Yöntem makalesi

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

DOI:

10.3791/54252

⸱

8 Ekim 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipotent mezenkimal kök/stromal hücreler (MSC), anatomik doku konumları belirsiz kalırken, plastik yapışmaları yoluyla geleneksel olarak birincil doku sindirimlerinden izole edildi. Grubumuz ve diğer araştırmacılar tarafından perivasküler hücreler tarafından tanımlanmış perivasküler ve MSC hücre belirteç ekspresyonunun yakın zamanda keşfi, multipotent perivasküler öncü hücrelerin spesifik homojen alt popülasyonlarını prospektif olarak izole etme ve saflaştırma fırsatı sağlamıştır. İnsan iskelet kasından mikrovasküler CD146+CD34-perisitleri ve vasküler CD34+CD146-adventitial hücreleri saflaştırmak için floresan aktive hücre sınıflandırmasının (FACS) kullanımını daha önce göstermiştik. Burada, pozitif ve negatif seçimler için tanımlanmış bir hücre yüzeyi belirteçleri setinin ifadesine dayanarak, bu iki perivasküler hücre alt kümesini insan miyokardından FACS ile aynı anda izole etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu nedenle bu yöntem, temel araştırma ve / veya terapötik araştırmalarda kullanılmak üzere multipotent kardiyak MSC benzeri öncü hücrelerin iki spesifik alt popülasyonunu kullanılabilir hale getirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp uzun bir post-mitotik organı olarak kabul edilmiştir. Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar, yetişkin insan kalbinde 1 sınırlı kardiyomiyosit devir varlığını göstermiştir. Kardiyomiyosit farklılaşma potansiyeline sahip yerli kök / progenitör hücreleri de perivasküler öncü hücreleri 2,3, en son yetişkin kemirgen ve Sca-1 + dahil olmak üzere insan kalpleri, c-kit +, cardiosphere oluşturan miyokardın içinde tespit ve oylandı. Bu hücreler, hücre transplantasyonu veya in-situ çoğalmasının uyarımı yoluyla kalp onanmı / rejenerasyonunu arttırmaya yönelik terapiler için ilgi çekici adaylardır.

Mezenşimal kök / stromal hücreler (MSC), kardiyovasküler tamir 6 olarak MSC terapötik uygulamalarının 4,5 klinik çalışmalar çok patolojik durum için yapılmıştır, hemen hemen her insan dokusundan izole edilmiştir, graft-versus-host-hastalığını 7 Ve karaciğer sirozu 8. Yararlı etkileri için MKH yeteneği atfedilen: inflamasyon 9 sitelere ev; farklı hücre tipleri 10 içine ayırt; yanlısı onarıcı molekülleri 11 salgılarlar; ve konak immün yanıtları 12 modüle. MKH izolasyonu geleneksel plastik yüzeylere kendi tercihli bağlılık güvendi. Bununla birlikte, hücrelerin elde edilen popülasyon, tipik olarak 13 belirgin da çok düşüktür. Anahtar perivasküler hücre belirteçleri bir kombinasyonu ile (FACS) floresan aktive hücre kullanarak, multipotent MSC gibi ön-madde popülasyonu (- / CD34 - / CD45 - / - CD56 CD146 + / CD31) izole edilmesi ve saflaştırılması mümkün olmuştur yetişkin iskelet kası ve beyaz yağ 14 dahil olmak üzere birden insan dokuları.

Çeşitli kalp dışı dokularda perivasküler hücre popülasyonlarının kök / progenitör hücre özelliklerini bir olması gösterilmiştirnd kardiyovasküler ortamda klinik kullanım için araştırılmaktadır. Perisitler, en iyi bilinen perivasküler hücre alt biri, yeni damarların 15 gelişiminde dahil olmak üzere birçok patofizyolojik roller oynayabilir heterojen nüfus vardır, kan basıncı 16, ve damar bütünlüğü 17,18 bakım düzenlenmesi. Çoklu dokularda gösterildiği gibi, perisitlerin spesifik alt özgün MSC antijenleri ifade ve FACS saflaştırma 14 sonra birincil kültürdeki MSC benzeri fenotipleri sürdürmek. Ayrıca, bu hücreler, kararlı bir şekilde kültür içinde uzun vadeli fenotipleri korumak ve MSC 19,20 benzer çok-dizi farklılaşma potansiyel sergilerler. Bu sonuçlar perisitler zor MSC 14 kökeni biri olduğunu düşündürmektedir. perisitlerin terapötik potansiyeli, miyokardiyal yara bir azalma ile gösterilmiş ve işemik yaralı transplantasyon ardından kalp fonksiyonunun geliştirilmiştirkalpleri 21. Son zamanlarda, başarılı insan miyokartdan perisitleri saflaştırılmış ve iskelet Miyogenesis 3 yokluğu ile onların MSC gibi fenotipleri ve multipotency (adipogenesis kondrogenezis ve osteogenezis) gösterdi. Buna ek olarak, miyokard perisitler diğer organlarda arınmış meslektaşları ile karşılaştırıldığında farklı cardiomyogenic potansiyeli ve anjiyogenik kapasitelerini sergiledi.

