T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

T lemfosit yapışması T hücresi trafiği ve antijen sunumu üzerinde kritik bir rol oynayan ^3, sağlıklı bir bağışıklık sisteminin belirgin süreçlerin bir dizi aracılık eder. Immün gözetim veya yapışma için, bu iki geniş roller kritik aktif bir bağışıklık tepkisi sırasında belirtir. ^4. T hücresi-endotelyal hücre etkileşimleri fizyolojik sinyal olayları (APC) etkileşimlerinin sergileyen hücre T hücre-antijen farklıdır ve bu nedenle ayrı işlemler gerektiren çalışma en iyi yer sinyalizasyon kaskadlar anlamak için. lenfosit ekstravazasyon sırasında kan damarı çeperi bir T hücresinin Sıkı yapışma, hızlı ve dinamik integrin aktivasyonunu gerektirir. Endotel boyunca aktif bir devlet integrin ve yapışma molekülleri arasındaki sıkı etkileşim T hücreleri hücre geçit keyfi bir alanda arama yüzeyi boyunca tarama sağlayan, kan akışına dayanıklı yapışma yol açar. ⁵ T hücresi bi taramasını -directionally alonga damar duvarı T hücresinin bir tat yapışkan ön ucu, polarize yapışma bağımlı olduğunu. ^6. En önemlisi, sıkıca yapışmasını ve göç kan akımı dolaşan tarafından üretilen kesme kuvvetine direnç gerektirir.

lenfosit yapışma incelemek için deneyler tasarlarken, dikkat ilgi belirli uyarana dikkat edilmelidir. aktivasyonu integrin T hücresi yapışma tüm biçimlerinin yaygın ve ciddi bir komponent ise, aktivasyon kaskadları tek tek reseptör ve ko-reseptörlerin aşağı benzersiz olması muhtemeldir. Aynı şekilde, integrin ve adezyon molekül çiftleri uzman mikroçevrelerde ve belirli alt popülasyonlar üzerinde çalışır. Bu şekilde, bu çiftleri oldukça farklı düzenlenmiş olabilir. Burada sunulan model, makaslama stres koşulları altında yer alan aktivasyon integrin giden sinyal basamaklarının çalışma için idealdir. ⁷ Bu etkileşimler yeterince statik adhesi içinde anlaşılamazsistemde bağlı etkisi, bu kuvvetler ⁸ rağmen., T hücresi davranışına doğrudan sahip olduğu gösterilmiş olan insan ICAM-1 (CHO-ICAM hücreleri) ifade etmek üzere geliştirilen T hücreleri ve CHO (Çin hamster yumurtalık) hücreleri sistemi olabilir, burada sunulan kolayca lökosit popülasyonları veya adezyon molekülleri farklı çalışma için modifiye edilebilir.

Bu deney, lökosit ekstravazasyonu Sıkı yapışma aşaması için bir model sağlayarak, kesme zoru stresi ile T hücresi yapışma ve integrin aktivasyonunu ölçmek için bir yöntem sağlar. CHO-ICAM hücreler kullanılarak canlı hücrelerde ligandının LFA-1 afinitesi ilgi çeşitli stimulasyona tepki olarak bir gerçek zamanlı olarak incelenebilir. Bu teknik, kolay büyük ölçüde diğer modellere kıyasla kan akışını ve kesme stresi modellemek için gerekli ekipman basitleştirilmesi, bir şırınga pompası ile kombinasyon halinde ticari olarak temin edilebilen mikro-akış odaları elde gerektirir. ⁹ Bu testin bir başka önemli avantajı, belirli bir sinyal olduğucascades ve bireysel integrinlerin elde edilen aktivasyon durumu temiz bir ilgi insan adezyon moleküllerini eksprese eden işlenmiş CHO hücrelerinin kullanımı yoluyla incelenebilir. Buna ek olarak, canlı hücre görüntüleme ile nicel veriler kombinasyonu, bu yöntemin önemli bir avantajıdır. Statik T hücre yapışmasının bir çok deney güzel T hücresi-APC etkileşimlerinin model, tarif edilmiş olmasına rağmen, genel olarak, bu modeller, T hücresi-epitelial yapışma dinamik yakalama işlemini yetersizdir. bir yapışma deneyi seçerken Bu nedenle, söz konusu uyaran düşünülmelidir.

