Hücre yapışkanlığı, biyomalzeme araştırmaları ve doku mühendisliğindeki birçok yaklaşımın anahtarıdır. Peptitler ile önemli polimer PTFE'nin yüzey modifikasyonu için ıslak kimya kullanılarak adım adım bir teknik sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Geliştirilmiş Hücre yapışma Politetrafloroetilen Islak Kimya ve Peptit İmmobilizasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
malzemeler hücre yapışma özelliklerine sahip yüzey endowing biyomalzeme araştırma ve doku mühendisliğinde yaygın bir stratejidir. Bu durum, bu maddeler de önlenebilir yeni sentezlenmiş polimerlerden tanıtımı ile bağlantılı özelliği ve yasal sorunlar nedeniyle tıpta uzun süreli kullanımı vardır önceden onaylanmış bir polimer için özellikle ilgi çekicidir. Politetrafloroetilen (PTFE), vasküler greft üretimi için en sık kullanılan malzeme biri ama polimerin özelliklerini teşvik hücre yapışmasını yoksundur. Endotelizasyon örneğin, endotel hücrelerinin konfluent tabakası ile greft iç yüzeyi tam kapsamı esas olarak yapay bir arayüz trombojenisitesini azaltmak suretiyle, en iyi performans için anahtar kabul edilir.
Bu çalışma, peptit ile modifiye edilmiş PTFE üzerinde endotelyal hücrelerin büyümesini incelenmiş ve modifiye edilmemiş alt tabaka üzerine elde edilen bu sonuçlar karşılaştırır. ile Kavramaendotelyal hücre yapışma peptid Arg-Glu-Asp-Val (REDV) daha sonra konjügasyon adımları, ardından reaktif sodyum naftalenid ile fluorin-içeren polimerin aktivasyonu yoluyla gerçekleştirilir. Hücre kültürü, bir, iki haftalık bir süre boyunca gösterilmiştir peptid hareketsizleştirilmiş malzeme İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücreleri (HUVECs) ve mükemmel hücresel büyüme kullanılarak gerçekleştirilir.
Giriş
Yani gelişmiş biyouyumluluk, hücre yapışma eksikliği, fibrotik kapsülleme ve trombojenitesine uyarılmasını göstermezler süredir onaylanan tıpta kullanılan çeşitli polimerler, birkaç söz. biyo ve biyolojik sistemi arasındaki etkileşimler özellikle implantın yüzeyinde yer alır. Bunun bir sonucu olarak, araştırma etkilenmez malzemenin yığın özelliklerini bırakarak istenilen uygulama için uygun özellikleri oluşturmak için yüzey değişimi üzerine odaklanmıştır. Fizyolojik olarak inert bir polimer olarak politetrafloroetilen (PTFE) gibi fıtığı cerrahi mesh 1, ve en önemlisi, tıbbi bağlantı noktaları 2 ve, vasküler greftler 3 gibi birçok tıbbi alanlarda kullanılır.
Özellikle kan temas durumlarda PTFE hidrofobik doğası çoğu zaman thromboti sonuçlanan bir sonucu platelet yapışması, plazma bileşenlerinin gibi spesifik olmayan adsorpsiyon neden olurc olayları ve greft 4 tıkanması. Bundan başka PTFE, en polimerleri gibi, arzu edilen bir özellik, vasküler greft 5, iç (lümen) yüzey üzerinde endotelyal hücreleri (EC) faydalı bir tabakanın oluşumuna yol olacaktır hücre yapışması ve kapsamı desteklemez. Bir biomimetic endotel özellikle onun antitrombojenik özelliklerini 6, doğal eşdeğeri işlevlerin çoğunu yerine getirmesi beklenir. Genel biomimetic değişiklik stratejisi etkilenmemiş malzemeler dökme özelliklerini bırakarak sadece hücre yapışma malzemeyi endowing kavramına dayanmaktadır. Buna ek olarak, platelet yapışma önleyici bir yapışkan (anti-kirlenme) 7 özellikleri dahil edilmesiyle azaltılabilir. Çeşitli peptiplere - çoğunlukla hücre-dışı matrisin proteinlerden türetilen - güçlü integrin 8 sınıfına ait, hücresel reseptörlere bağlanarak hücre yapışmasını geliştirmek olduğu tarif edilmiştir. olmakBu konuda bir örnek st bilinen çoğu hücre tipi ile etkileşim peptid Arg-Gly-Asp (RGD) 'dir. Diğer amino asit dizileri özel olarak spesifik hücreler üzerinde eksprese edilen integrinler tarafından tanınır. Örneğin, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) ve Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) belirli bir şekilde 9 EC bağlamak için tespit edilmiştir. Peptidler kovalent immobilizasyon metaller ve polimerler 10,11 içeren doğal olmayan yapışkan malzemelerin bir bolluk üzerinde gerçekleştirilmiştir.