Multipotent perivasküler kök / progenitör hücrelerin, adventisyal hücrenin ikinci bir nüfus, pozitif CD34 ifade 22 temelinde insan safen damarlar izole edilmiştir. Venöz adventisya hücrelerinin klonojenik potansiyel mezodermal farklılaşma kapasitesi ve in vitro proanjiyojenik potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Farelerin işemik yaralı kalplerine bu hücrelerin nakli geçiş fibrozu bir azalma, anjiyojenez ve miyokardiyal kan akışında bir artış, azalan ventriküler dil ile sonuçlanmıştıration ve artmış kardiyak ejeksiyon fraksiyonu 23. İlginç bir şekilde, adipoz adventisya hücrelerinin stimülasyon 24 ile perisit fenotip kabul öne CD34 ekspresyonunu vermek ve Anjiyopoietin II tedaviye yanıt olarak kültür CD146 ekspresyonunu yukarı regüle ettiği gösterilmiştir. kalp içinde, ancak, adventisya hücre popülasyonu arasından ileriye FACS ve / veya iyi karakterize ile saflaştırılmıştır edilmemiştir. Aşağıdaki bölümlerde açıklanan hücre izolasyon prosedürleri kullanarak, şu anda miyokard adventisyal hücreler karakterize ve rejeneratif uygulamalar için kendi potansiyelini araştırıyor.

Bu yazıda izole ve insan fetal veya yetişkin miyokartdan perivasküler kök / progenitör hücrelerin iki alt popülasyonlar arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu prospektif hücre izolasyon yöntemi karşılaştırmalı çalışmalar ve furthe için insan kalbi biyopsilerinden izogenik perivasküler kök / progenitör hücre alt grupları elde etmek için araştırmacılar sağlayacakr çeşitli kardiyak patolojik durumlarda terapötik potansiyelini keşfetmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan Kardiyak 1. Numunenin işlenmesi

  1. tüm sıvılar, konteynırlar, aletler ve özel operasyon alanı steril olduğundan emin olun.
  2. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve buz üzerinde% 1 penisilin-streptomisin (P / S) ihtiva eden soğutulmuş bir Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) oluşan bir depolama ortamında (doku banka ya da cerrahi tarafından temin edilir), kardiyak doku numunesi yerleştirin ulaşım 3 için.
  3. depolama aracından kalp örnek çıkarın ve% 2 FBS ve% 1 P / S ile takviye edilmiş fosfat tamponlu tuz (PBS) oluşan bir yıkama ortamı ile yıkayın. örnek tutarken, büyük damarları ya da perikard kavramak ve miyokard kırma aza indirmek için ince uçlu forseps kullanabilir.
  4. Bir petri yıkama ortamı içinde örnek daldırın ve 3 açıklandığı gibi sterilize edilir, iris makasları ve ince uçlu forseps ile perikard, endokardı ve büyük kan damarları çıkarın.
  5. Kalan myoca CutBir tek taraflı jilet veya keskin iris makas kullanarak yaklaşık 1 mm 3 küçük parçalar halinde rdium. Not: Örnekler hemen işleme durumunda yüksek hücre verimler elde edilir. Bir gecikme kaçınılmaz ise taze depolama ortamında işlenen kardiyak doku, depolama (> 1 cm3 doku başına 5 mi) kadar 72 saat boyunca 4 ° C 'de, ancak, muhtemelen hücre verimi ilişkili bir düşüş mümkündür.

