Yöntem makalesi

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

DOI:

10.3791/54202

⸱

22 Ağustos 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heparin ve protaminden üretilen kendiliğinden birleşen polielektrolit kompleksleri (PEC), osteojenik büyüme faktörlerinin salınımını yakalamak ve düzenlemek için aljinat boncuklar üzerinde biriktirildi. Bu uygulama stratejisi, spinal füzyon uygulamalarında BMP-2 dozunun 20 kat azaltılmasını sağlar. Bu makale, PEC'lerin faydalarını ve üretimini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rekonstrüktif kemik ameliyatlarında sırasında, büyüme faktörleri suprafizyolojik miktarda ampirik başarılı kemik füzyonu teşvik etmek iskelelerinin üzerine yüklenir. yüksek ölçüde güçlü bir biyolojik maddelerin büyük dozlar nedeniyle, hızlı enzimatik bozulmaya sonucu büyüme faktörü instabilitesi gibi yerleştirme alanında büyüme faktörü yeterli miktarda lokalize taşıyıcı verimsizliklere yol gerekmektedir. Bu nedenle, onların serbest bırakılmasını BMP-2 / NELL-1 gibi büyüme faktörlerinin istikrarını uzatmak ve kontrol stratejileri aslında onların etkili doz düşük olabilir ve bu nedenle gelecekteki kemik rejenerasyonu ameliyatları sırasında büyük dozlarda ihtiyacını azaltır. sırayla Bu yan etkiler ve büyüme faktörü maliyetlerini azaltacaktır. Kendinden monte PECS in vivo istikrarı artırarak bağlama heparin ve daha fazla güçlendirebilir büyüme faktörü biyoaktivite aracılığıyla BMP-2 / NELL-1 teslimat daha iyi kontrol sağlamak için imal edilmiştir. Burada delive yardımcıları PEC üretim sadeliği göstermektedirrekonstrüktif kemik ameliyatlar sırasında büyüme faktörleri, çeşitli Ry.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Psödoartroza sıklığı dejeneratif omurga kaynaştırma ve revizyon omurga cerrahisinde 1 içinde% 10 ila 45 kadar yüksek olduğu rapor edilmiştir. BMP-2, Nell-1 1 ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) olarak osteojenik büyüme faktörleri de novo osteogenesisi teşvik etmek getirilmiştir omurga füzyon ve diğer rekonstrüktif kemik ameliyatları sırasında psödoartrozu oranını azaltmak için. Bunlar arasında, BMP-2 spinal füzyon 2 için popüler bir seçimdir. Uyarılması ve yeni kemik oluşumunu kolaylaştırmak BMP-2 gücü de 3 kanıtlanmış olmasına rağmen, Böyle heterotopik kemik oluşumu, seroma ve hematom oluşumu, inflamatuvar yanıt, radikülit, vertebral gövde osteoliz ve retrograd ejakülasyon olarak klinik olarak anlamlı komplikasyonlar nedeniyle 4,5 kullanılan suprafizyolojik miktarlarda endişe konusu olmaya devam etmektedir.

Bu nedenle, BMP-2 dozunun düşürülmesi de bir ilgili bir strateji kalıryan etkileri en aza indirmek için cezbeder. Ayrıca, verimli taşıyıcı sistemleri BMP-2, çağdaş kollajen sünger taşıyıcı sistemlerinde gözlenen ilk patlama salınımını baskılamak ve daha fazla bu güçlü sitokinin uzun süreli ve yerel teslim geliştirmek için gereklidir. Katyonik ve anyonik polielektrolit alternatif katman-katman montajı çok iskele matrisleri veya implante edilebilir malzemelerin 6 yüzeyinde polielektrolit kompleksleri oluşturmak için ayarlanabilir bir yöntem olarak da kullanılabilir. Bu açıdan, (bütün biyolojik maddelerin en yüksek negatif yük yoğunluğuna sahip olan bilinen) heparin yakından takip ettiği, elektrostatik ve heparin bağlayıcı alan ile büyüme faktörleri, çeşitli bağlandığı bilinmektedir. Gerçekten de, heparin yarı ömrünü uzatmak ve dolayısıyla çeşitli büyüme faktörleri biyo-aktivitesini güçlendirdiği gösterilmiştir.