Gözenekli PTFE, daha doğrusu PTFE (ePTFE) genişletilmiş - polietilen tereftalat (PET) ile birlikte - vasküler üretimi için en önemli malzeme 12 greftleri olduğunu. Plazma modifikasyonu 13 veya fotokimyasal yöntemlerle 14 tarafından uygun tedaviler için kurulan fiziksel teknikler, gözenekli ve / veya boru şeklinde yapılar sırasıyla gözenekler ya da lümene içinde kolayca tedavi edilebilir olmadığı gerçeği ile engellenmektedir. Islak kimyasıPTFE üzerinde çünkü çoğu kimyasal saldırılar 15 direnen fluorin içeren polimer derece etkisiz doğası zor bir iştir.
Bu yazıda bir kovalent modifikasyon stratejisi için nispeten basit bir yöntem açıklanmaktadır. PTFE bondable işlemek için bir prosedür uyarlanan fonksiyonel gruplar biyolojik olarak aktif moleküllerin daha fazla bağlanması için çapa noktaları olarak hizmet malzemeler yüzeyinde oluşturulmuştur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Sodyum naftalinid Aktive Çözüm ve Yüzey Aktivasyon 1. hazırlanması
Not: iyi havalandırılan bir davlumbaz tepkilere yürütmek. yüksek derecede yanıcı çözücüler ve metalik sodyum gibi aşındırıcı metallerin işlemek için genel kurallara uyun. Naftalin Çok az miktarlarda dahi çok hoş olmayan bir koku (mothball), var! aksi belirtilmedikçe reaksiyonlar, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Sodyum azid son derece zehirlidir! THF moleküler elek (hacim olarak) üzerinde yaklaşık% 20 muhafaza edildi (% 99.9, Malzeme listesine bakınız). sodyum üzerinde gözle görülür bir su içeriği ile THF damıtmak. su eser miktarlarda mevcut olması durumunda, sodyum naftalenid oluşumu oluşmaz.
- (3 A moleküler elek üzerinde kurutuldu, THF,), 20 ml tetrahidrofuran içinde naftalen 1.4 g (10.9 mmol) içindeki bir çözeltisine, bir PTFE ile donatılmış bir vidalı kapaklı 100 ml'lik bir cam şişede, 0.25 g (10.9 mmol) sodyum metal ilave kaplanmış manyetik karıştırma çubuğu.
Not: Dissolu(- 40 ° C ila 35) yon ölçüde küçük parçalar ve mütevazı ısıtma halinde sodyum kesilerek arttırılabilir. Nihai çözüm karanlık, biraz yeşilimsi rengi vardır ve kesinlikle kuru koşullarda saklanabilir. - 0.5 mm kalınlığında folyo malzemeden 12 mm çapında PTFE diskleri yumruk. Mark bir tarafı (örneğin, bir mektup damga yumruk kullanarak) izopropanol ile ve temiz.
- 2 dk kullanarak forseps - 1 için aktive etme çözeltisi (adım 1.1) ayrı ayrı PTFE örnekleri inkübe. Not: koyu kahverengi, beyaz renk değişimi başarılı bir şekilde tedavi gösterir.
- Daha sonra, izo-propanol ile iki kez THF ile ve daha sonra durulanır.
Not: naftalenid çözüm tükendiğinde bir sulu açık kahverengi rengi değişir. (Muhtemelen metal sodyum ihtiva eden) Kullanılmayan naftalenid çözeltisi yavaş yavaş tasfiye etmeden önce, izo-propanol ilave edilerek dekompoze edilmesi gerekir. - Hidrojen peroksit (% 30) 3 saat süre ile trikloroasetik asit (ağ / hac)% 20 ihtiva eden tedavi örnekleri okside eder. Yıkamasu ve kuru ile. Yüzey şimdi hafif kahverengimsi bir görünüme sahiptir. Not: Aktivasyon ve oksidasyon sonucu yüzeyinin büyük ölçüde artmıştır ıslatılabilme içinde. Bu bulgu, daha önce 14 ayrıntılı olarak incelenmiştir.
- 2 saat boyunca kuru THF içinde% 50 (h / h) heksametilen diizosiyanat (HMDI) ile oksitlenir diskleri tedavi THF ile durulanır ve kurumaya bırakın.
- 3 saat ve kuru - 2 suda izosiyanat rulman örnekleri hidrolize. Not: Nihai amino işlevselleştirilmiş PTFE yüzeyi çok daha stabil izosiyanat taşıyan numuneler daha ayrıntılı bağlanma için birçok standart çapraz bağlayıcı ile uyumludur.
2. Peptit İmmobilizasyonu
- karbonat tamponu, pH 9, 50 mM% 20 (h / h) dietilenglikol diglisidil eter (diepoksit) içindeki bir çözeltisi hazırlandı.
- ayrı ayrı 24 plaka içine belirgin tarafı yukarı ile amine diskleri yerleştirin ve epoksit çözeltisi 1.5 ml ekleyin. Örneklerin tam kapsama sağlamak. 2 saat boyunca inkübe ve iki yıkamakatı, suyla ve bir kez karbonat tamponu ile yıkandı.
