Yöntem makalesi

Atomik Kuvvet Mikroskobu, Darbe girinti ve reometre kullanarak Beyin Doku Ölçekli Mekanik Özellikleri karakterize

DOI:

10.3791/54201

⸱

6 Eylül 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynin viskoelastik mekanik özelliklerini mikro, mezo ve makro ölçeklerde karakterize etmek için bir dizi teknik sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mekanik simulants veya doku rejenerasyonu çalışmalarında olsun, beynin özelliklerine esinlenerek malzeme tasarımı ve mühendis için, beyin dokusu kendisi de çeşitli uzunluk ve zaman ölçeklerinde karakterize edilmelidir. Birçok biyolojik dokular gibi, beyin dokusu karmaşık, hiyerarşik bir yapı sergiler. Bununla birlikte, diğer dokuların tersine, beyin Pa 100'ün mertebesinde Young elastik modülleri E, çok düşük mekanik sertlik taşımaktadır. Bu düşük sertlik önemli mekanik özellikler deneysel karakterizasyonu için zorluklar ortaya çıkabilir. Burada, farklı uzunluk ölçeklerinde ve yükleme hızlarında beyin dokusu gibi sulandırılmış, uyumlu biyolojik malzemelerin elastik ve viskoelastik özelliklerini ölçmek için adapte edilmiş birçok mekanik karakterizasyon teknikleri göstermektedir. mikroölçeklerde, biz Atomik kuvvet mikroskobu etkin girinti kullanarak sürünme uyum ve kuvvet gevşeme deneyleri yaparlar. mesos atcale, bir sarkaç tabanlı aletli dişinin kullanarak darbe girinti deneyleri. makroölçekte, biz frekans bağımlı kayma elastik modüle ölçmek için paralel plakalı reometre yapıyoruz. Biz de her yöntemi ile ilişkili zorlukları ve sınırlamaları tartışmak. Birlikte bu teknikler daha iyi beynin yapısını anlamak ve biyo-esinlenmiş malzemeleri mühendisi için kullanılabilir beyin dokusunun derinlemesine bir mekanik karakterizasyonu sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik organları içeren en yumuşak dokular mineralize kemik ya da mühendislik malzemelerine göre, mekanik ve yapısal olarak karmaşık ve düşük sertliğe sahiptir ve doğrusal olmayan ve zamana bağlı deformasyon sergiler. Vücudun diğer dokulara kıyasla, beyin dokusu Pa 1 100'ler mertebesinde elastik modülü E, son derece uyumludur. Beyin dokusu farklı ve birbirine kenetlenmiş gri ve aynı zamanda işlevsel farklılık beyaz cevher bölgeleri ile yapısal heterojenliği sergiler. Anlamak beyin doku mekaniği, yaralanma sırasında beynin yanıtı taklit mekanik hasar tahmini kolaylaştırmak ve koruyucu stratejilerin mühendislik sağlamak için malzemeler ve hesaplama modelleri tasarımında yardımcı olacaktır. Buna ek olarak, bu tür bilgiler doku rejenerasyonu için tasarım hedeflerini belirlemek için kullanılabilir ve daha iyi multipl skleroz ve otizm gibi hastalıklarla ilişkili beyin dokusunda yapısal değişiklikleri anlamak için. Here, biz tarif ve mezo, mikro de, beyin dokusu dahil mekanik uyumlu dokuların viskoelastik özelliklerini karakterize etmek için kullanılabilir birkaç deneysel yaklaşımlar göstermek ve makro-ölçekler.

mikroölçeklerde, biz sürünme-uyum yürütülen ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) etkinleştirilmiş girinti kullanarak gevşeme deneyleri zorlamak. Tipik haliyle, AFM etkin girinti örnek 2-4 arasında bir esneklik modülüne (ya da ani sertlik) tahmin etmek için kullanılır. Ancak, aynı enstrüman, aynı zamanda mikro viskoelastik (zaman veya oran bağlı) özelliklerini 5-10 ölçmek için kullanılabilir. Şekil 1'de gösterildiği bu deneylerden prensibi, zamanla, beyin dokusu içine probu dirsekli bir AFM girinti kuvvet veya girinti derinliği belirli bir büyüklüğü korumak ve sırasıyla girinti derinliği ve kuvvet, karşılık gelen değişiklikleri ölçmektir. Bu verileri kullanarak, biz sürünme kompozisyonu hesaplayabilirsinizsırasıyla liance J, C ve dinlenme modülü G R,.

orta ölçekli, biz bir sarkaç tabanlı aletli nanoindenter kullanarak, doku yapısı ve hidrasyon düzeylerini korumak sıvı su altı koşullarında darbe girinti deneyler yapılmıştır. Deney düzeneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Sarkaç doku ile temas salıncaklar gibi, salınan sarkaç doku içinde hareketsiz hale gelene kadar yer değiştirme, zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir prob. Prob ortaya çıkan sönümlü harmonik salınım hareketi, biz dokusunun 11,12 (enerji dağılımı oranına ilgilidir), maksimum penetrasyon derinlik x max, enerji sönümleme kapasitesi K, ve dağıtma kalite faktörü Q hesaplayabilirsiniz.

