş BıçağıBraintree ScientificCLP-64800
%80 EtOH/H20
%10 Proviodine
1 ml İnsülin Şırınga Yaylı
MakasVannas91500-09
No. 15 neşterBraintree ScientificSSS 15
#5 ForsepsDumont 11252-00
6-0 ters kesme iğnesi üzerinde ipek sütür  Sütür Ekspresi752B 
Kemirgen Isıtma YastığıBraintree ScientificAP-R-18.5
Alexa 555 konjuge alfa-BTXMoleküler ProblarB35451
VectashieldVektör LaboratuvarlarıH-1000
Olympus Stereo Zoom MikroskobuOlympus562037192
Zeiss 700 Konfokal MikroskopZeiss
Değişken akışlı peristaltik perfüzyon pompasıFisher Scientific13-876-3
Aurum Toplam RNA Mini KitiBio-Rad7326820
Bio-Rad iScript RT SupermixBio-Rad1708840
SsoFast Evagreen SupermixBio-Rad1725200
Bio-Rad CFX96Bio-Rad1855196
Puralube Vet merhemPuralube1621
Sinaptotagmin-2 antikorAntikorları-ÇevrimiçiABIN401605
Nörofilament antikorAntikorları-ÇevrimiçiABIN2475842

Kaynaklar

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
  2. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252(2014).
  3. Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
  4. Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
  5. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640(2012).
  6. Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
  7. Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
  8. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
  9. Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
  10. Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
  11. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
  12. Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
  13. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657(2013).
  14. Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
  15. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  17. Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  19. Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
  20. Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nöromüsküler Bileşke RejenerasyonuSinir Ezilme DeneyiMotor Akson Yeniden İnnervasyonuGamma-AChR EkspresyonuMuSK Yukarı DüzenlemesiPeriferik Sinir RejenerasyonuSinaptik Yeniden İnnervasyon AnaliziQPCR Gen EkspresyonuCerrahi Sinir Ezilmesi
Fibula Sinir Yaralanması Yöntem: Güvenilir Testi tanımak ve Test O Tamir Nöromüsküler Junctions Faktörleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.