Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Nakil yapılan organlarda makrofaj birikimi, allograft reddi 1'in bir özelliği olarak uzun zamandır bilinmektedir. Immunogenic monocytes, transplantasyondan hemen sonra allogrefte infiltre olur, nakledilen organa karşı bir greft reaktif yanıt verir ve organ reddi başlatır 2 . Son yıllardaki veriler, baskılayıcı makrofajların başarılı uzun vadeli transplantasyon 3'ü kolaylaştırdığını ve transplantasyon toleransının indüksiyonu için gerekli olduğunu göstermektedir4. Bu makrofaj fonksiyonunun izolasyonu ve analizi için yeni bir yol haritası isteyen, makrofaj ontogenezi, aktivasyonu ve fonksiyonunun çok boyutlu bir kavramını önermektedir. Makrofajların esnekliği nedeniyle makrofajları doku ortamına bağlı olarak izole etmek ve karakterize etmek için bir metodoloji sağlamak ve fonksiyonlarını farklı senaryolara göre tanımlamak gerekir. İşte, açıklıyoruzGreft sızdıran makrofajların bağışıklık karakterizasyonu için bir protokol olabilir ve CD8 + T proliferasyonunu inhibe etme ve CD4 + Foxp3 + Treg genleşmesini in vitro teşvik etme kapasitelerini fonksiyonel olarak değerlendirmede kullandığımız yöntemler olabilir .
Giriş
Bu protokol, T hücre yanıtlarını modüle edebilme yeteneklerine göre, kardiyak allograftlardan izole edilen dokuya sızdıran makrofajların fonksiyonunu incelemek için in vitro teknikleri tanımlamaktadır. Literatürde yaygın olarak tarif edilen floresan hücre izleme boyaları, akış sitometrisiyle kombinasyon halinde, in vitro ve in vivo spesifik hücre tiplerinin baskılayıcı fonksiyonlarını incelemek için güçlü araçlardır . Protokolümüz , in vitro lenfosit proliferasyonunu izlemek için karboksiflüoresase süksinimidil ester (CFSE) yöntemini izlemektedir.
Bir CFSE etiketli hücre bölünürse, nesli karbok....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada fareler, Birleşik Devletler Tarım Bakanlığı yönergelerine ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Halk Sağlığı Hizmeti Kılavuzu'nun önerileri uyarınca yerleştirildi. Hayvan kullanımını içeren tüm deneysel teknikler, Sina Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin onaylı protokolleri olan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca gerçekleştirildi.
1. Medya Hazırlığı
- 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM zorunlu olmayan amino asitler, 5 mM HEPES ve 0.05 mM 2 kullanarak,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (10,000 U / mL) ile komple RPMI 1640 ortamı hazırlayın. mersaptoetanol.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Temsili sonuçlar yukarıdaki protokolde açıklanan geçiş stratejisini göstermektedir. Sonuçlar, greftle sızdıran makrofajlar ile birlikte kültürden sonra T-hücresi çoğalma aktivitesinin analizini de göstermektedir. Makrofaj alt gruplarının in vitro baskılayıcı kapasitesi Şekil 4'te analiz edilmiştir. Sonuçlar, toleranslı alıcılardan elde edilen Ly6C lo Ly6G - makrofajların baskılayıcı olduğunu göstermektedir. Sonuçlar aynı zamanda, Ly6C .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, farklı murin deneysel modellerindeki diğer dokular için de geçerli olan, deneysel bir mürin kalp transplantasyon modelinde greft infiltre eden miyeloid hücre alt gruplarını immüno-karakterize eden yöntemleri tanımlamaktadır. 20 psi'de düşük basınç hücreli sıralama, saf hücre alt gruplarının iyi bir verimliliğini izole etmek için tercih edilen yöntemdi. Her bir miyeloid alt kümesinin saflığını muhafaza etmek, farklı miyeloid popülasyonlar arasındaki baskılayıcı kapasitenin kesin sonuçlarını oluşturmak iç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Mount Sinai'deki Araştırma Mükemmellik Akım Sitometresi, Mikrocerrahi ve Biyo-depo / Patoloji Merkezlerinin teknik katkılarını kabul ediyoruz. Bu çalışma, COST Action BM1305: Hücre Tolerojenik Tedavilere Odaklanma ve İyileşme Eylemi (A FACTT), Mount Sinai Recanati / Miller Transplantasyon Enstitüsü kalkınma fonları, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R ve SAF2016-80031-R tarafından desteklenmiştir. JO
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Medya | Yaşam Teknolojileri | 11875119 | |
| %10 FBS | Yaşam Teknolojileri | 26140-079 | |
| 1.000x 2-merkaptoetanol | Yaşam Teknolojileri | 21985023 | |
| 100x Kalem/Strep | Yaşam Teknolojileri | 15140122 | |
| 100x L-glutamin | Yaşam Teknolojileri | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino asitler | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES tamponu | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodyum Piruvat | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Kollajen A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (kalsiyumsuz & magnezyum) | Corning | 21031CV | |
| 70 ve mikro; m Hücre süzgeci | Fisher | 22363548 | |
| ACK lizis tamponu | Yaşam Teknolojileri | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Fare T hücre aktivatörü CD3 / CD28 | Yaşam Teknolojileri | 11452D | |
| 96 kuyu U-alt plaka | Corning | 353077 | |
| Antikorlar: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe / Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp / Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC / Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBiyobilim | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBiyobilim | 25008181 | |
| LSRII Akış Sitometresi | BD Biyobilim | ||
| FACSDiva Yazılımı | BD Biyobilim | ||
| C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J & nbsp; | Jackson Laboratuvarı | 008374 | |
| C57BL/6 | Jackson Laboratuvarı | 000664 | |
| Balb/c | Jackson Laboratuvarı | 000651 |
Kaynaklar
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocyte....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