makroölçekte, biz, frekansa bağımlı kayma elastik modüle ölçmek için bir paralel plakalı reometre kullanıldı. dokusunun depolama modülü G 've zarar modülü G "olarak adlandırılan rheometrisi Bu tip, bir harmonik açısal gerginlik uygulamak (ve kayma gerginlik karşılık gelir) bilinen genlik ve frekanslarda ve tepkisel tork ölçmek (ve kayma gerilmesi karşılık gelir) Şekil 3 'de gösterildiği gibi. ölçülen tork elde edilen genlik ve faz gecikmesi ve sistemin geometrik değişkenlerden, çıkar 13,14 uygulamalı frekanslarda "G' ve G hesaplayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Tüm deneysel protokoller Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanan ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uygun bulundu.

1. Fare Beyin Doku Toplama İşlemleri (AFM etkin girinti ve darbe girinti için)

  1. fareler uyutmak için bir ketamin / ksilazin karışımı hazırlayın. 5 mi ketamin (500 mg / ml), 1 mi ksilazin (20 mg / ml) ve 7 ml% 0.9 tuzlu su çözeltisi bir araya getirin.
  2. Fare (Breed:; Syn-Cre; TSC1'yi PLP-eGFP; Yaş: p21; Cinsiyet: erkek veya kadın) enjekte ketamin / ksilazin çözümünün gram vücut ağırlığı başına 7 ul.
  3. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, ayak ve kuyruk tutam yanıt eksikliği gösterdiği gibi, büyük diseksiyon makas kullanılarak boyunları vurularak fare euthanize.
  4. Daha küçük diseksiyon makas kullanılarak orta aşağı keserek kafatası çıkarın. beyincik başlayarak, remKavisli bir forseps kullanarak kafatasının ove adettir. kafatası çıkarıldıktan sonra, beyincik başlayan, beyin kaldırmak için düz bir spatula kullanarak beyin ayıklamak ve bir Petri kabı üzerine beyin yerleştirin. Bir jilet kullanarak beyin beyincik çıkarın.
  5. Buz üzerinde yetişkin nöral dokuda CO 2 bağımsız besin ortamı ile bir yuvarlak dipli tüpe taze doku transferi beyin üzerinde etkisi girinti testleri için tüm beyin kullanarak ve bölüm 4. geçin Aksi takdirde prosedürleri dilimleme için 1.6 adıma geçin.
  6. 0,7 mm / sn, 70 Hz titreşim frekansı ve 350 um bir dilim kalınlığının hız vibratome ayarlarını yapın. buz ile vibratome çanak Surround. Vibratome tabağa superglue bir dab koyun ve koronal dilim kesilmiş böylece beyin birinci dorsal tarafına kesmek yönelik olan, beyin monte edin.
  7. Sadece beyin batırmak için yeterli Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile vibratome çanak doldurun. YükseltmekBıçak sadece DPBS batmış böylece vibratome üzerinde çanak.
  8. Basın 350 mikron kalınlığında koronal beyin bölümleri dilimleme başlarsınız.
  9. Dokuya zarar görmesini önlemek vibratome DPBS banyosundan ve buz üzerinde yetişkin nöral doku için CO 2 bağımsız besleyici ortam ile yuvarlak dipli tüp içine beyin dilimleri transferi ve 48 saat içinde, taze doku üzerinde ölçümler yapmak için fırçalar kullanılması. AFM etkin girinti deneyleri başlamak için, bölüm 3 geçin.

2. Domuz Beyin Dokusu Edinme Prosedürleri (reoloji için)

  1. Yerel bir kasap kurban ~ 1 saat içinde sagittally dilimlenmiş domuz yarım beyin edinin. Yetişkin nöral doku için CO 2 bağımsız besin ortamında yarım beyin yerleştirin ve buz üzerinde saklayın.
  2. Yetişkin nöral doku için CO 2 bağımsız besin ortamında bir ~ 5 mm kalınlığında koronal beyin dilim ve mağaza yapmak için bir jilet veya neşter kullanabilirsiniz. Emin olun dilim Surface mümkün olduğunca düz. kesit sırasında jilet / neşter dikkatli yanal hareketleri kullanın.
  3. Mağaza domuz beyin buz üzerinde yetişkin nöral dokuda CO 2 bağımsız besin ortamında doku ve 48 saat içinde taze doku üzerinde reometre ölçümleri (bölüm 5) gerçekleştirin.