1. Kaplama CHO-ICAM Hücreleri

Not: Bu adımın amacı konfluent tek tabaka üretme hedefi ile gece boyunca büyümeleri için akış gözlerinden CHO-ICAM hücreleri plaka etmektir.

1. % 5 ile 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (CHO-ICAM tam kültür ortamı) ile desteklenmiş 10 mi RPMI ortamında 10 cm doku kültürü tedavi kültür tabaklarında CHO-ICAM hücreleri korumak CO _2.
2. hücreleri toplamak için, 1 ml% 0.5 tripsin-EDTA ekleyin ve yavaşça çalkalanarak 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. ortam 4 ml tripsin nötralize.
3. Bir hemasitometre kullanılarak CHO-ICAM hücrelerin sayısı ve odasının başına 0.75 x 10 ⁵ hücre hesaplar. Not: Bu deneyde: 2.25 x 10 ⁵ hücre 3 odacıklı tohum için gerekli olacaktır.
4. Santrifüj 0.75 x 10 ⁵ CHO-ICAM 500 xg, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bölme başına hücre ve CHO odası 30 ul hücre pelletini-ICAM Komple kültür ortamı.
   Not: Bu deneyde 90 ul 3 odacıklı tohum için gerekli olacaktır.
5. Yavaş yavaş akış odasının bir rezervuar içine hücreleri ekleyin. Hücreler,% 5 _CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde 5 dakika boyunca oturmasına izin verin.
6. Her odanın iki rezervuar boyunca tam kültür ortamı 200 ul ekleyin. Sistem equilibrates olarak ikisi arasında alternatif eklemeler hücrelerin hareketini önlemek için.
7. % 5 CO ₂ ile 37 ° C inkübatör içinde bir gecede inkübe hücreleri.

T hücrelerinin 2. Hazırlık

Not: Bu deney, birincil insan T hücreleri veya T hücresi hattı ile yapılabilir. Kan T hücre izolasyonu protokol daha önce tarif edilmiştir. ¹⁰ kullanılarak primer insan T hücreleri en iyi sonuçlar için taze izole edilmiş hücreler kullanın. bir T hücresi hattı kullanılarak durumunda, hücre kaynağı tarafından belirlenen bir kültür protokolü takip. floresan mikroskobik hücrelere tespit etmek içinT hücreleri, karboksi floresan süksinimidil ester (CFSE) ile etiketlenmiştir pe.

1. Bir hemasitometre T hücrelerini saymak ve odanın başına 2 x 10 ⁶ hücre hesaplar. Not: Bu deneyde, 6 x 10 ⁶ hücre 3 odaları için gerekli olacaktır.
2. Santrifüj 2 x 10 ⁶ T 500 xg, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bölme başına hücre ve% 1 glükoz ya da% 2 FBS ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml hücre (PBS) yeniden süspanse edin.
3. 1 de KAKE ekle: 1,000 seyreltme (stok 5 mM yapılan). Işıktan örtün ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe
4. 5 dakika, RT 500 xg'de Spin.
5. durum başına 240 ul tekrar süspansiyon hücre pelet RPMI medya eksik serum (Bölüm 4 "Not" bölümüne bakın). Bu deneyde, düz RPMI 720 ul hücre pelletini. Her bölmenin, tüp başına 240 ul için etiketli boş 1.5 ml tüpler içine hücreleri bölün. kullanılana kadar 37 ° C sıcaklıkta bir blok hücreleri tutun.

