Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Summary

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Abstract

Akciğerler, böbrekler ve meme bezleri gibi dallanmış organların mimarisi, mikro çevredeki çeşitli çözünür ve fiziksel sinyaller tarafından düzenlenen dallanma morfogenezinin gelişimsel süreci boyunca ortaya çıkar. Burada açıklanan, hücre dışı bir matris (ECM) içine tamamen gömülü, tanımlanmış şekil ve boyutta tasarlanmış üç boyutlu (3B) epitel dokuları oluşturarak dallanma morfogenezi sürecini incelemek için oluşturulmuş bir yöntemdir. Bu yöntem, aynı doku dizilerinin oluşturulmasını sağlar ve doku geometrisi, aralık ve ECM bileşimi dahil olmak üzere çeşitli çevresel faktörlerin kontrolünü sağlar. Bu yöntem, hücreler ve çevrelerindeki ECM arasındaki etkileşimler hakkında daha fazla bilgi edinmek için çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) gibi yaygın olarak kullanılan tekniklerle de birleştirilebilir. Protokol, kanser istilası da dahil olmak üzere dallanma morfogenezinin ötesinde çeşitli hücre ve doku süreçlerini araştırmak için kullanılabilir.

Introduction

morfojenezi dallanma olarak bilinen kollara ayrılmış epitelyal dokuların gelişimi, hücre-türevli, fiziksel ve çevresel faktörler ile düzenlenir. meme bezinde, morfolojilerinden dallanma toplu hücre göçü bir ağaç gibi mimari oluşturur güdümlü aracılığıyla tekrarlanan bir süreçtir. İlk adım şube başlatılması ve uzama ^1,2 izledi süt kanallarından birincil tomurcuğu oluşumu vardır. Çevredeki stromaya dalları Invasion ergenlik steroid hormonların sistemik salınımı ile indüklenir. Yeni birincil tomurcukları sonra varolan şube uçlarından başlatabilir ve bu süreç bir epitel ağacı ³ yaratmaya devam ediyor. Birçok önemli biyokimyasal sinyaller tespit edil....

Protocol

Çözümler 1. hazırlanması

1. Insülin, 5 mg / ml çözelti hazırlamak (çözücü, 100 ml, 500 mg insülin) O dH ₂ 5 mM, hidroklorik asit (HCI) ile toz haline getirilmiş insülin stokları sulandırmak. Damıtılmış su, 100 ml konsantre HCI, 50 ul ekleyerek çözücü 100 ml (DH ₂ O) hazırlayın.
2. PBS 1x solüsyon yapmak için, steril koşullar altında DH ₂ O 1x, 10x, fosfat tamponlu tuz (PBS) stok çözeltisi seyreltilir.
3. şöyle polidimetilsiloksan (PDMS) bir elastomer çözeltisi hazırlayın: 1 (ağ: ağ) oranı, bir 10 ısıyla sertleştirme maddesi ile bir araya PDMS prepolimeri karıştırın.
4. aşağıda hücre kültür ortamı hazırlayı....

Results

Meme epitelyal dokusu mikroimalat genel şematik

Deneysel çalışma akışını özetleyen mikroimalat prosedürünün genel şematik Şekil 1'de gösterilmiştir. Sonuçta tamamen bir ECM jel içinde gömülü olan özdeş geometri ve aralık epitel dokuda bir dizidir. Temsili deney I, 4 mg / ml bir konsantrasyonda kolajen sığır türü bir jel içinde kültürlenmiş EpH4 fare meme epitelyal hücreleri kullanılmaktadır. Mühendislik dokuların en yüksek ka.......

Discussion

Yukarıda açıklanan protokol, dokudaki hücrelerin yaşadığı mekanik stresin uzamsal kontrolünü sağlayan, önceden tanımlanmış şekle sahip özdeş epitel dokuları üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir. Tip I kollajende boşluklar oluşturmak için elastomerik bir kalıp kullanılır, bunlar daha sonra epitel hücreleriyle doldurulur ve hücrelerin bir 3D kollajen matris ortamında tamamen kapsüllenmesi için ek bir kollajen tabakası ile kaplanır. Bu dokuların daha fazla kültürü ve başlangıç mimarisinden dallanmayı indüklem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polidimetilsiloksan (PDMS)	Ellsworth Yapıştırıcılar	Sylgard 184
PDMS kürleme maddesi	Ellsworth Yapıştırıcılar	Sylgard 184
Litografik desenli silikon usta	kendi kendine yapılan	N/A
Plastik tartı teknesi	Fisher Scientific	08-732-115
100 mm çapında Petri kapları	BioExpress	D-2550-2
Etil Alkol 200 Korumalı	Pharmco-Aaper	111000200	dH2O Tıraş Bıçağı ile karıştırarak %70 EtOH (v:v) çözeltisi yapın
	Amerikan Emniyetli Tıraş Bıçağı	620179
1:1 Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta : Jambon' s F12 Besin Karışımı (DMEM/F12) (1:1)	Hiklon	SH30023FS
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' s dengeli tuz çözeltisi (HBSS)	Yaşam Teknolojileri	14185-052
İnsülin	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamisin	Yaşam Teknolojileri	15750-060
10x Fosfat tamponlu salin (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Sodyum hidroksit (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Sığır tip I kollajen (pepsinizsiz)	Koken	IAC-50
Sığır serumundan elde edilen albümin (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Kavisli paslanmaz çelik cımbız	Dumont	7
35 mm çaplı doku kültürü kapları	BioExpress	T-2881-6
15 ml konik tüpler	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Güvenli Kilit Tüpü	USA Scientific	1615-5500
Dairesel #1 cam lameller, 15 mm çapında	Bellco Glass Inc.	Özel sipariş
% 0.05 1x Tripsin-EDTA	Yaşam Teknolojileri	25300-054
Paraformaldehit	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Deterjan
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	50 mg / ml'de dH < sub > 2 < / sub>O'da Yeniden Süspansiyon
Tavşan anti-fare FAK antikoru	Hayat Teknolojiler	AMO0672
Keçi anti-tavşan Alexa 488 antikor	Yaşam Teknolojileri	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Renk kodlamalı piksel frekans haritaları için kullanılır.
FIJI (ImageJ)	NIH N	/A	Bir piksel frekans haritası oluşturmak için görüntüleri eşiklemek, kaydetmek ve üst üste bindirmek için kullanılan ücretsiz görüntü analiz yazılımı. StackReg eklentisi, ikili görüntüleri kaydetmek için kullanıldı.