3. Atomik Kuvvet Mikroskobu Girinti özellikli

  1. üreticinin talimatlarına uygun olarak bir midye-türevi biyolojik yapıştırıcı 60 mm çapında Petri (P60) yemekler hazırlayın.
    1. 8.0 optimal pH, steril su içinde 0.1 M sodyum bikarbonattan oluşan nötr tampon çözeltisi stoku hazırlayın. Filtre sterilize (0.2 mikron), 4 ° C de, sodyum bikarbonat tamponu ve saklayın.
    2. bir laminar akış başlığı içinde, sodyum bikarbonat tamponu içinde% 6.25 midye-türevi biyolojik olarak yapışan ve 3.125,% NaOH karıştırın.
    3. sol yaymak için 60 mm çaplı Petri (P60) çanak ve kullanım pipet üzerine 3.1.2 biyo-yapışkan çözümün pipet 100 ul3-5 cm çapında çember içine Katkı.
    4. Çözelti kuru (~ 30 dk) laminer akış kaputu ortaya P60 yemekleri bırakın ve izin verin. Yıkama yemekleri PBS ve steril su ile 2x ile 1x. kadar 1 ay boyunca 4 ° C'de kapalı bir plastik torba içinde laminer akış kaputun ve mağaza yemekler hava kurumasını bekleyin.
  2. AFM olarak AFM ve set-up beyin örneği ayarlayın.
    NOT: Üretici olarak başına AFM kalibrasyon talimatları uygulayın.
    1. Dikkatle 0.03 N / m nominal yay sabiti ve prob tutucu içine 20 mikron çaplı borosilikat boncuk ile bir AFM prob yükleyin.
    2. Termal ayar yöntemi 15,16 ile AFM konsol yay sabiti ve ters optik kolu duyarlılığı (InvOLS) kalibre.
      NOT: AFM prob için yay sabiti hesaplanır sonra, tekrarlanan kullanımı ile sabit kalmalıdır. Ancak, konsol InvOLS lazer konsol ile realigned her zaman yeniden kalibre edilmesi gerekir. Buna ek olarak, kalibrasyonpolistiren gibi konsol, daha sert büyüklükte bir alt-tabaka birçok düzenine karşı gerçekleştirilmelidir.
    3. 37 ° C sahne monte ısıtıcı ve ayarlanan sıcaklığa açın.
    4. Bölüm 3.1'de hazırlanan P60 yemekleri üzerine beyin dilim monte edin.
      1. Yavaşça 350 mikron kalınlığında beyin dilim, hem de midye-türevi biyolojik yapıştırıcı ile kaplanmış bir P60 çanak içine tabanı yuvarlak bir şişe ile ilgili CO2 bağımsız orta dökün.
      2. nazikçe P60 çanak eğerek, çanak merkezi beyin dilim yerleştirin. Gerekirse, yavaş yavaş yemeğin ortasında tek başına ya da daha iyi bir pozisyonda beyin dilim üzerinde katlanmış bir beyin dilim açılmak için bir manuel pipetter gelen orta pipetle.
      3. Dikkatle P1000 pipetter (vakum kullanmayın) kullanarak fazla ortamı çıkarın.
      4. P60 tabağına kapağı yerleştirin ve beyin dilim 20 dakika uymak edelim.
    5. P60 monte beyin dilim, AFM baş kaldırmak koyunAFM sahnede çanak ve 2 ~ eklemek ml CO 2 bağımsız orta önceden ısıtılmış.
    6. Dikkatle beyin dilim çevreleyen ortama indirildiğinde yüzey gerilimi nedeniyle kırılma korumak için AFM prob üzerine medyanın bir damla ekleyin.
    7. sahneye AFM baş konumlandırmak ve medya batırılır kadar kafa düşürücü başlar.
    8. üst görünüm CCD kamera kullanılarak, konsol üzerine lazer yeniden konumlandırmak.
      NOT: konsolun üzerinde lazer hizalama nedeniyle hava ve ortamın kırılma indeksi farkı biraz değişmiş olacaktır.
    9. konsol sıcak sıvıya olmanın ayarlamak için 5 dakika bekleyin ve sonra 0 V ücretsiz bir sapma ayna hizalama sıfırlama
    10. Üreticinin talimatlarına 16 göre AFM probu üzerinde termal spektrum çalıştırın. Medyada AFM sondanın InvOLS yeniden hesaplamak için ilk termal tepe uygun kullanın.
    11. optik mikroskop kullanılarak,örnek sahne hareket öyle ki AFM probu altında ilgi beyin bölgesi.
      NOT: çevreleyen gri madde daha opak olarak korpus kallosum karanlık görünür. korteks korpus kallosum üstündür.
    12. 0 V. ücretsiz sapma ayna hizalama sıfırlayın
    13. AFM yazılımı Sum ve Eğilme Meter üzerinde, AFM baş meşgul "Engage" tıklayın.
    14. konsol ve örnek arasındaki temas yapılana kadar AFM kafasına pozisyon kadranı kullanarak, kafasını indirin.
  3. İstenirse daha önce 4,17,18 tarif edildiği gibi (İsteğe bağlı), numunenin elastik modülü ölçün.
  4. sürünme uyum deneyler.
