T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Özet

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

Özet

Genel olarak, T hücresi yapışma immünolojik sinaps oluşumunda antijen sunan hücreler (APC) ile birlikte enflamasyon ve etkileşim bölgelerine hücresel alımının has süreçlere katkıda işlev kritik bir unsurdur. T hücresi kan daman etkileşimleri dolaşımı kendisi tarafından üretilen kesme stresi tarafından meydan ise T hücresi yapışma bu iki bağlama, hücre APC etkileşimlerinin statik olarak kabul edilebilir T farklıdır. T hücresi-APC etkileşimlerinin iki hücre ortağı birbirine statik olarak olduğu statik olarak sınıflandırılır. Genellikle, bu etkileşim, lenf düğümleri içinde meydana gelir. Bir T hücresi kan damarı duvarı ile etkileşime gibi, hücreler tutuklama ve üretilen kayma gerilmesi dayanıklı olmalıdır. ^1,2 Bu farklılıklar daha iyi iki ayrı düzenleme süreçleri gibi akış koşulları altında statik yapışma ve yapışma anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. T hücre yapışmasının düzenlenmesi en özlü con olarak tanımlanabilirhücre yüzeyi üzerinde tanımlı molekülleri integrin ve böylece etkileşim hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilen yapışma molekülü ligandlarla İntegrinlerin etkileşimleri düzenleyen afinitesi durumunu sırtı. Integrin afinite devletlerin düzenleme bizim mevcut anlayış vitro model sistemlerde genellikle basit geliyor. adezyon burada açıklanan akış koşulları kullanılarak tahlil görselleştirme ve bir uyarıcı, aşağıdaki gerçek zamanlı olarak T hücresi epitel hücre etkileşimleri hassas ölçümü sağlar. akış deneyinde küçük bir yapışma önleyici veya uyarıcı maddeler ile tedaviden sonra T hücreleri içinde yer alan sinyal yapışma çalışmalara uygulanabilir. Buna ek olarak, bu deney, bir yapıştırıcı lökosit nüfus ve bir integrin yapışma molekülü çifti, T hücresi sinyal dışına taşabilir.

Giriş

T lemfosit yapışması T hücresi trafiği ve antijen sunumu üzerinde kritik bir rol oynayan ^3, sağlıklı bir bağışıklık sisteminin belirgin süreçlerin bir dizi aracılık eder. Immün gözetim veya yapışma için, bu iki geniş roller kritik aktif bir bağışıklık tepkisi sırasında belirtir. ^4. T hücresi-endotelyal hücre etkileşimleri fizyolojik sinyal olayları (APC) etkileşimlerinin sergileyen hücre T hücre-antijen farklıdır ve bu nedenle ayrı işlemler gerektiren çalışma en iyi yer sinyalizasyon kaskadlar anlamak için. lenfosit ekstravazasyon sırasında kan damarı çeperi bir T hücresinin Sıkı yapışma, hızlı ve dinamik integrin aktivasyonunu gerektirir. Endot....

Protokol

1. Kaplama CHO-ICAM Hücreleri

Not: Bu adımın amacı konfluent tek tabaka üretme hedefi ile gece boyunca büyümeleri için akış gözlerinden CHO-ICAM hücreleri plaka etmektir.

1. % 5 ile 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (CHO-ICAM tam kültür ortamı) ile desteklenmiş 10 mi RPMI ortamında 10 cm doku kültürü tedavi kültür tabaklarında CHO-ICAM hücreleri korumak CO _2.
2. hücreleri toplamak için, 1 ml% 0.5 tripsin-EDTA ekleyin ve yavaşça çalkalanarak 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. ortam 4 ml tripsin nötralize.
3. Bir hemasitometre kullanılarak CHO-ICAM hücrelerin sayısı ve odasının ba....

Sonuçlar

Gösterildiği gibi Örnek sonuçlar SDF-1α ile uyarılmış, Jurkat ve primer insan CD3 ⁺ T hücreleri kullanılarak akış yapışma tahlilinden gösterilmektedir. Tüm gösterilen deneylerde negatif kontrol uyarılmamış hücrelerdir. uyarılmamış hücrelerde bir eşik bazal adezyon yüzdesi 5 ila -% 10; özellikle bu aralığın üstüne taban yapışma sorunlu bir deney belirtir ve T hücrelerinin başlangıç ​​popülasyonu spesifik olmayan hazırlanmasında önceden aktive edilmiştir göstermektedir. uyarılma.......

Tartışma

Düzgün T hücre yapışmasını analiz etmek için, uyarıcı bir in vitro yöntem seçerken dikkat edilmesi gereken çalışmaya dahil edilecek. LFA-1 aktivasyonu ve bağlayıcı ICAM-1 giden sinyalleri çalışma için çeşitli tahliller vardır birlikte tüm yöntemler değiştirilemez. Statik yapışma deneyi en iyi ¹⁰ T hücre-APC etkileşimleri çalışmak için uygundur; alternatif, burada ayrıntılı kayma gerilmesi yöntemi T hücresi epitel hücre etkileşimleri modellemek için idealdir. in vivo, kemokinler sıkıca yapışm.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
T hücresi örnekleri (hücre hattı veya birincil)	ATCC	TIB-152	Periferik insan T hücreleri
CHO-ICAM-1 hücreleri	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml cam şişe	Fisher	FB800500
250 ml cam şişe	Fisher	FB800250
Silikon boru 0,8 mm	ibidi	10841
İnkübatör hazneli konfokal mikroskop	Ziess	700	Herhangi bir geniş alan floresan mikroskobu
Şırınga pompası	New Era Pompa Sistemleri	NE-300
60 ml şırınga	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1 & alfa;	Ar-Ge D	350-NS-010 / CF
RPMI	Londra	12-702F / 12
PBS	Lonza	17-516F
Mikrosantrifüj	Eppendorf	5424
D-Glikoz	Sigma Aldrich	G8270 ve nbsp;
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity yazılımı	Perkin Elmer	Sürüm 6.2.1
ImageJ yazılımı	NIH	Sürüm 1.48V
Doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları	Falcon	353003
Tripsin-EDTA (%0,25) Fenol Kırmızı	Gibco	25200114
Isı İnaktive Edilmiş FBS	Denville	FB5001-H
Penisilin / Streptomisin	Fisher	BP295950