3. th ayarlamae Input / Output Hortum ve Şırınga Pompası

1. 37 ° C mikroskop canlı görüntüleme odası ısıtın.
2. Giriş hortumun hazırlayın:
   1. su ile 500 ml cam şişeye doldurun ve kapağının içine 2 delik yapmak. ve "" delik Etiket "dışarı." Bu giriş medya için bir ısıtma suyu banyosu olarak hareket edecektir.
   2. Kapağı ve su banyosu içine deliklerden hortum girişi çalıştırın. "Out" delikten gelen şırınga bağlanır hortumda yan delik "" ve giriş haznesine bağlanacak tarafı ile geliyor emin olun.
   3. Sistemi havayı çıkarmak için 60 ml su ile hortum girişi yıkayın.
   4. Prime RPMI ortam serum yoksun olan hortum girişi 37 ° C'ye kadar ısıtıldı. 60 ml şırınga doldurun ve hortumlar tamamen astarlanmış ve hava kabarcıklarını eksik olana kadar medya aracılığıyla itin.
      Not: lengt bağlı olarakHortumun h değişecektir başbakan için gerekli hacmi kullanılır.
      1. (Burada 3) deneyde bölmelerin sayısına göre dakika (5 dakika) sayısına göre akış (burada 0.3 mL / dakika) oranı ile çarpılarak deney için gerekli ortamın hacmini hesaplar; Bu deneyde, 4.5 ml ortam kullanın. Not: priming sonra şırınga kalan (burada 9.5 ml toplam) 5 ml ekstra hacme sahip öneriyoruz.
   5. 37 ° C korumak için mikroskop canlı görüntüleme muhafaza içine tüm giriş kurulum yerleştirin. hortumun çalıştırın ve muhafazanın dışında şırınga ve şırınga pompası içine şırınga yükleyin.
3. Çıkış hortumun hazırlayın:
   1. Çıkış atık olarak kullanmak üzere bir 250 ml şişe kapağı bir delik açın.
   2. Delikten ve şişe içine çıkış boru çalıştırın. Gevşek, kapak güvenceye tüm yol kapama değil.
   3. Mi canlı görüntüleme muhafazanın içine çıkış kurulumu yerleştirincroscope.
4. İstenen kesme stresini (din / ^cm2) üretmek için akış hızı (ml / dakika), gerekli hesaplayın. Kayma gerilmesi, bu nedenle dikkate hücre çalışılacak türleri ve tedavileri kesme stres düzeyinde karar da dahil olmak üzere genel bir model almak, farklı damar bölümlerinde değişir.
   Not: Bu deneyler yakından küçük damar ayarını taklit etmek için 0,4 din / cm ² yürütülmektedir.
   1. makaslama stresi hesaplanırken dikkate odası boyutları alın. Burada kullanılan akış odaları için (üretici ¹¹ tarafından sağlanan) aşağıdaki formülü kullanın (Malzeme Tablo bakınız): T = η * 176.1 * ø T = kayma gerilmesi, η = dinamik viskozite, ø = akış hızı nerede. Not: 37 ° C'de RPMI ortam dinamik viskozitesi 0.007 olan.

Hücre Akış Odalar ve Uyarım 4. Yükleme

Not: yapışma başlatmak için,T hücreleri teşvik edilmesi gerekmektedir. Aşağıdaki deneyde hücreler, uyarılmamış kalır ya da SDF-1α ¹² veya forbol miristat asetat (PMA, pozitif kontrol) ile uyarılır ^13. T hücresine kemokinin uygun sunum için, CHO-ICAM hücreler, hücre yüzeyi üzerinde sunum için izin (seri yıkama izledi) SDF-1α ile ön inkübasyona tabi tutulur. PMA ikinci haberci diasil gliserol (DAG) yapısal olarak benzer olan bir forbol esteri olduğu; burada, bir pozitif kontrol olarak kullanılır. T hücreleri, doğrudan önceden akış odasına yüklemeden PMA ile muamele edilmektedir.