Hücre Doku ve İzolasyonu 2. Sindirim

  1. Taze 1.5 mi ihtiva eden sindirim çözelti hazırlayın kolajenaz her birinden, bir su banyosu içinde 37 ° C'ye ısınmaya (0.5 mg / DMEM ml'de tümü) kolajenaz II ve kolajenaz, IV.
    Not: Ses ve kollajenazlar konsantrasyonu yaklaşık 1 cm3 numuneler için uygundur.
  2. 100 mikron süzgeç vasıtasıyla asılı doku parçaları Filtre ve PBS ile iki kez yıkayın. steril 30 ml konteyner ile doku parçaları aktarınsıkıca kapatılmış kapak.
    Not: Kısa geniş tencere ziyade uzun dar tüpler daha iyi sonuç verir. Seçenek olarak ise, steril bir 50 ml tüp içinde doku parçaları koyun ve 30 mi kabı kullanılabilir durumda değilse, yatay olarak yer.
  3. hepsi sindirim çözümleri (4.5 mi toplam) ilave edin ve 120 rpm'ye ayarlanmış 37 ° C sıcaklıkta çalkalanarak su banyosu içinde kapalı bir plastik torba içinde kap yerleştirmek. Alternatif olarak, 120 rpm ayarlanmış ısıtılmış orbital çalkalayıcı parafin film ve yer ile kaba kaynatma.
  4. 15 dakika sonra çıkarın ve 15 dakika daha değiştirmeden önce tencerede üç kez ters çevirin. Çıkarın ve% 20 FBS ve% 1 P / S ile takviye edilmiş DMEM, 5 ml kolajenazları söndürün.
  5. yavaşça herhangi bir doku kümeleri kırmak için 10 ml serolojik pipet 1020 kez pipetleme özetini çiğnemek. sindirilmemiş malzemeleri çıkarın ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için, 100 um ile 70 mikron ve nihayet 40 mikron hücre süzgeçler süspansiyon sırayla Filtre.
    Not:enzim sindirimi işlemiyle debrisgenerated hücreyi önlemek için hücre süzgeçler arasında durulama yapmayın.
  6. Santrifüj, 4 dakika boyunca 200 xg'de hücre süspansiyonu, dikkatli bir şekilde süpernatant süzün ve Yıkama ortamının 4 ml ile sulandırıldı, oda sıcaklığında 2 dakika süreyle tampon yokedici kırmızı hücre 1 ml pelet yeniden askıya.
  7. santrifüj adımı yineleyin ve yıkama orta 1 ml pelet yeniden askıya. İyice karıştırın ve hücre sayımı için hücre süspansiyonu 10 ul alır.
  8. Tripan mavi rengin 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın ve hücre sayımı için standart bir hemasitometre karışımı 10 ul koyun. Köşe kare başına ortalama elde etmek için 4 ile dört köşe kareler mevcut parlak, yuvarlak hücre sayısını (her on altı küçük kareler bölünmüştür) ve bölme güvenin. Leke seyreltme faktörü hesaba 2 ile ortalama çarpma ve daha sonra 10 4 numunenin 1 ml başına hücre sayısını elde etmek için tarafından.

