Yöntem makalesi

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

DOI:

10.3791/54252

⸱

8 Ekim 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipotent mezenkimal kök/stromal hücreler (MSC), anatomik doku konumları belirsiz kalırken, plastik yapışmaları yoluyla geleneksel olarak birincil doku sindirimlerinden izole edildi. Grubumuz ve diğer araştırmacılar tarafından perivasküler hücreler tarafından tanımlanmış perivasküler ve MSC hücre belirteç ekspresyonunun yakın zamanda keşfi, multipotent perivasküler öncü hücrelerin spesifik homojen alt popülasyonlarını prospektif olarak izole etme ve saflaştırma fırsatı sağlamıştır. İnsan iskelet kasından mikrovasküler CD146+CD34-perisitleri ve vasküler CD34+CD146-adventitial hücreleri saflaştırmak için floresan aktive hücre sınıflandırmasının (FACS) kullanımını daha önce göstermiştik. Burada, pozitif ve negatif seçimler için tanımlanmış bir hücre yüzeyi belirteçleri setinin ifadesine dayanarak, bu iki perivasküler hücre alt kümesini insan miyokardından FACS ile aynı anda izole etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu nedenle bu yöntem, temel araştırma ve / veya terapötik araştırmalarda kullanılmak üzere multipotent kardiyak MSC benzeri öncü hücrelerin iki spesifik alt popülasyonunu kullanılabilir hale getirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp uzun bir post-mitotik organı olarak kabul edilmiştir. Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar, yetişkin insan kalbinde 1 sınırlı kardiyomiyosit devir varlığını göstermiştir. Kardiyomiyosit farklılaşma potansiyeline sahip yerli kök / progenitör hücreleri de perivasküler öncü hücreleri 2,3, en son yetişkin kemirgen ve Sca-1 + dahil olmak üzere insan kalpleri, c-kit +, cardiosphere oluşturan miyokardın içinde tespit ve oylandı. Bu hücreler, hücre transplantasyonu veya in-situ çoğalmasının uyarımı yoluyla kalp onanmı / rejenerasyonunu arttırmaya yönelik terapiler için ilgi çekici adaylardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan Kardiyak 1. Numunenin işlenmesi

  1. tüm sıvılar, konteynırlar, aletler ve özel operasyon alanı steril olduğundan emin olun.
  2. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve buz üzerinde% 1 penisilin-streptomisin (P / S) ihtiva eden soğutulmuş bir Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) oluşan bir depolama ortamında (doku banka ya da cerrahi tarafından temin edilir), kardiyak doku numunesi yerleştirin ulaşım 3 için.
  3. depolama aracından kalp örnek çıkarın ve% 2 FBS ve% 1 P / S ile takviye edilmiş fosfat tamponlu tuz (PBS) oluşan bir yıkama ortamı ile yıkayın. örnek tutarken, büyük damarları ya da perikard kavramak ve miyokard kırma aza ind....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreler ileri ve yan dağılım dağılımları esas alınarak enkaz ve çiftlerin ayırt edilmiştir. Canlı hücreler DAPI boya almak için onların başarısızlığı ile tespit edilmiştir. Ayırıcı stratejisi bu canlı bütün kardiyak hücre ayrılma (Şekil 1) izotip kontrolü etiketleme temelinde seçildi. Canlı hücrelerden, CD45 + hücreler, ilk olarak, üzerinden geçitlendi CD56 + hücreleri eklenmiştir. CD144 + Daha sonra endotel hücreleri CD56 çıkarıldı .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artan kanıtlar yaralanma sonrası yetişkin insan kalbinin sınırlı rejeneratif kapasitesi destekler. Yaralı kalplerinde böyle rejeneratif yanıtları sorumlu yerli öncü hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ilgili mekanizmalar ve sinyal yollarının anlaşılması ve terapötik bu hücreleri kullanmak için yaklaşımların geliştirilmesi hem de kritik öneme sahiptir.

Önceki protokoller insan iskelet kası 25 den perivasküler öncü hücre alt gruplarının izolasyonu tarif etmişlerdir. Ancak, k.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çelişkisi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Edinburgh Üniversitesi'nden Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi ve Will Ramsay'e ve Pittsburgh Üniversitesi'nden Alison Logar ve Megan Blanchard'a akış sitometrisi konusundaki uzman yardımları için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Anne Saunderson ve Lindsay Mock'a insan dokularının elde edilmesindeki yardımları için teşekkür etmek istiyoruz. İnsan yetişkin ve fetal kalp dokusu örnekleri, sırasıyla NHS İskoçya Tayside Tıbbi Araştırma Etiği Komitesi ve NHS Lothian Araştırma Etik Komitesi'nin (REC08/S1101/1) tam etik izni ile temin edildi. Bu çalışma, Tıbbi Araştırma Konseyi (BP), İngiliz Kalp Vakfı (BP), Pennsylvania Topluluğu (BP), Pittsburgh Çocuk Hasta....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AbC Anti-fare Boncuk KitiMoleküler ProblarA-10344
Kollajenaz IGibco17100-017Tozu gerektiği gibi sulandırın ve filtre sterilize edin
Kollajenaz IIGibco17101-015
Kollajenaz IVGibco17104-019
anti-insan CD34-PEBD Pharmingen555822Steril tutun
anti-insan CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833steril
anti-insan CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747steril anti-insan
CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566steril tutun
anti-insan CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647Steril
tutun EGM2-BulletKitLonzaCC-3162
piruvat içermeyen DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAXThermoFischer Scientific10566-016
Fetal Sığır SerumuThermoFischer Scientific10500-064Alikotlarda dondurun ve steril tutun
JelatinSigma AldrichG1393Steril su ile seyreltin
IgG1k-PEBD Pharmingen559320
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen'i
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen'itutun557872
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen'itutun
561566 IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647Steril tutun
Fare serumuSigma AldrichM5905Keep steril
Parafin Filmi - Parafilm MSigma AldrichP7793
Penisilin-StreptomisinGibco15979-063Alikotlarda dondurun ve steril
Fosfat tamponlu tuzlu su pH'ı saklayın pH 7.4ThermoFischer Scientific10010-023Steril
Tutun Kırmızı Kan Hücresi Parçalama Tamponu Hybri-MaxSigma AldrichR7757Steril
Trypan'ı koruyun Mavi ÇözeltiSigma AldrichT8154
Tripsin-EDTA% 0.5 (10x)İnvitrojen15400-054
& nbsp; FACSARIA FUSIONBD PharmingenFloresan Aktif Hücre Sıralayıcısı
Sodyum yapışana kadar hücrelerin ve kültürün toplanması için steril tutun 557873 steril steril

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Perivascular Precursor CellsCardiac Tissue IsolationFluorescent Activated Cell SortingCD146 CD34 MarkersTissue Digestion ProtocolCell Strainer FiltrationFlow Cytometry AnalysisCell Viability AssessmentMyocardial Progenitor CellsCell Surface Markers

İlgili makaleler