    1. yazılımın işlevi editörü uygulanan kuvvet fonksiyonu Construct. kuvvet fonksiyonu 5 nN bir dizi noktasına 0.1 saniye rampa oluşur ve 0 nN bir uygulanan kuvvet aşağı rampa bir 1 saniye ardından 20 saniye boyunca tutun.
      1. Girinti Usta PAnel, girinti yöntemi kapsamında, Indenter Modu için "Load" seçeneğini seçin; birimleri için "N"; Indenter İşlevi ve "Fonksiyon editörü".
      2. fonksiyon düzenleyicisinde, Segment Parms Paneli, 0.1 sn süre ile, 0 nN başlar 5 nN biter bir uygulanan kuvvet fonksiyonu segmenti oluşturun. "-> Ekle" yi tıklayın.
      3. Bir sonraki bölüm için 5 nN, 20 sn 5 nN uca ve zaman başlar ayarlayın. "-> Ekle" yi tıklayın.
      4. Son segment için, 5 nN, 1 sn 0 nN uca ve zaman başlar ayarlayın. Click "Draw" ve Fonksiyon Düzenleyici penceresini kapatın.
    2. Usta Panel Kuvvet sekmesinde, "tetik sonra batıcı rampa" kontrol ve 0,1 V tetik noktasına ulaştıktan sonra tetiklemek için uygulanan kuvvet fonksiyonu ayarlamak
    3. sürünme uyumu için inşa uygulanan kuvvet fonksiyonu tetikler Usta Panel Kuvvet Tab altındaki, "Tek Gücü" tıklayın.
    4. SonraTek kuvvet girinti bittiğinde, kafa ilgisini yeniden ve yeniden sıfır ücretsiz sapma sonra numune ile temas dışında olduğunu böylece AFM başını yükseltmek ve.
    5. ilgi yeni bir alan bulun ve temas kurmaya AFM baş düşürmek için örnek sahne yerleştirin. NOT: Örnek aşaması taşındığında AFM kafa numune yüzeyinden çekilmelidir. Bunu yapmamak hassas AFM konsol hasara neden olabilir.
    6. Adımları tekrarlayın 3.4.3-3.4.5 veri istenilen miktarda tahsil edilinceye kadar.
  5. kuvvet gevşeme deneyleri yaparlar.
    1. yazılımın işlevi editörü uygulanan girinti fonksiyonu Construct. girinti fonksiyonu 3 mikron bir dizi noktasına 0.1 saniye rampa oluşur ve 0 mikron bir girinti derinliğe kadar rampa bir 1 saniye ardından 20 saniye boyunca tutun.
      1. Girinti Usta Panelinde, girinti yöntemi kapsamında, Indenter Modu için "girinti" seçeneğini seçin; birimleri için "m", ve "; Indenter Function Fonksiyon editörü ".
      2. fonksiyon düzenleyicisinde, Segment Parms Paneli, 0.1 sn süre ile, 0 um başlar 3 mikron biter bir uygulanan kuvvet fonksiyonu segmenti oluşturun. "-> Ekle" yi tıklayın.
      3. Bir sonraki bölüm için, 3 um 3 um, son başlar ayarlayın ve 20 saniye zamanı. "-> Ekle" yi tıklayın.
      4. Son segment için, 0 um 3 um, son başlar ayarlayın ve 1 sn zaman. Click "Draw" ve Fonksiyon Düzenleyici penceresini kapatın.
    2. Usta Panel Kuvvet sekmesinde, "tetik sonra batıcı rampa" kontrol ve 0,1 V tetik noktasına ulaştıktan sonra tetiklemek için uygulanan kuvvet fonksiyonu ayarlamak
    3. kuvvet rahatlama için inşa uygulanan girinti fonksiyonunu tetikler Usta Panel Kuvvet Tab altındaki, "Tek Gücü" tıklayın.
    4. Tek kuvvet girinti bittikten sonra, böylece, AFM baş kaldırmakDaha sonra numune ile temas dışında baş ve yeniden sıfır sapmasını yeniden meşgul.
    5. ilgi yeni bir alan bulmak için sahne yeniden getirin ve temas kurmaya kafasını indirin.
    6. veri istenilen miktarda tahsil edilinceye kadar tekrarlayın 5,3-5,5 adımları.
  6. deneyler ve temiz-up sonlandırın.
    1. deneyler tamamladıktan sonra, AFM başını yükseltmek ve örnek çıkarın.
    2. dikkatle konsol dokunmadan fazla sıvıyı çıkarmak için bir laboratuar doku kullanın.
    3. Dikkatle etanol küçük bir miktar kullanarak AFM konsol tutucu temizleyin. etanole konsol tutucu hassas elektronik maruz bırakmayın. Bir saklama kabı AFM konsol ve yer çıkarın.
    4. Uygun biyogüvenlik protokollerini takip ederek beyin doku örneğinin atınız.
  7. Lee ve Radok 1960 tarafından türetilen çözüme göre, MATLAB, sürünme uyumu hesaplamak ve batıcı geometrisini kullanarak gevşeme modülüne kuvvet kullanarak 19.
    1. Kuvvet F ve girinti derinliği hesaplamak figure-protocol-1 konsol pozisyon z verileri, sapma d, ve yay sabiti, k c