1. mikroskop akış odası slayt yerleştirin ve 20X objektif kullanılarak CHO-ICAM tek tabaka üzerinde odak düzlemi ayarlayın.
2. 37 ° C ısı bloğu diğer tüm koşullar için KAKE lekeli T hücrelerini tutun. bu durum için tahlil hemen önce aşağıda CHO-ICAM veya T hücrelerini hazırlamak:
   1. uyarılmamış durumda (hazne 1), bir tüp / akış ch tutmakTedavi edilmeyen kehribar, uyarılması için negatif kontrol olarak hizmet vermektedir.
   2. PMA stimülasyonundan (hazne 2) için, pozitif kontrol görevi için PMA (10 ng / ml) T hücrelerinin bir tüp uyaran; Akış odasına yüklemeden hemen önce davranın.
   3. SDF-1α stimülasyon, (bölme 3) için, üst hazne (çıkış haznesi) bir kerede 3 kez 70 ul kaldırılması ve sonra da SDF 70 ul ekleyerek SDF-1α (100 ng / ml) ile, üçüncü akış odası teşvik -1α (100 ng / ml) düşük haznesi (giriş hazne) toplandı. 5 dakika boyunca inkübe edin.
3. Bir odanın çıkış haznesinden 3 kez çıkarın ve her seferinde 70 ul atın.
4. Giriş rezervuar içine 3 kez ön işlemden (varsa) T hücre süspansiyonu 70 ul ekleyin. Hücreler odasının ( "In") olarak girişinden hareket etmesine izin 5 dakika bekleyin ve odasının proksimal çıkışını ( "Out") ulaşmak için.
5. Bu süre boyunca, görüntü 5KAKE lekeli T hücreleri için alanlar. Odası (Şekil 1) merkezi boyunca dağılmış alanları seçin. uyarma lazer dalga boyu: Aşağıdaki uyarma / emisyon şartlarını kullanın 488 nm; emisyon toplama filtresi: 500 - 540 nm. Bu görüntüler öncesi akış hücresi sayımları olarak görev yapacak.
6. Akış odası rezervuarlar eş zamanlı giriş ve çıkış boru takın.
   Not: odasına hava kabarcıkları vermek ve bölme içinde genel dengesini muhafaza etmeyecek şekilde eş zamanlı olarak tüp takılması önemlidir.
7. CFSE, boyanmış T hücrelerinin izlenmesine olanak verir, 0.3 ml / dk (0.4 din / ^cm2) de akışını başlatmak. Akış özellikle ilk odası ile, başlar, bu nedenle T hücre hareketi başlangıcında zamanlaması 5 dakika başlamak, genellikle akışını başlatmak ve T hücre haddeleme gözlemleyerek arasında bir gecikme vardır.
8. 5 dakika sonra akışını sona erdirmek ve KAKE kanal görüntü 5 alanlar. rastgele bir uçtan bir uca dağılmış alanları seçinakış odasının merkezine ughout (Şekil 1). Bu görüntüler sonrası akış hücresi sayımları olarak görev yapacak.

5. Yapışık Hücrelerinin Yüzde Belirlenmesi

Not: alınan görüntü hücre sayısının belirlenmesi otomatik yazılım ile objektif yapılır. Çalışmalarımızda için biz böyle ImageJ (Versiyon 1.48V) gibi yazılım Volocity (Versiyon 6.2.1), ancak diğer yazılımını kullanmıştır de geçerlidir.

1. Her durum için alan ön akış başına hücre sayısını belirler. 5 alanların ortalama "ön-akış ortalama hücre sayısı." ⁷
2. Her durum için alan post-akış başına hücre sayısını belirler. 5 alanların ortalama "post-akış ortalama hücre sayısı." ⁷
3. Aşağıdaki formül kullanılarak yapışan hücrelerin yüzdesini hesaplayın: / (ön akım ortalama hücre sayısı) yapışık hücreler = (son akış ortalama hücre sayısı) yüzdesi x% 100.

