Aksenik ve gnotobiyotik koşullarda Drosophila melanogaster yetiştirme için bir yöntem sunulmuştur. Fly embriyolar, sodyum hipoklorit dechorionated steril diyet aseptik transfer ve kapalı kaplarda yetiştirilir. Bakteri ile diyet ve embriyolar aşılamak gnotobiyotik dernekler yol açar ve bakteriyel varlığı tüm vücut Drosophila homojenatları kaplama ile teyit edilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Mikropların sayısız hayvan özelliği ve davranışı üzerindeki etkisi son yıllarda giderek daha fazla kabul görmektedir. Meyve sineği Drosophila melanogaster, mikroorganizma içermeyen (aksenik) koşullar altında veya tanımlanmış mikrobiyal topluluklarla (gnotobiyotik) Drosophila'nın büyük örnek boyutlarını desteklemeye yönelik yaklaşımlarla kolaylaştırılan, hayvan konakçıları ile mikrobiyal etkileşimleri anlamak için bir modeldir. Bu çalışma, Drosophila embriyolarının toplanması, hipoklorit dekoryonasyonu ve sterilizasyonu ve steril diyete aktarılması için bir yöntemi özetlemektedir. Sterilize edilen embriyolar 50 ml'lik santrifüj tüplerde steril diyete alınır ve gelişmekte olan larva ve erginler, flakonlar açılana kadar herhangi bir dış kaynaklı mikroptan arındırılır. Alternatif olarak, tanımlanmış bir mikrobiyotaya sahip sinekler, steril diyet ve ilgilenilen mikrobiyal türlerle embriyolar aşılanarak yetiştirilebilir. Drosophila'da temsili bir gnotobiyotik mikrobiyota oluşturmak için 4 bakteri türünün tanıtımını açıklıyoruz.Son olarak, aksenik Drosophila'nın yetişkinliğe kadar bakterisiz kalıp kalmadığının test edilmesi de dahil olmak üzere bakteri topluluğu bileşimini doğrulamak için yaklaşımları açıklıyoruz.
Giriş
Çoğu hayvan yakından ölüme 1 doğumdan bakterilerin ( 'Mikrobiyota') ile ilişkilidir. Mikroorganizma içermeyen ( 'aksenik') ve mikroorganizma ilişkili (konvansiyonel) hayvanların karşılaştırılması mikropların metabolik, besinsel, vasküler, hepatik, solunum, immünolojik, endokrin ve nörolojik fonksiyon 2 olmak üzere hayvan sağlığı çeşitli yönlerini, etkilediği gösterilmiştir. Meyve Drosophila melanogaster mikrop 3,4 mevcudiyetinde Bu yöntemlerin pek çoğu anlaşılması için ve hayvan sağlığı 5,6 ilgili Mikrobiyota etkisini incelemek için önemli bir modeldir uç. Hiçbir bakteri türleri her birey ( 'çek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kültür Bakteriler (Başlat ~ 1 Hafta Yumurta Toplama önce)
- Modifiye MRS 20 (MMRS) plakaları ve suyu boruları (Tablo 1) hazırlayın. Her 100 mm Petri plaka içine agar 20 ml MMRS dökün ve / kuru gecede soğumasını bekleyin, ya da 5 ml MMRS 18 mm test tüpleri içine et suyu.
- Streak Asetobakter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, L. agar plakaları MMRS ilgili plantarum. Gece boyunca 30 ° C'de Acetobacter inkübe edin. Kapatmadan önce, karbon dioksit ile hava geçirmez bir kapta ve sel tabak koyarak anaerobik Lactobacillus kuluçkaya yatmaktadır. gece ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aksenik sinekler başarılı yetiştirme D. tüm vücut homogenizations hiçbir CFU izolasyonu ile doğrulanır melanogaster yetişkin (Şekil 1). Kaplanmış Homojenat kolonileri verimleri Alternatif olarak, eğer şişeler kontamine ve atılmalıdır. Gnotobiyotik sinekler için, dört bakteriyel izolatların her yetişkin sinekler (Şekil 1) ile ilişkili toplam canlı CFU farklılıkları gösteren, 5 yetişkin erkeklerin havuzları izole edilmiştir. Her bir bakte.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada anlatılan yöntem birlikte aksenik yetişkinlerin 18,27 seri devir veya antibiyotik tedavisi 13,18 dahil aksenik sinekler, yetiştirme alternatif yöntemlerle, embriyo dechorionation 8,11,18,25,26,27 birkaç yaklaşımlardan biridir. Diğer dechorionation yöntemleri etanol yıkamaları yer alır ve 11,25,26 azaltmak ya da 8 hipoklorit uzanır. (Etanol yıkar olmadan) burada belirtildiği gibi yetiştirilen zaman 100 Drosophila genotipleri aksenik olan ~ çoğu .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu protokolün bazı detayları da yazının yararlı yorum sağlanan Dr. Adam Dobson, yardımı ile optimize edilmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (FNIH) hibe sayısı R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD ve AED). FNIH hibe sayısı 1F32GM099374-01 (PDN) ve Brigham Young University başlangıç fonları (JMC, MLK, MV). Yayın maliyetleri Brigham Young University Yaşam Bilimleri Koleji ve Bitki ve Yaban Hayatı Bilimleri Bölümü tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bira mayası | MP Biyomedikal, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glikoz | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher - Lab Scientific | fly802010 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 Welch'in %100 Üzüm Suyu Konsantresi | Walmart veya başka bir bakkal | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Kafes: 32 oz. Yarı Saydam Yuvarlak Şarküteri Kabı | Webstaurant Mağazası | 999L5032Y | |
| http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html Yarı Saydam Yuvarlak Şarküteri Konteyner Kapağı | Webstaurant Mağazası | 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html | |
| Stok Şişeleri | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Fişler | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Naylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastik Burç | Ev Deposu | 100404002 | http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002 |
| Plastik Burç Kapağı | Ev Deposu | 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4 | Sert-Plastik-Yalıtımlı-Burç-2-Paket-27529/100153897 |
| Numune Kabı | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Tekrarlayıcı M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Santrifüj Tüpleri | TrueLine Santrifüj Tüpleri | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Gıda Kutuları | ABD Bilimsel | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Toplu | MP Biyomedikal, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filtreli Pipet Uçları, 300 μ l | ABD Bilimsel | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Yemekleri | Laboratuvar Ürün Satışı | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Etanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Boya Fırçası | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forseps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Ev Tipi Çamaşır Suyu (%6-8 Hipoklorit) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Evrensel Pepton | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Maya Özü | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotasyum Fosfat | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0& mod=match%20partialmax& lang= tr& bölge=ABD& odak = ürün |
| Amonyum Sitrat | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0& mod=match%20partialmax& lang= tr& bölge=ABD& odak = ürün |
| Sodyum Asetat | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnezyum Sülfat | Fisher Scientific | M63-500 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 Manganez Sülfat | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20partialmax& lang=tr& bölge =ABD& odak = ürün |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US 96 Kuyulu Plaka Okuyucu | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Santrifüj Tüpleri | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filtre Pipet Uçları, 1.000 μ l | ABD Bilimsel | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Kuyu Plakaları | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243 / |
| Seramik | Boncuklar MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Doku Homojenizatör | MP Biyomedikal, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 Biyogüvenlik Kabini | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
Kaynaklar
- McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
- Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their co....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).