3. Hücre Etiketleme ve Sıralama

  1. Hücre süspansiyonuna fare serumu 50 ul ilave edin ve 20 dakika spesifik olmayan bağlanma antikorun bloke etmek için 4 ° C'de inkübe edin.
  2. Santrifüj, 4 dakika boyunca 200 x g'de fare serumu ile hücre süspansiyonu, süpernatant kaldırmak ve 100 ul başına 1 x 10 6 hücre bir konsantrasyonda yıkama ortamı içinde yeniden askıya.
  3. Kısım iki polistiren yuvarlak dibine 50 ul izotip ve boyanmamış kontroller için hücre süspansiyonu her tüpler daha sonra çok renkli boyama için üçüncü bir tüp içine kalan hacmi yerleştirin akım sitometri.
  4. çok renkli boyama tek bir hücre süspansiyonu: (100 Tüm 1) CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 ve CD146-AF647 antikor ekleyin. izotip kontrolü için, PE, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP Cy5.5- ve AF647-konjuge izotip antikorlarının eş hacimli ekleyin. Yavaşça pipetle hücreler antikorları karıştırın ve 20 boyunca 4 ° C 'de tüm tüpler kuluçkalanmasıKaranlıkta dak.
  5. alt akım sitometri boruları yuvarlak beş polistiren yıkama ortamı 100 ul olumlu boncuk bir damla ekleyerek kompanzasyon kontrolü boncuk hazırlayın. ayrı 5 tüplerin her birine: (100 Tüm 1) CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 ve CD146-AF647 antikor ekleyin. Karanlıkta 20 dakika boyunca 4 ° C 'de tüm tüpler inkübe edin.
  6. İnkübasyon sırasında, hücre toplama tüpleri Endotel Gelişim Ortamı-2, 4 ° C'de (EGM-2) kültür ortamının yeri ve 500 ul her hazırlanması.
  7. Antikor inkübasyondan sonra, bağlanmamış antikorların çıkarılması için hücreler ve boncuklar yıkamak için yıkama ortamı 5 ml ekleyin. Santrifüj 4 dakika boyunca 200 xg'de bütün tüpler. Yıkama ve santrifüj adımı yineleyin. hücrelerin yeniden askıya dikkatle yavaşça süpernatant ve pipet süzün.
  8. 250 ul başına yaklaşık 1 x 10 6 hücre bir konsantrasyonda yıkama ortamı içinde yeniden askıya. Yıkama m 100 ul boncuk yeniden askıyaedium.
  9. karanlıkta buz üzerinde hücre sıralayıcı bütün hücre ve boncuk süspansiyonlar taşıyın. Pozitif boncuk kompanzasyon kontrolü tüpler negatif boncuk 1 damla ekleyin ve floresan tazminat ayarlamak için bu kullanın.
  10. Arka plan floresan kurmak ve aşağıdaki gerilimleri ayarlamak için üreticinin talimatlarına göre boyanmamış kontrol hücreleri çalıştırın: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. üreticinin talimatlarına göre çalıştırılabilir izotipleri kontrol spesifik olmayan bağlanma ile ilgili eşiğe eşik kurmak. (Şekil 1) Çok renkli lekeli örneği çalıştırmak ve toplama tüpleri içine pericyte ve adventisyal hücre popülasyonlarının toplamak.
    NOT: Optimal canlı hücre verimleri perisitlere için toplam canlı hücre ayrışma yaklaşık% 3 ve adventisyal hücreler için% 4'tür.

4. Hücre Kültürü

  1. FACS sıralama sonucuna göre uygun boyut kültür plakaları seçin. Tüm kuyuları büyüme alanının cm2 başına steril% 0.2 jelatin çözeltisi 100 ul ekleyin ve ceket elle çalkalayın. 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve tam olarak jelatin solüsyonu çıkarın. kültür plakaları hazırlanıyor iken buz üzerinde toplanan hücreler tutun.
    Not: jelatin kaplı kültür yüzey üzerine 30.000 ile 40.000 hücre / cm2 yoğunluğunda tohumlanır yeni hazırlanmış kriteri perisitler ve adventitial hücreler de büyür.
  2. 4 dakika boyunca 200 x g'de yeni toplanmış hücreler santrifüj ve yavaşça EGM-2.Seed uygun miktarda jelatin kaplı plakalar üzerine hücre, hücre pelet yeniden askıya.
    Not: hücrelerin sayısı kuyu ve EGM-2 eklenecek miktarı başına numaralı seribaşı olan plaka seçiminize bağlıdır. Örneğin, 0.5 ve 1 ml EGM-2, sırasıyla 48- ve 24-kuyucuklu levhalar için oyuk başına ihtiyaç vardır.
  3. Değişim EGM-2 perivasküler hücre büyüme ortamı için (Hücreler (), en az 72 saat sonra, plaka yerleşmiş ve yapıştırılır sonra DMEM iki perisitler ve adventitial hücreleri% 20 FBS ve% 1 P / S) ile takviye edilmiştir. o andan itibaren Ortam her 72 saat değiştirin. C 5% CO2 ve 37 ° C'de, ilk ve sonraki bütün inkübasyonlar yapın.
  4. perisitler ve adventisyal hücreler 80-90% izdiham ulaştığınızda% 0.05 tripsin EDTA kullanılarak hücreleri ayırmak. Kaplanmamış polistiren kültür plakaları üzerine 3: 1 oranında daha sonra da geçiş hücreleri perivasküler hücre büyüme ortamı içinde yeniden askıya almak ve, PBS içinde% 20 FBS, 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile söndürün. Itibaren geçit 2, 1 pasaj hücreleri: 5 oranında (ya da yaklaşık 7.000 hücre / cm2), kaplanmamış polistiren kültür plakaları veya şişelere.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreler ileri ve yan dağılım dağılımları esas alınarak enkaz ve çiftlerin ayırt edilmiştir. Canlı hücreler DAPI boya almak için onların başarısızlığı ile tespit edilmiştir. Ayırıcı stratejisi bu canlı bütün kardiyak hücre ayrılma (Şekil 1) izotip kontrolü etiketleme temelinde seçildi. Canlı hücrelerden, CD45 + hücreler, ilk olarak, üzerinden geçitlendi CD56 + hücreleri eklenmiştir. CD144 + Daha sonra endotel hücreleri CD56 çıkarıldı ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artan kanıtlar yaralanma sonrası yetişkin insan kalbinin sınırlı rejeneratif kapasitesi destekler. Yaralı kalplerinde böyle rejeneratif yanıtları sorumlu yerli öncü hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ilgili mekanizmalar ve sinyal yollarının anlaşılması ve terapötik bu hücreleri kullanmak için yaklaşımların geliştirilmesi hem de kritik öneme sahiptir.