Buna dayanarak, bizim grup heparin tabanlı polielektrolit kompleksi (PEC) olduğunu imal etmek için bir katman-katman öz-montaj protokolü adapte yükler ve immobilizasyon 7,8 sırasında osteojenik büyüme faktörlerinin biyoetkinlikleri korur. Aljinat mikroboncuk çekirdek α-L-guluronat (G) iki değerlikli katyon kalsiyum ya da stronsiyum iyonlarıyla aljinat artıkları çapraz bağlanması ile imal edilmiştir. Aljinat damarın en az bir biyolojik olarak parçalanabilir bir iskele matrisidir; hangi implantasyon sonra, kemikli büyümesi için oda sağlayan füzyon yatakta emilir. Poli-L-lisin (PLL) ya da protamin (bu durumda, alginat mikroboncuk, taşıyıcı çekirdek) iskele matris ve negatif yüklü heparin hem ile bir araya katyonik bir tabaka olarak kullanılmaktadır; anyonik heparin tabakası fonksiyonları stabilize etmek ve yüklenen büyüme faktörleri lokalize iken. Üçlü tabaka PEC bir domuz modelinde 9 büyüme faktörü yükleme kapasitesini artırmak için gösterilmiştir. Son zamanlarda, PEC taşıyıcılar başarılı bir şekilde sıçan 10 ve spinal füzyon 8 domuz modellerinde en az 20-kat BMP-2 etkin dozunu azaltmak için gösterilmiştir.

ntent "> Burada bir örnek osteojenik büyüme faktörü olarak BMP-2 kullanılarak spinal füzyon gelişmiş büyüme faktörü teslimat ve diğer rekonstrüktif kemik ameliyatları için imalatı Halk yöntemlerini rapor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. aljinat çözeltisi hazırlanması

  1. sodyum alginat (ışınlanmamış) ya da 8 Mrad 400 mg, 200 mg çözülür iki defa destillenmiş su, 10 ml sodyum alginat ışınlanmış ve yayılan alginat 1 saat ve ışınlanmış alginat 15 dakika boyunca çalkalanır. gece boyunca 4 ° C 'de aljinat çözeltisi saklayın. aljinat microbead fabrikasyon önce steril 0.2 mikron şırınga filtresi ile aljinat çözüm Filtre.

2. Aljinat microbead İmalatı

  1. % 70 etanol ile elektrostatik boncuk jeneratör ve şırınga pompası dezenfekte edin ve bir Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini (Şekil 1) koyun.
  2. Boncuk jeneratör içinde bir manyetik karıştırma çubuğu ile bir cam lavabo yerleştirin.
  3. 9 cm havzası üzerinde boncuk jeneratör kol elektrodu ayarlayın.
  4. Kol elektrodun tırtıklı vida 2 boncuk jeneratör elektrod kablosunu ve içine SRCL 2 solüsyon 80 ml ​​dökünhavza.
  5. Yük şırınga ve kauçuk tüpe 0.2 um filtre edildi aljinat çözeltisi 5 mi. kol elektrot kauçuk tüp bağladıktan sonra, boru içindeki havayı dışarı atmak ve meme ucu aljinat çözüm sunmak için 2 dakika süreyle 5 ml / saatte bir şırınga pompası açın. şırınga pompası kapatın.
  6. Sonraki, kapsülleyicide geçin ve sonra, şırınga pompası microbead nesil başlaması. 5 ml / saatlik bir aljinat akış hızı kullanıldı ve kapsülleyici 5.8 kV voltaj ayarlayın. Bu mikro-düzensiz boyutlu ve şekilli olması eğilimi, ilk iki dakika (veya şırınga pompalanan ilk 0.5 mi aljinat çözeltisi) esnasında üretilen mikroboncukları atın.
  7. 0.2 M stronsiyum klorür çözeltisi içinde daha sonra, mikro-boncuklar toplayın. aljinat çözeltisi önceden planlanmış hacmini pompalama sonra şırınga pompası ve (bu sırayla) kapsülatör hem kapatın. microbead imalat sonraki partiler için bu işlemi tekrarlayın. Tamamlandığında, çevirmekİlk şırınga pompası f kapsülleyicide izledi.
  8. Çapraz bağlama doldurun ve jeli stabilize etmek için gece boyunca 4 ° C 'de 0.2 M, stronsiyum klorür solüsyonu, 20 ml mikro-boncuklar saklayın.