      figure-protocol-2 ve figure-protocol-3 .
    2. Lin ve ark., 20'de tarif algoritmayı kullanarak girinti eğrisi boyunca temas noktasını bulun.
    3. Veri analizi için ilgi bir pencere tanımlayın. Çevrede pencere veya (kuvvet dinlenmek için) girinti derinliği (sürünme uyum için) kuvvet ya da nominal değer tutulur bölge (yani, Şekil 1C, D gösterildiği gibi bölge 3).
    4. Bozulma uyumu deneyleri için bir basamak yüke cevaben deneysel bozulma uyumu modülü, J, C (t), hesaplarn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      figure-protocol-4 ,
      H (t) Heavyside aşama fonksiyonudur ve R küresel prob yarıçapıdır.
    5. Kuvvet gevşemesi deneyleri için bir basamak girinti derinliği cevaben deneysel kuvvet gevşemesi modülü, G R (t), hesaplar figure-protocol-5 :
      figure-protocol-6 .

4. Darbe Girinti

  1. aletli nanoindenter kalibre ve üreticinin talimatlarına göre sulandırılmış beyin dokuları üzerinde dinamik darbe deneyleri etkinleştirmek için varsayılan ayarlarını.
    1. cımbız kullanarak sarkacın üzerine kaydırarak küresel prob monte edin.
    2. translasyonel vidalanır örnek yazı üzerine bir erimiş kuvars örneği Tutkalsahne.
    3. Kalibrasyon menüsüne gidin ve "Sıvı Hücre." erimiş kuvars numune ile temas kurmaya yazılımın yönergeleri izleyin.
    4. Indenter Türü için "Normal" seçeneğini seçin ve Indenter Yük 0.05 mN varsayılan değerini kullanın. Normal batıcı yapılandırması için kalibrasyon gerçekleştirmek için "Devam" düğmesine tıklayın.
    5. en az 5 mm geri numune sahne taşıyın. Sonda sıvı hücreye indirdi sağlar manivela kolu, montaj ve Indenter Tipi "Sıvı Cell" seçerek yeni yapılandırmada sıvı hücre kalibrasyonu tekrarlayın. Sıvı Hücre Kalibrasyon Factor elde etmek için "Devam" düğmesine tıklayın.
    6. Deney menüsüne gidip seçerek Sıvı Hücre yazılımı seçeneğini etkinleştirin "Özel Seçenekler." En son kalibrasyon değerini kullanın.
    7. Bu HIG test ederken gerekli olan daha büyük bir maksimum ölçülebilir derinliği, yol gibi kondansatör plakası aralığını artırmakhly uyumlu malzemeler.
      1. Sistem menüsü altında sırasıyla 0.5 mN / sn, 0.1 mN / sn, ve 3 V, ofset sarkaç test yükü oranı, sıfır yük oranı ve bekleme rampa değiştirmek için "Non Koruma Ayarları" ve "Makine Parametreleri" seçeneğini seçin.
      2. Bir anahtarla, küçük artışlarla kondansatör plakası aralığı saat yönünde kontrol eden üç fındık açın.
      3. her tam saat yönünde açtıktan sonra, bakım menüsü altında "Köprü Kutusu Ayarı" seçmek ve hemen sarkaç gelen karşı denge ağırlığı hareket gerektiren bir iyi sarkaç testi, edinin.
      4. adımları tekrarlayın 4.1.7.2-4.1.7.3 yaklaşık derinlik kalibrasyon 70,000 nm / V veya daha yüksek bir değere okur kadar.
    8. Bir güç kaynağı ile açılıp kapatılabilir olabilir sarkacın altındaki yeni bir dayanağa yerleştirin. sarkaç hareketi potansiyel bir tıkanıklığı gidermek için sarkaç arkasında oturan orijinal dayanağa geri çekin ve üstü için izindarbe hızları yanı sıra uyumlu örneklerin içine yüksek penetrasyon derinlikleri.
    9. Kabine termal dengeye ulaşmasına izin (yaklaşık 1 saat sürer).
    10. Kabine equilibrates ederken, Sistem menüsüne geri dönün ve "Non Korumalı Ayarlar" seçin ve "Makine Parametreler." 1 mm / sn derinlik kalibrasyonu (dcal) temas hızı ayarlayın, 3 mm / sn birincil girinti iletişim hızı ve 1 mm / sn ultra düşük yük iletişim hızı.
    11. Kalibrasyon menüsü altında bu yeni yapılandırmada standart derinlik kalibrasyonu yapın.
    12. "Impulse Hacmi ayarlayın." Solenoid için güç kaynağı açın ve Deney menüsüne 10 V. git ayarlayın ve "Etki" seçin ve sarkacın salınım mesafesini kalibre etmek için yazılım talimatları (otomatik istemleri) izleyin.