- Taze 24 plaka, tek tek oyuklara altına, NaN3% 0.01 ihtiva eden 50 mM bir 0.5 mg / ml peptid (ör REDV) karbonat tamponu, pH 9, 50 ul ekle ve dikkatli bir şekilde, epoksi-fonksiyonlu diskler ters yer aşağıya doğru peptid solüsyonu damlasına üzerine (yani aşağı yan işaretlenmiştir). Kuyunun dibine PTFE disk arasındaki boşluk tamamen nedeniyle kılcal eylem ıslanan olduğundan emin olun.
- Islak odasında inkübe (örneğin, sıkı bir kapama kapağı ile bir sızdırmaz plastik kutu) nemli bir atmosferde gece boyunca en az 3 saat ya da için (alt ıslak kağıt mendil yerleştirerek).
Not: REDV motifi gibi iyi karakterize kabul edilebilir olsa bir karıştırılmış veya ters bir amino asit sekansı, ek bir negatif kontrol olarak dahil edilebilir. - su ile üç kez yıkanır ve en az 30 dakika boyunca,% 50 izo-propanol / su içinde sterilize edilir. Tohumlama, rin hücre Öncekisteril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde örnekleri e.
3. Hücre Yayımlama
- Standart hücre kültürü prosedürleri 17,18 kullanarak HUVECler büyütün.
- 24 yuvalı plakalar içinde tadil edilmiş tarafı yukarı peptit-konjuge numuneler. Bir kontrol olarak işlenmemiş PTFE diskleri kullanın.
- Tohum 5 x 10 4 oyuk başına 2 ml'lik ortam içinde HUVECler ve bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 4 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir.
- diskleri çıkarın, unattached hücreleri çıkarmak ve yeni bir 24 plaka aktarmak dikkatlice yıkayın. İstenen süre boyunca taze ortam 2 ml ilave edilir ve kuluçkaya (örneğin, 24 saat, w, 1, vb.) her iki günde orta değiştirin.
- dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1 mg / ml Calcein-AM bir stok çözelti hazırlayın.
- Büyümeden sonra hücreler, orta kaldırmak, PBS ile yıkayın ve PBS ihtiva eden 1 ul / ml Calcein-AM leke ekleme (örneğin, ml PBS her bir stok çözeltisi 1 ul). Hafifçe ajitasyon ve incubatKaranlıkta 45 dakika boyunca 37 ° C 'de, e.
- Standart FITC filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskop mikrograflar almak (Ör 488 nm, Em 515 nm) hemen PBS ile yıkayın ve. 100-kat büyütme kullanın. değiştirilmemiş gelen triplicates gibi muamele örnekleri gerçekleştirin.
- ImageJ yazılımı kullanarak hücreler tarafından kolonize alanı belirlemek. Alternatif elle hücreleri saymak veya ImageJ kullanın. Her iki yöntem de ilgili yüzeylerde eki ve hücrelerin büyümesi ile ilgili benzer bilgiler verecektir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Önemli kimyasal reaksiyon adımlarının sonuçlar IR spektroskopisi (Şekil 1) ile izlendi. sodyum naftalenid ile ilk aktivasyon çift bağları oluşturur - ve küçük bir ölçüde - OH-işlevleri. Sinyal gösteren C = C bağının hemen hemen tamamen, hidroksil grubu taşıyan bir yüzey verecek şekilde oksidasyon ortadan kalkar. Daha fazla standart konjugasyon adımların analizi burada gösterilmemiştir. Aktivasyonu ve oksidasyona bağlı renk değişiklikleri kullanılan beklenen kimya ile uyu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PTFE yüzey modifikasyonu protokolünün ayrıntılı açıklaması Şekil 6'da gösterildiği gibi, polimer omurgasından flor ortadan kaldırılması ile başlayarak ardışık adımlardan oluşur. Bunun bir sonucu olarak, bir katman konjuge karbon-karbon çift bağlarının bol miktarda içerir, meydana gelen naftalenid tedavisi üzerine geliştirilen koyu kahverengimsi renk ile uyum. Asidik hidrojen peroksit ile standart oksidasyon soluk kahverengi aydınlatıcı eşliğinde hidroksile yüzey, bu çift bağların kaybı yansıtmaktadı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Walter Scholdei'nin (Max-Planck-Polimer Araştırma Enstitüsü, Mainz, Almanya) yardımlarına teşekkür etmek isterler.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| PTFE folyo 0,5 mm | Cadillac Plastik | n/a | |
| REDV peptit | Genecust | n/a | özel sentez >%95 saflıkta |
| izo-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahidrofuran (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimetilsülfoksit | Sigma Aldrich | D8418 | |
| moleküler elek 3 & | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodyum metali | Sigma Aldrich | 483745 | |
| fosfat tamponlu salin (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naftalin | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hidrojen peroksit% 30 | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trikloroasetik asit | Sigma Aldrich | T6399 ve nbsp; | |
| dietilen glikol diglisidil eter | Sigma Aldrich | 17741 | |
| heksametilen diizosiyanat (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein- | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodyum bikarbonat | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodyum azid | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 kuyulu plakalar | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spektrofotometre Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| floresan mikroskobu Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vasküler greft | Gore | n/a |
Kaynaklar
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. Bioengineered blood vessels. Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. Plasma-based biofunctionalization of vascular implants. Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007(2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