Aljinat mikro boncuklar 3. Ölçü

  1. plastik bir pipet ile aljinat mikroboncuk 0.5 ml toplar ve bir cam slayt üzerine yerleştirin. 10X büyütmede bir optik mikroskop altında, mikro-boncuklar gör. Bir mikroskop CCD kamera ile mikro-on görüntüleri çekmek. çözünürlüğü 2048 x 1536 TIFF formatında ölçek çubuğu (500 mikron) ile görüntüleri kaydedin.
  2. ImageJ uzunluk araçlarını kullanarak, mikro boncuklar ve ölçek çubuğu (Şekil 2) boyutunu ölçmek. mikrometre piksel microbeads uzunluğu dönüştürün.
    1. satırı araçları üzerine tıklayın ve aljinat boncuk ortasında bir çizgi çizin.
    2. "Tedbir" menü çubuğunda "Analiz" ve seçin tıklayın. Bir pop-up penceresi açılacaktır.
    4. ölçek çubuğu x 500 um aljinat boncuk / uzunluğu uzunluğu: formül kullanılarak gerçek uzunluğu aljinat boncuk çapı dönüştürün. Örneğin, 1.420 (ImageJ ile ölçülen çap) / 2,657 (ImageJ ile ölçülen ölçek çubuğu uzunluğu) * 500 mikron = 267 mm.
  3. mikro-her parti temsilcisi boyutu olarak (ortalama ± standart sapma) 100 mikro boncuklar ortalama büyüklüğü göz önünde bulundurun.

4. Sterilizasyon

  1. 100 mikron naylon süzgeç kullanarak mikrobilyeleri toplayın ve çift distile su ile boncuk yıkayın.
  2. Bir spatula ile, 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine 0.1 ml aljinat solüsyondan yapılan tüm mikroboncukları transferi ve kurumasını önlemek için bir gazlı bez ile kaplayın.
  3. Son olarak, bir sıvı modunu kullanarak otoklav ile sterilize mikroboncukları (115 ° C, 15 dakika) ya da m uygun olarakanufacturer spesifikasyonları. Kurutma boncuk önlemek için bölmeye damıtılmış su, 1.5 L ilave edin.

5. Protamin ve Heparin Kaplama

  1. BSL-2 başlık içinde, 2 mg / oda sıcaklığında 1 saat boyunca (0.2 um'lik bir şırınga filtresi kullanılarak sterilize edilmiş) mi protamin çözeltisi, 1 ml steril mikroboncukları inkübe edin.
  2. 1 saat (Basamak 5.1) mikroboncuklar inkübe edildikten sonra, mikro bisinkoninik asit (MicroBAC) testi (bölüm 6) için protamin çözeltisi 150 ul toplar.
  3. çift ​​distile su ile iki kez protamin kaplı mikroboncuklarm yıkayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g'de bir masa üstü santrifüj kullanılarak dönerler. Santrifüj işleminden sonra, bir şırınga kullanılarak su aspire.
  4. 0.5 mg, 1 ml protamin kaplanmış olan mikro inkübe / polielektrolit kompleksi oluşturmak için 30 dakika (PEC) (a 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak sterilize edilmiş) ml heparin solüsyonu.
  5. protamin kaplanmış mikro-f inkübe edildikten sonraya da 30 dakika (Adım 5.4), heparin içeriği (bölüm 7) belirlemek için heparin solüsyonu 400 ul toplamak.
  6. İnkübasyondan sonra, iki kez distile su ile iki kez yıkayarak Halk Bağlanmamış heparin yıkayın.