Gösterildiği gibi Örnek sonuçlar SDF-1α ile uyarılmış, Jurkat ve primer insan CD3 + T hücreleri kullanılarak akış yapışma tahlilinden gösterilmektedir. Tüm gösterilen deneylerde negatif kontrol uyarılmamış hücrelerdir. uyarılmamış hücrelerde bir eşik bazal adezyon yüzdesi 5 ila -% 10; özellikle bu aralığın üstüne taban yapışma sorunlu bir deney belirtir ve T hücrelerinin başlangıç ​​popülasyonu spesifik olmayan hazırlanmasında önceden aktive edilmiştir göstermektedir. uyarılmamış hücrelerde bu üzerindeki her bir durumda son akış oranında yapışma hesaplanmasına ek olarak hesaplanabilir yapışan hücrelerin sayısındaki artış katlayın. Bu iki hesaplama yöntemlerini temsil Veriler buraya dahil edilmiştir.

Şekil 2A, her bir durum öncesi ve sonrası akış akış oda içindeki alanların temsili görüntüleri gösterir. Deneyden önce, Jurkat (shown, Şekil 2A) ya da primer insan CD3 + T hücresi sayımı, saflaştırılmış ve CFSE ile etiketlenmiştir. Her deneysel koşul için 2 x 10 6 hücre etiketlenmiştir. Stimüle edilmemiş T hücreleri, SDF-1α varlığında veya yokluğunda, CHO-ICAM hücreleri ihtiva eden akış gözlerinden yüklendi. T hücreleri 5 dakika süreyle odasında taşımak ve birikmesine izin verildi ve bu süre içinde görüntü ön akış sayılarını belirlemek amacıyla ele geçirildi. Farklı uyarmalar arasında hücre karşılaştırılabilir bir sayıda ön-akışı düzgün deneysel koşullar sağlamak için gereklidir. akış tarafından oluşturulan sürekli kayma gerilmesi 5 dakika sonra, görüntüleri tekrar post-akış sayılarını belirlemek amacıyla ele geçirildi. Bu SDF-1α kesme stresi altında CHO-ICAM hücrelerine yapışabilmektedir T hücrelerinin sayısını artırır, bu Örnek görüntüler arasında ortadadır.

Şekil 2B, CAL gibi T hücresi yapışmasında kat değişimi göstermektedirJurkat T hücreleri sayısı, uyarılmamıştır ve SDF-1α mevcudiyetinde ya öncesi ve sonrası akış göre hesaplandı. Her durum için ortalama hücre 5 alan ön akış sayısı ve son akış belirlendi 5 alanları ve uyarılmamış SDF-1α stimülasyon karşılaştırması T hücresi yapışmasında kat değişimi hesaplamak için kullanılır. Burada gösterildiği gibi, SDF-1α uyarılmamış kıyasla yapışma yakın 2 kat artışa neden olur.

Şekil 2C, veri hesaplama için alternatif bir yöntemi gösterir. Burada SDF-1α varlığında veya yokluğunda, primer insan CD3 + T hücrelerinin yüzdesi yapışması, ilk önce ön akış ortalama sonrası akış ortalama bölünmesi ortalama öncesi ve sonrası akış T hücresi sayımları saptanmasıyla belirlenir ve bu hesaplama sayesinde 100 ile tüm ön akış nüfus çarparak% 100 yapışma gösterir. Burada gösterildiği gibi, stimüle edilmemiş T hücrelerinin% 15 kesme stre altına yapışmışSDF-1α ile uyarılmış T hücrelerinin% 50 ile karşılaştırıldığında p.