  2. Sıvı hücreye fare beyin dokusunu monte edin.
    1. ste gelen bütün beyin hasat sonrasıp 1.5, CO hemen buz üzerinde yetişkin nöral doku medya için 2 bağımsız besin ortamı saklayın.
    2. Etki girinti kurulum tam tamamlandığında, dikkatli bir şekilde CO 2 bağımsız araç ile bir petri çanağı içine beyin aktarın. iki tarafında düz yüzeylerde 6 mm kalınlığında kesitler halinde beyin dilimleyin.
    3. siyanoakrilat yapıştırıcı ince bir tabaka ile alüminyum örnek mesaja dilimlenmiş doku uyun.
    4. Örnek yazı üzerine ikinci O-ring üzerinde sıvı hücreyi kaydırın ve tam doku batırmak için CO 2 bağımsız ortamın 5 ml sıvı hücreyi dolduracak. Bu örnek sonrası daha sonra dikkatlice aletli nanoindenter içinde öteleme sahneye monte edilir.
  3. beyin dokusu etkisi yanıtı ölçmek.
    1. Gerekirse, küresel prob kaldırmak ve kol çıkarmadan ilgi prob ile değiştirin.
    2. Sistem menüsü altında olmayan Korumalı "seçeneğiniAyarlar "ve" Makine Parametreleri. "5 mikron / sn primer darbeli kontak hızını değiştirin.
    3. manivela kolu üzerinde ucu düzgün banyo yukarıda bulunana kadar uzakta sarkaç (+ x yönü) örnek düşük banyosuna (-z yönünde) ve, x yönünde hareket ettirin. ucu tam banyo ve numune önünde batık kadar + z yönünde hareket ettirin.
    4. Örnek kademe kontrol penceresini kullanarak, dikkatle temas ve daha sonra yaklaşık 30 mikron ile numune yüzeyinden uzağa sahne geri.
    5. Deney menüsü altında bir darbe deneyi kurmak için "Etkisi" butonuna tıklayınız. salıncak mesafe kalibrasyon dayalı ortaya çıkan darbe hızı doğrudan ilişkili olacak özel bir dürtü yükü seçin. planlanan deneme çalıştırın.
    6. sarkaç geri sallanır ve örnek yüzey ölçüm düzlemine hareket etmeye devam ederse, alt limit stop anahtarını kapatın.
    7. sarkaç forw salıncaklar olarak gözlemleyinörnek etkileme ard. zamanın bir fonksiyonu olarak prob değiştirme yazılımı tarafından kaydedilecektir.
    8. xyz sahne penceresi göründüğünde, tekrar sınır durdurma anahtarını çevirin.
    9. Tekrarlayın gerektiği gibi birçok farklı yükler ve konumları test etmek için 3.4-3.8 adımları tekrarlayın.
  4. Maksimum penetrasyon derinlik x max, enerji sönümleme kapasitesi K, ve dağıtma kalite faktörü Q belirlemek için özelleştirilmiş MATLAB komut dosyalarını kullanarak sarkacın zaman tepki vs edinilen deplasmanı analiz edin. 11
    1. Analiz menüsüne gidin ve bir metin dosyasına veri ihracat.
    2. zamanın bir fonksiyonu olarak hızı elde etmek için deplasman zaman türevinin al. Temas noktası x o1 sıfır deplasman ayarlayın.
      NOT: Etki hızı v irtibata maksimum hız hemen önce olan x max deformasyon tekabül eden sonda da.hızı, ilk sıfıra iner. X, O2, X r eşdeğer olan bir sonraki döngüde deforme numune ile temas yeniden başlatmak için gerekli olan konumdur. Rebound hız v dışarı deplasman x r hızıdır.
    3. İlk darbe döngüsü sırasında kurtarıldı ve dağıtılan örnek enerjilerinin toplamı ile normalize örnek tarafından yayılan enerji olarak K (birimsiz) tanımlayın. Sarkacın 21 içsel özelliklerine göre K hesaplamak x o1 (örneğin dönme sertliği ve sönümleme katsayısı gibi), v max x r, x, ve v dışarı.
      NOT:. Daha fazla bilgi için, bir Kalcioglu ark, 2011 yılının çalışmalarını danışabilirsiniz.
    4. deplasman bir sönümlü harmonik salınım hareketi olarak tarif edilebilir olduğundan, dis ve maksimumlar bir üstel çürüme işlevi uygunzaman eğrisi yerleştirme.
    5. E faktörü ile azaltmak için titreşim genliği için gerekli döngü sayısı ile çarpılır π olarak Q (birimsiz) hesaplayın. Daha yüksek Q değeri daha düşük bir enerji yitirme oranı anlamına gelir.