6. Protamin İçeriği

  1. üretici talimatlarına göre MicroBAC testi yapın. Kısaca, 96 gözlü bir plaka 150 ul protamin çözeltisi (önce ve mikro-ile inkübasyondan sonra toplanmıştır) ekleyin. 150 ul MicroBAC çalışma çözeltisi ekleyin.
  2. Kalibrasyon standartları, albümin çözeltisi (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ve 200 ug / ml) kullanın.
  3. 60 ° C'de 60 dakika süreyle inkübe karışımı. 562 nm'de bir spektrofotometre ile absorbansı ölçülür.
  4. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, her bilinmeyen numune protamin konsantrasyonunu belirlemek için standart bir eğri kullanın.
  5. içinde protamin toplam miktarını çıkartarak mikro-protamin içeriğini belirlemek(Mikrotaneciklerin ile inkübasyondan sonra) kaplama çözeltisi içinde kalan protaminin miktarından (mikrotaneciklerin ile inkübasyondan önce) kaplama solüsyonu.

7. Heparin İçerik

  1. Mavi 4 mg toluidin ve 0.01 N hidroklorik asit içinde 20 mg sodyum klorür çözülmesiyle çalışma çözeltisinin 10 ml hazırlayın.
  2. 30 sn 3 ve vorteks: 2 oranında çalışma çözeltisine (adım 5.5) örnek 400 ul ekleyin.
  3. n-heksan (çalışma reaktifi çözeltisine, eşdeğer hacimde) 600 ul ilave edin ve toluidin mavisi heparin kompleksi elde etmek için karışımın girdap.
  4. Aspire Faz ayrılmasından sonra şırıngayla sulu faz 200 ul.
  5. 631 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak sulu faz içinde ihtiva un ekstre toluidin mavisi miktarını ölçün.
  6. 0-20 ug / ml heparin standart çözümler hazırlayın.
  7. ug / m heparin konsantrasyonuna karşı her heparin standardının 631 nm okuma arsal. Her numunenin heparin konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğri kullanın.

Katman-katman Yapının 8. Konfokal görüntü

  1. protamin, Heparin ve NELL-1 / BMP-2 floresan analog CF-405 protamin (mavi), CF 594 heparin (kırmızı) imal ve FITC NELL-1 / FITC etiketli göre olan (yeşil) BMP-2 + heparin + protamin üreticinin etiketli Teknik veri sayfası.
  2. Kat 100 fluoresan analog 300 ul ug mikro-(5.3-5.6 tarif edildiği gibi kaplama yöntemi) CF-405, protamin (mavi) (2 mg / ml, 1 saat inkübasyon), CF 594 heparin (kırmızı) (0.5 mg / ml 30 dakika) ve FITC etiketli NELL-1 / FITC etiketli (yeşil) BMP-2 (1.5 mg / ml, gece boyunca). Bağlanmamış flüoresan protamin, heparin ve NELL-1 / BMP-2 ortadan kaldırmak için damıtılmış su ile iki kez, mikro-boncuklar yıkayın.
  3. 10X büyütmede bir konfokal mikroskop kullanılarak katman-katman yapısı (Şekil 3) uyun. 7

9. BMP-2NELL-1 Alımı ve Yayın ve

  1. Yük PEC 100 ug BMP-2 veya NELL-1 çözeltisi 1.5 mg / ml 13.3 ul. 10 saat çalkalanarak 30 rpm altında 4 ° C'de inkübe edin PEC.
  2. Sabit çalkalama (30 rpm) ile 37 ° C'de fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 ml mikroboncukları bırakın.
  3. 1 mL süpernatan toplamak ve 1, 3, 6, 10 ve 14 gün sonra, 1 ml PBS ile değiştirin.
  4. alımını değerlendirmek ve üreticinin protokolüne uygun olarak ELISA yöntemi ile BMP-2 etkinliğinin bırakın. alımını değerlendirmek ve üreticinin protokolüne uygun olarak karboksibenzoil kinolin-2-karboksaldehit (CBQCA) proteini deneyi yöntemi kullanılarak nell-1 etkinliğini bırakın.
  5. zaman (t) kümülatif serbest belirleyin:
    zaman zaman (t) + Önceki bırakmada zaman (t) = Release kümülatif salım (t-1).
  6. zamana karşı BMP-2 ve Nell-1 kümülatif salınımını çizilir.