Şekil 1. Homojen akışına maruz sadece alanlarını analiz etmek önemlidir. Alanların görüntülü olması gereken yerde endikasyonu ile kullanılan akış odaları şematik gösterimi. bölme üreticileri tarafından sağlanan bilgilere göre, önceden belirlenmiş akış oranı sadece bu şemada turuncu ile gösterilen odalarının merkezinde, yoluyla elde edilir. Odanın sınırlarına yakın akış hızı azalır ve deneysel görüntüleme veya analize dahil edilmemelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. <Güçlü> SDF-1α makaslama gerilimi altında ICAM-1 T hücresi yapışmasını indükler. A. Jurkat T hücreleri, 5 uM konsantrasyonda CFSE ile etiketlenmiştir. Daha sonra, hücreler, SDF-1α (100 ng / ml) veya uyarılmamış ile işlemden geçirilmiş ve konfokal mikroskop ayarlanmış ve 5 dakika için oda içinde hareket birikmesine izin verildi akış gözlerinden yüklendi. Seçenek olarak ise, Jurkat T hücreleri, PMA (10 ng / ml) önceden akış gözlerinden ilave edilmeden ile önceden işlendi. Bu 5 dk öncesi akış görüntüleri boyunca ele geçirildi. Akış daha sonra 5 dakika boyunca kesme stresi oluşturmak için 0.4 din / cm 2 başlatıldı. Tamamlandığında, post-akış görüntüleri ele geçirildi. Jurkat T hücrelerinin Temsilcisi görüntüler ölçek çubuğu, gösterilen 50 mikron. B. Jurkat T hücrelerinin yapışma içinde Fold değişim önce her durum için ortalama öncesi ve sonrası akış hücresi sayımı belirlenmesi ve ortalama sonrası akış sayısını bölerek hesaplanmıştır öncesi ortalama akış co tarafındanher bir durum için etkili olduğu akla. her uyarım Burada koşul, SDF-1α veya PMA Bu yapışma katsayısı, daha sonra yapışma kat değişimi saptamak için, uyarılmamış yapışma katsayı bölünür. Çubuklar, ilk Her durum için ortalama öncesi ve sonrası akış hücresi sayımları belirlenerek hesaplandı primer insan CD3 + T hücrelerinin SEM. C, yüzde yapışma ± 3 deneyin ortalamasını verir. Her durum için, ortalama sonrası akış sayısı ortaya çıkan yüzde yapışma öncesi akış hücresi sayımı% 100 yapışma olma dayanmaktadır 100 ile ortalama öncesi akış sayısı bölünür ve çarpılır. Barlar ± SEM 5 deneyin ortalamasını verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. THücreler ilk önce biriken CHO-ICAM tek tabaka üzerine akar. Jurkat T hücreleri, 5 uM konsantrasyonda CFSE ile etiketlenmiştir. Daha sonra, hücreler, SDF-1α (100 ng / mi) ile işlemden geçirilmiş ve konfokal mikroskop ayarlanmış ve 5 dakika için oda içinde hareket birikmesine izin verildi akış gözlerinden yüklendi. Bu 5 dk görüntüleri boyunca zaman atlamalı serisi olarak ele geçirildi; hala (A) çerçeveleri. Akış daha sonra 5 dakika boyunca kesme stresi oluşturmak için 0.4 din / cm 2 başlatıldı. Bu 5 dk görüntüleri boyunca zaman atlamalı serisi olarak ele geçirildi; Hala (B) çerçeveleri. Bu görüntülerdeki akış yönü aşağıdan yukarıya ve odak düzlemi CHO-ICAM tek tabaka olarak belirlenmiştir. (1) akış hızında tek tabaka boyunca yuvarlanan T hücreleri görüntülenmiştir kısa, yatay çizgiler görüntülü olurken hızla hareket ediyor çünkü tarlada aşağıdan yukarıya doğru hareket: T hücreleri 3 gruba kategorize edilebilir. (2) T hücrelerinin edişinitek tabaka boyunca örn. Bu hücreler sıkıca akmaya karşı direnç dayalı yapıştırılır ve bu modelde görülmez hücresel geçit hoşgörülü bir alanda, arama muhtemel kaynıyor. (3) sıkı bir şekilde tek tabaka uygun T hücreleri, akış dirençli olan ama taşınamaz. Bu hücreler aktif haddeleme veya tek tabaka sürünen değildir. Daha sofistike bir analiz daha fazla ölçümü veya karakterizasyon için bu hücre popülasyonlarının incelemek için tasarlanmış bir ImageJ komut dosyası kullanımı yoluyla, çalışmanın hedeflerine dayalı, yapılabilir. Ölçek 50 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. CHO-ICAM hücreleri konfluent tek tabaka oluşturacak gerekir. Konfluent CHO-ICAM monolay Temsilcisi görüntübir akış odası içinde er. Ölçek çubuğu 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.