Önceki protokoller insan iskelet kası 25 den perivasküler öncü hücre alt gruplarının izolasyonu tarif etmişlerdir. Ancak, k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çelişkisi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Edinburgh Üniversitesi'nden Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi ve Will Ramsay'e ve Pittsburgh Üniversitesi'nden Alison Logar ve Megan Blanchard'a akış sitometrisi konusundaki uzman yardımları için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Anne Saunderson ve Lindsay Mock'a insan dokularının elde edilmesindeki yardımları için teşekkür etmek istiyoruz. İnsan yetişkin ve fetal kalp dokusu örnekleri, sırasıyla NHS İskoçya Tayside Tıbbi Araştırma Etiği Komitesi ve NHS Lothian Araştırma Etik Komitesi'nin (REC08/S1101/1) tam etik izni ile temin edildi. Bu çalışma, Tıbbi Araştırma Konseyi (BP), İngiliz Kalp Vakfı (BP), Pennsylvania Topluluğu (BP), Pittsburgh Çocuk Hastanesi (BP), Ulusal Sağlık Enstitüsü R01AR49684 (JH) ve R21HL083057 (BP) ve Pittsburgh Üniversitesi'nde (JH) Henry J. Mankin Kürsüsü tarafından desteklenmiştir. JEB, İngiliz Kalp Vakfı Araştırma Mükemmeliyet Merkezi doktora eğitim ödülü (RE/08/001/23904) tarafından desteklenmiştir. WC, kısmen Amerikan Kalp Derneği doktora öncesi bursu (11PRE7490001) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AbC Anti-fare Boncuk KitiMoleküler ProblarA-10344
Kollajenaz IGibco17100-017Tozu gerektiği gibi sulandırın ve filtre sterilize edin
Kollajenaz IIGibco17101-015
Kollajenaz IVGibco17104-019
anti-insan CD34-PEBD Pharmingen555822Steril tutun
anti-insan CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833steril
anti-insan CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747steril anti-insan
CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566steril tutun
anti-insan CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647Steril
tutun EGM2-BulletKitLonzaCC-3162
piruvat içermeyen DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAXThermoFischer Scientific10566-016
Fetal Sığır SerumuThermoFischer Scientific10500-064Alikotlarda dondurun ve steril tutun
JelatinSigma AldrichG1393Steril su ile seyreltin
IgG1k-PEBD Pharmingen559320
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen'i
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen'itutun557872
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen'itutun
561566 IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647Steril tutun
Fare serumuSigma AldrichM5905Keep steril
Parafin Filmi - Parafilm MSigma AldrichP7793
Penisilin-StreptomisinGibco15979-063Alikotlarda dondurun ve steril
Fosfat tamponlu tuzlu su pH'ı saklayın pH 7.4ThermoFischer Scientific10010-023Steril
Tutun Kırmızı Kan Hücresi Parçalama Tamponu Hybri-MaxSigma AldrichR7757Steril
Trypan'ı koruyun Mavi ÇözeltiSigma AldrichT8154
Tripsin-EDTA% 0.5 (10x)İnvitrojen15400-054
& nbsp; FACSARIA FUSIONBD PharmingenFloresan Aktif Hücre Sıralayıcısı
Sodyum yapışana kadar hücrelerin ve kültürün toplanması için steril tutun 557873 steril steril

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Perivascular Precursor CellsCardiac Tissue IsolationFluorescent Activated Cell SortingCD146 CD34 MarkersTissue Digestion ProtocolCell Strainer FiltrationFlow Cytometry AnalysisCell Viability AssessmentMyocardial Progenitor CellsCell Surface Markers

İlgili makaleler