5. Reoloji

  1. Set-up ve üreticinin talimatlarına göre reometre kalibre.
    1. Cihaz / kontrol panelini açarak reometre başlatılamıyor. Kontrol paneli sekmesinde, "başlatılamadı." tıklayın
    2. 25 mm çap ölçümü plakasını (PP25) ve termal sistemini monte edin.
    3. , Reometresi plakaları ve doku arasındaki kayma azaltmak için (İsteğe bağlı) üst reometre plakanın şekli maç ve üst ve alt plaka zımpara kağıdı uygun yapışkan zımpara dilimleri kesip.
    4. Kontrol paneli üzerindeki "sıfır boşluk set" linkine tıklayarak alt ve üst plaka arasındaki teması olun.
    5. cli normal kuvvet dönüştürücüyü sıfır"Normal kuvvet sıfırlayın." Cking
    6. "Ölçüm sistemi" linkine tıklayarak, kontrol paneli üzerindeki hizmet sekme açma ve ardından "atalet testi" tıklayarak bir atalet testi yürütün. Eski ve yeni atalet kaydedin. üretici tarafından listelenen atalet, prob için izin verilen sınırlar içinde olduğundan emin olun.
  2. reometre yükleyin örnek.
    1. Doku hasat ve ~ 5 mm kalınlığında domuz beynin koronal segmenti dilimleme, CO 2 bağımsız orta buz üzerinde saklayın sonra.
    2. İki plaka arasındaki beyin yerleştirin. kaymayı önlemek amacıyla numunenin üst ve alt yüzeyden büyük su damlacıklarını kaldırmak, ancak örnek kuru değildir.
    3. Plaka doku ve ölçülen normal kuvvetin üst yüzeyi ile tam temas edene kadar yavaşça ölçü plakası alt 5-10 dakika dinlenme süresinden sonra 0,01 mn tutarlıdır.
      1. Kontrol panelinde, gittikçe daha düşük yükseklikleri girmek in ölçüm pozisyonu kutusu ve yavaş yavaş ölçüm plaka düşürmek için "ölüm pozisyonu" tıklayın.
      2. Plaka tam doku üst yüzeyi ile temas edene kadar doku ile temas milimetre olan, 0.1 mm'lik artışlarla ölçü plakası alt zaman. ölçülen normal kuvvet 5-10 dk dinlenme döneminden sonra 0.01 mN tutarlı olduğundan emin olun.
      3. İlk ölçülen normal kuvveti kaydedin. Tekrarlanan ölçümler aynı basınç gerilmeleri / soylarının alınmalıdır.
    4. Numune plaka çapını aşıyorsa plastik bıçak ile örnek Trim. doku hidrat numunenin kenarlarında küçük bir ortam hacmi (~ 1-2 mi) pipetle.
    5. (İsteğe bağlı) termal kaputu indirin. Kontrol paneli üzerinde, 37 ° C sıcaklığı ayarlamak ve "set" butonuna tıklayınız.
  3. Malzemenin lineer viskoelastik aralığını (yani, kesme kurmak için bir genlik süpürmeyi yapmakhangi G 've G' faiz (örneğin, 1 rad / sn) frekanslarda) sabittir 'suşları.
    1. Seç "Dosya / yeni". Jel sekmesi altındaki "Genlik süpürme: LVE-aralık" i seçin. pencereyi seçin ve tıklayın "Ölçüm 1:. Genlik süpürme" salınım kutusunun üzerine çift tıklayın. Ilk ve son gerginlik girin (örneğin, 105 0,01), frekans (örneğin, 1 rad / sn) ve on noktaların sayısı (örneğin, 6 puan / Aralık). "Tamam" ı seçin ve başlangıç ​​tıklayın. "
    2. doğrusal elastik sınırın tutarlılığı sağlamak için tekrarlanan denemeler ile birkaç dilim için bu yordamı yineleyin. numunenin eksensel sıkıştırma numuneleri arasındaki sabit kalmalıdır.
  4. Doku (örneğin,% 1 suşu) 22 lineer viskoelastik aralığındaki bir gerilimde doku bir frekans taraması yürütmek ve de (örneğin, 0.1-100 rad / sn) arasında bir frekans aralığında.
    1. tıklayın "Dosya / yeni" ve jel sekmesi altında "Frekans süpürme" i seçin. pencere / Ölçüm 1 tıklayın: Frekans süpürme. salınım kutusunun üzerine çift tıklayın. Frekans aralığını (örneğin, 0,1-100 rad / sn), gerginlik (örneğin,% 1 suşu) ve on yıl başına noktalarının sayısını girin (örneğin, 6 puan / Aralık). "Tamam" ı seçin ve frekans taraması başlatmak için "start" düğmesine tıklayın.
  5. çoğaltır veya üç kez tekrarlayın frekans tarama (adım 5.4).
  6. G 'frekans (frekans süpürme) bir fonksiyonu olarak ve G "veya kesme gerginlik (genlik süpürme) NOT:. G' otomatik olarak hesaplanır ve reometre tarafından ihraç edilen verileri gözden ve G numunenin (maksimum hesaplanır '' ) tepkisel tork genlik T '0 ve dönme deplasman açısı (veya sapma açısı) figure-protocol-7 Ve faz gecikmesiDenklem 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, uygulamalı salınımlı suşuna numunenin yanıtın (Şekil 3):
    figure-protocol-8
    figure-protocol-9