10. İn Vitro BiyoaktiviteNELL-1

Not: Nell'ın-1 PEC serbest biyo-tavşan kemik iliği kök hücreleri (rBMSC) alkalin fosfataz (ALP) ekspresyonunu artırmak için kabiliyeti ölçülerek değerlendirildi.

  1. Tohum 20,000 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına rBMSCs ve bunları fetal sığır serumu (FBS) CO2, 37 ° C'de ve% 5 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 1 ml bir gün için büyümeye olanak sağlar.
  2. 24 saat sonra, 10 -8 mol / L deksametazon,% 10 FBS,% 2 penisilin streptomisin, 50 mg / ml, askorbik asit, 10 mg / L, beta-gliserofosfat ile takviye edilmiş bir osteojenik ortamında (DMEM, 1 ml orta yerine ve ) 37 ° C'de 7 gün ve% 5 CO2 için.
  3. hücreler (bu osteojenik orta değişim sırasında PEC mikro-boncuk arınma önler) ayrı PECleri tutmak için 300 mikrogram PEC-NELL-1 hücre kültürü ekler içinde ve PEC (adım 8.2 dan itibaren) (TC insert) yerleştirin. Yeri TC pl iyi 24 takın14 gün boyunca yedi.
  4. Bir kez her üç günde bir, aspirat 1 TC insert dışında bir iğne koyarak osteojenik orta ml ve taze osteojenik ortamın 1 ml ile değiştirin.
  5. İnkübasyondan 7 ve 14 gün sonra, kit, üreticinin protokolüne uygun olarak ALP deney kiti ile ALP aktivitesi belirlenir.
    1. 10 dakika boyunca 4 ° C 'de,% 0.1 Triton X-100 içeren deney tamponu ile lizleyin hücreleri. Bir hücre kazıyıcı kullanarak yapıştırılır hücreleri kazımak. en az 60 dakika boyunca karıştırılarak 4 ° C'de bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
    2. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 2,500 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. ALP tahlil için süpernatant toplayın.
    3. 200, 96 gözlü bir levhanın gözleri ml 0 ng / seri olarak seyreltilmiş alkalin fosfataz standart solüsyon 50 ul ekle. alkalin fosfataz standart nihai miktarlar / 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15 ve 0 ng.
    4. Seyreltme b aşama 10.5.2 süpernatant ekleyin (50 ul / oyuk) ve seyreltilmişUffer.
    5. Her kuyuya p-nitrofenil fosfat (pNPP) alt-tabaka çözeltisi 50 ul ekle. yavaşça 30 saniye boyunca plaka sallayarak reaktifleri karıştırın. Karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe karışımı. plaka okuyucusu ile 405 nm'de absorbansı ölçülür.
    6. kalibrasyon eğrisi kullanılarak ALP aktivitesinin hesaplanması.
  6. üreticinin talimatlarına göre MicroBAC protein tahlil kiti kullanılarak protein içeriği belirlenir. Protein içeriği ALP aktivitesini bölerek ALP aktivitesini normalleştirmek.

11. Hücre Canlılık

  1. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 24 saat -2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) 37 ° C'de DMEM +% 10 FBS, 1 ml PEC-nell-1 200 mg inkübe deneyi.
  2. Tohum 2.000 rBMSCs oyuk başına ve 96 oyuklu bir plaka içerisinde (% 10 FBS DMEM 100 ul) 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 1 gün süreyle inkübe edilir.
  3. PEC-NELL-1 / PEC ekstresi 100 ul DMEM +% 10 FBS yerine yerleştirin ve inkübe37 ° C'de,% 5 CO2.
  4. 1 gün ya da 3 gün inkübasyondan sonra, 5 mg / ml MTT solüsyonu 10 ul ve daha fazla karanlıkta 4 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edilir.
  5. Formazan kristalleri çözmek üzere, her bir oyuğa 100 ul DMSO çözeltisi ekleyin.
  6. Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 570 nm'de absorbans belirler.
  7. göreceli büyüme oranını hesaplayın:
    figure-protocol-1

