Bu yazıda, transkripsiyonu ve bakteriyel transkripsiyonu hedefleyen antibakteriyel ajanların inhibitör aktivitesini işlevsel olarak incelemek için bir protokol açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama
Bu makalede
Özet
Özet
In vitro transkripsiyon analizleri geliştirilmiştir ve yaygın transkripsiyon rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için yıllardır kullanılmaktadır. Bu işlem, çok-alt-birim DNA-bağımlı RNA polimeraz (rnap) ve gen ekspresyonu ne rnap aktivitesini modüle için harekete transkripsiyon faktörlerinin bir dizi gereklidir. radyoaktif işaretli transkript dizileme jel elektroforezi hangi parametreler bunu nasıl etkilediğini transkripsiyon ilerler ve ayrıntılı mekanistik bilgi vermek için kullanılır. Bu yazıda, esas uzama faktörü nusa transkripsiyonel duraklatma olarak rnap holoenzyme oluşumunun inhibisyonu yoluyla transkripsiyon inisiyasyon hedefleme bir antibakteriyel ajanı tanımlamak için bir yöntem düzenler nasıl çalışma protokol açıklar. Bu yöntemler de tam olarak bilinmemektedir transkripsiyon faktörlerinin etki mekanizması, aynı zamanda, yeni antibakteriyel agen keşfetmek için ilave yaklaşımlar geliştirilmesi için platform olarak kullanılabilirts antibiyotik araştırma ve geliştirme bir atıl ilaç hedefi olan transkripsiyonu hedefleyen.
Giriş
Transkripsiyon, RNA, belirli bir DNA şablonu sentez edildiği bir süreçtir. Ökaryotik hücrelerde üç farklı RNAPs vardır: rnap I rRNA öncüllerini transkripsiyonun rnap II mRNA ve bazı küçük nükleer RNA sentezi için sorumludur ve 5S rRNA ve tRNA sentezi rnap III ile gerçekleştirilir. bakteri, RNA, tüm sınıfları transkripsiyon sorumlu tek bir rnap vardır. başlatma, uzama ve sonlanma: transkripsiyon üç aşaması vardır. Transkripsiyon hücrede en çok düzenlenen süreçlerden biridir. Transkripsiyon döngüsünde Her aşamada gen ifadesinin 1 düzenlenmesi için bir kontrol noktasını temsil eder. Başlatılması için, rnap açık hızlandırıcı kompleks oluşturmak için....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Dikkat: Deneyler radyoaktif izotop 32 P kullanımını içerir ve tüm uygun güvenlik koşulları sağlanana kadar hiçbir çalışma yapılmalıdır. Genellikle personel güvenlik kursuna katılmak ve önceki radyoaktif reaktifler kullanılarak deneylere denetimli uygulama geçmesi gerekmektedir. reaksiyonu yaparken kişisel koruyucu donanımları giyiniz (termolüminesans dozimetre, koruyucu gözlük, eldiven, radyasyon odası laboratuvar mont, tam uzunlukta pantolon, ayakkabı-ayak kapalı).
Deney 1. Malzemenin Hazırlanması
- Transkripsiyon deneyi için proteinler Gerekli elde edin.
- Burada anlatılan deney için, aşırı üretim ve E. arındırmak E. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Transkripsiyon verimi, farklı zaman noktalarında bantlarında radyasyon seviyesini ölçmek suretiyle belirlenebilir. Duraklatma tahlil duraklama, fesih görselleştirme etkin Nusa faktörü işlevi sınamak ve run-off ürünler (Şekil 1A) için. (Nusa NTD, amino asit kalıntıları 1-137) nusa N-terminal alanının varlığında, RNA ürünlerinin görünümünü önemli ölçüde nusa yoksun olan kontrol deneyi ile karşılaştırıldığında gecikmiştir. amino asitler bir dizi alanine nusa fragmanı ya da .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bütün organizmalarda, transkripsiyon bir sıkı regüle süreçtir. Transkripsiyon analizleri transkripsiyon faktörleri, küçük moleküller ve transkripsiyon inhibitörlerinin etkilerini test etmek için bir platform sağlamak için geliştirilmiştir in vitro. Bu yöntem, bir kağıt, genel bakteriyel transkripsiyon için bir tahlil tanımlanmıştır. Onlar bir zaman çizgisi boyunca tüm transkripsiyon ürünlerinin görselleştirme izin olarak transkript dizi jel elektroforezi ile kombine transkripsiyon analizleri mekanik çalışmalar .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Newcastle Üniversitesi'nden (CM) bir Fakülte Erken Kariyer Bursu'nu kabul eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| için gerekli proteinleri elde edin | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| DEPC ile muamele edilmiş su | |||
| dietil pirokarbonatın (DEPC) hazırlanması | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNaz içermeyen su | |||
| Ambion Nükleaz İçermeyen Su | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA Şablon Hazırlama | |||
| Sihirbazı Ayrıca SV Minipreps DNA Saflaştırma Sistemi | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primerleri | |||
| Wizard SV Jel ve PCR Temizleme Sistemi | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 florospektrometre | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Hazırlama | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| Yüksek Saflıkta rNTP'ler | GE Sağlık | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radyoaktif bileşik |
| RNA merdiven hazırlığı | |||
| Novagen Mükemmel RNA İşaretleyici Şablon Karışımı 0.1– 1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnezyum klorür | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Jel hazırlama | |||
| Sequi-Gen GT nükleik asit dizileme hücresi ve nbsp; | Biyo-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| üre | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris (hidroksimetil) aminometan ve nbsp; | Sigma-Aldrich | ||
| borik asit | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| etilendiamintetraasetik asit | Sigma-Aldrich | ED | |
| %40 Akrilamid/bis-akrilamid | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| amonyum persülfat ve nbsp; | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N, N, N', N' < / em>-Tetrametiletilendiamin (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transkripsiyon Testi | |||
| Potasyum klorür | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| gliserol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampisin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamid ve nbsp; | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromofenol mavisi | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| ksilen siyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonükleaz İnhibitörü | Promega | N2511 | |
| Transkripsiyon tamponu | |||
| Tris tabanı | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potasyum klorür | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnezyum klorür | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| gliserol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filtre kağıdı | |||
| Whatman 3MM Chr Kromatografi Kağıdı | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radyoaktif dekontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Jel Tedavisi | |||
| Typhoon Trio+ görüntüleyici | GE Healthcare Yaşam Bilimleri | 63-0055-89 |
Kaynaklar
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymer....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