    R ve H örnek yarıçapı ve yüksekliği olduğu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 4, sırasıyla uygulanan bir kuvvet veya girinti derinliği (Şekil 4A, D), verilen, sürünme uyumu için zaman yanıtları (Şekil 4B, E) vs temsili girinti ve kuvvetini göstermektedir ve dinlenme deneyleri zorlamak. Bu veri ve sistemin geometrisini kullanarak, sürünme uyum J c (t) ve gevşeme modülü G R (t) zorlamak beyin (Şekil 4C, F) farklı bölgeler için hesaplanabilir. Daha önceki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada sunulan her teknik beyin dokusunun mekanik özellikleri farklı yönlerini ölçer. Bozulma uyumu ve stres gevşeme modülleri zamana bağlı mekanik özelliklerinin bir ölçüsüdür. Depolama ve kayıp modülleri oranı bağımlı mekanik özellikleri temsil eder. Darbe girinti ayrıca oran bağımlı mekanik özelliklerini ölçen, ancak enerji dağılımı bağlamında. Doku mekanik özelliklerini karakterize ederken, hem AFM etkin girinti ve reolojisi yaygın kullanılan yöntemlerdir. Daha önce tarif edildiği gibi zamana bağlı malzeme öze...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın Ulusal Multipl Skleroz Derneği ve Simons Sosyal Beyin Merkezi tarafından desteklendiğini kabul ediyoruz. BQ, ABD Ulusal Savunma Bilimi ve Mühendisliği Yüksek Lisans Burs programından destek aldığını kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
XylazineLloyd Laboratoriedreçete ilacı
KetaminAnaSed Enjeksiyonlarıreçete ilacı
Vibratom (Titreşimli bıçak mikrotomu)LeicaVT1200
Hazırda Bekletme-A OrtaGibcoA1247501CO2< / sub> yetişkin dokusu için bağımsız nöral ortam
Atomik Kuvvet Mikroskobu, MFP-3D-BIOİlticaAraştırması-Petri
Bulaşık IsıtıcıİlticaAraştırması-AFM
Probu, 0.03 N/m, 10  &mikro; m yarıçaplı borosilikat küreNovascanPT.
Cell-TakCorning354240midye türevi biyoyapıştırıcı
Sodyum BikarbonatSigma-AldrichS5761alternatif tedarikçiler kullanılabilir
Sodyum Hidroksit, 1 NSigma-Aldrich59223Calternatif tedarikçiler kullanılabilir
Aletli Girinti, NanoTest Vantage MicroMaterials Ltd.-prob ucunun işlenmesi gerekiyor (çelik yassı zımba, 1  mm çap, 4-5  mm uzunluk)
NanoTest Sıvı Hücre MikroMalzemeler Ltd.-
Paralel Plakalı Reometre MCR501Anton-Parr-PP25
 Anton-Parr-25mm çapında düz ölçüm plakası
Yapışkanlı Zımpara KağıdıMcMaster-Carr4184A48alternatif tedarikçiler kullanılabilir
Loctite 4013 Anında YapıştırıcıHenkel20268alternatif tedarikçiler kullanılabilir
GS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. , 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911(2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317(2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101(2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88 (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7 (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. , (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43 (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91 (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46 (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. , Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13 (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". , Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010(2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27 (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41 (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128 (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3 (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4 (5), 140046(2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222 (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507(2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. , 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45 (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16 (7), 075002(2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34 (2), 127-138 (1997).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Brain Tissue CharacterizationAtomic Force MicroscopyImpact IndentationRheometryViscoelastic PropertiesMechanical CharacterizationCreep ComplianceForce RelaxationFrequency SweepHydrated Tissue

İlgili makaleler