İskele ve BMP-2 ve NELL-1 Yükleniyor içine 12. Ambalaj

  1. BSL-2 odasının içinde sterilize edilmiş bir spatula kullanılarak tri-kalsiyum fosfat (mPCL-TCP) iskele - Bir biyoçözünür tıbbi dereceli polikaprolakton gözeneklerine PECleri paketleyin.
  2. PEC dolu mPCL-TCP yapı iskelesi üzerinde 1.5 mg / BMP-2 veya nell-1 ml solüsyonu eklenir ve gece boyunca 4 ° C enkübe edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim bir taşıyıcı olarak, protamin benzer kimyasal özelliklere sahip olarak poli-L-lisin yerine seçilmiş ve FDA heparin antidot olarak onaylanmıştır. Optik mikroskop sonuçlar ışınlanmamış mikro-267 ± 14 um'lik bir çapa sahip küre şekilli olduğunu göstermiştir. (0.35 mm meme, 5 ml / saat ve 5.8 kV akış oranı). Işınlanmış mikro-çoğunluğu gözyaşı şeklindedir. Işınlanmış mikro-yuvarlak bölümü üzerinde ölçülen çap (4 ml / sa ve 6 kV akış oranı, 0.35 mm meme) 212 ± 30 um idi. (Şekil 4...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, katman-katman kendinden montaj yoluyla Halk hazırlanması için bir yöntem sunmaktadır. katman-katman yapısı protamin, heparin, BMP-2 ve NELL-1 ve konfokal mikroskopi floresan analogları kullanılarak görüntülenmiştir. Alımı ve serbest testler PEC üzerinde heparin osteojenik büyüme faktörü alımı ve serbest aracılık ettiğini göstermektedir. PEC yönteminin alımı verimliliği: NELL-1: 86.7 ± 2.7%, BMP-2: 70.5 ± 3.1%. PEC, taşıyıcı, örneğin kalsiyum apatit parçacıklar (% 40-80), 11 olarak saf bir adsorps...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz herhangi bir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmalar Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi Klinisyen Bilim İnsanı - Bireysel Araştırma Hibesi (CS-IRG), NMRC/CIRG/1372/2013 ve NMRC EDG/0022/2008 tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yaşam Bilimleri Akrodisk 25  mm Şırınga Filtresi ile 0.2  &mikro; m Supor Membran PALL PN4612Steril protamin, ultrafiltrasyon ile heparin çözeltisi
24 kuyulu plakaHücre Yıldızı 662160
96 kuyulu plaka Nuclon DeltaYüzey Thermo Fisher Scientific167008
(3- (4,5-Dimetiltiyazol-2-il) -2,5-Difeniltetrazolyum Bromür), MTTSigma AldrichM5655PEC-NELL-1 Asetonun sitotoksisitesini ölçün
Fisher ScientificA/0600/17Çökelti CF-405
Etiketli protamin
Alamar BlueInvitrogen, Yaşam TeknolojileriDAL 1025PEC-BMP-2
Alkalin Fosfataz Testi (ALP) tahlil kitininAnaspecAS-72146
Amonyum KlorürMerckArt 1145FITC etiketlemesinde reaktifi durdurun
Susuz Dimetil Sülfoksit (DMSO)İnvitrojen, Life TechnologiesD12345Floresan izotiyosiyanat I
Dimetil Sülfoksit ( DMSO)Sigma AldrichÇözünü  formazan 
OtoklavHirayamaHU-110Aljinat boncukları buharla sterilize
edin Beta-gliserofosfatSigma AldrichG9422
BMP-2 (Infuse Kemik Grefti Büyük II Kiti) Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, ABD7510800Osteojenik Büyüme Faktörü, FITC kaplini
Karboksibenzoil kinolin-2-Karboksaldehit (CBQCA)Thermo Fisher ScientificA-6222NELL-1 protein
Hücre Süzgecini ölçmek için (100  &mikro; m)BD Science352360ALP testi için PEC'i
tutun Hücre Kazıyıcı 290   mm Bıçak Genişliği 20  mmSPL Yaşam Bilimleri90030Hücreyi 24 oyuklu plakadan ayırın
CF 405S, Süksinimidil EsterSigma AldrichSCJ4600013Protamin etiketleme için mavi floresan boya
CF 594, HidrazidSigma AldrichSCJ4600031Heparin etiketleme için koyu kırmızı floresan boya
SantrifüjBeckman CoulterMikrofüj 22R
Konfokal MikroskopOlimpos FV1000
DeksametazonSigma AldrichD4902Osteojenik büyüme ortamının bileşeni
Dekstran Tuz Giderme SütunlarıDelmek (Thermo Scientific) 43230
DMEMGibco 12320
BMP-2 Kantikin ELISA KitiR& D SistemiDBP200BMP-2 salınımını belirleyin
Fetal Sığır Serumu FBSHycloneSV30160.03
Fluoescein İzotiyosiyanat, İzomer ISigma AldrichF7250NELL-1 ve BMP-2 etiketleme için yeşil floresan boya
ThinCert Hücre Kültürü Ekleri,
24 Kuyulu plakalar için, Steril		Greiner ve nbsp;662630Osteojenik ortamı değiştirirken PEC'in yıkanmasını önler
Havard Appartus Şırınga Pompası (11 artı)Havard Aparatı70-2208
n-Hekzan (%>99)Sigma Aldrich139386
HeparinSigma AldrichH3149Heparin bağlanma alanı ile osteojenik
büyüme faktörü ile
Hidroklorik asit (%37)Merck100317Yüksek Korozif
İnkübatörBağlayıcıC8150
MicroBCA Protein Test kiti23235
Mikroplaka OkuyucuTecanInfinite M200
Nisco hücre kapsülleyiciNisco Mühendislik A.ŞKapsülleme ünitesi VAR V1
Floresan MikroskopOlympusIX71
mPCL-TCP İskele (Gözenek boyutu 1.3  mm)OsteoporPCL-TCP 0/90PEC'yi in vivo< / em için tutun> çalışma
Penisilin-Streptomisin 10.000 birim / ml, 100 nbsp; mlHiklon Hücre KültürüSV30010Antibiyotik
10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS)VivantisPB0344-1L10x Çözelti, Ultra Saf Sınıf
Poli-L-Lizin MW 15.000-30.000Sigma AldrichP2568Polikatyon
Protamin Sülfat tuzu, SomonSigma AldrichP4020Polikatyon
ÇalkalayıcıLabnetS2025
Yılan Derisi Diyaliz Tüpü 3.500 MWCO 22  mm x 35 fitThermo Fisher Scientific68035Reaksiyona girmemiş FITC'yi diyalizle çıkarın
Sodyum KlorürMerck1.06404.1000
Sodyum HidroksitQrecS5158
Sodyum BikarbonatABD BiyolojikS4000Tampon
Sodyum karbonatSigma AldrichS7795-500GTampon
Stronsiyum Klorür HeksahidratSigma Aldrich255521Aljinat
Spatula3dia
5 ml şırıngaTerumo140425Riçin çapraz bağlayıcı Şırınga çapı akış hızını etkiler
75 cm2 Hücre Kültürü Şişesi EğimliBoyun Corning730720
Toluidin MaviSigma Aldrich52040Heparin testi
Tripsin 1xHiplon Hücre KültürüSH30042.01
Sodyum aljinatNovamatrix (FMC Biyopolimer, Princeton, NJ)Pronova UPMVGMikro boncukların çekirdek malzemesi
sitotoksisitesini ölçün ile etkileşime giren stabilizatör bileşenini çıkarmak için diyaliz gereklidir; bağlanır ALP ve microBCA tahlilleri için Termoscientific .

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
  3. Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
  4. Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
  5. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  6. Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
  7. Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
  8. Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
  9. Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
  10. Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
  11. Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
  12. Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
  13. Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aljinat MikroboncuklarKonfokal MikroskopiAlkalen Fosfataz AnaliziKemik Morfogenetik ProteiniNELL Benzeri Molek lProtamin Heparin KaplamaStronsiyum Klor r zeltisi

İlgili makaleler