Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Genom ve metagenom madenciliği için teknikler son yıllarda hızla gelişmiştir ve bu nedenle rekombinant enzimleri klonlamak ve eksprese etmek için orta ve yüksek verimli stratejiler geliştirmiştir. Ayrıca, biyoinformatik kaynaklar ve (CAZy)^1,2 gibi ilgili depolar büyük ölçüde genişlemiştir. Bununla birlikte, mikrobiyal enzim çeşitliliğinin endüstriyel amaçlar için kullanılmasının doğasında önemli zorluklar vardır ve enzim aktivitelerinin ampirik olarak belirlenmesi artık ciddi bir darboğaz haline gelmiştir. Örneğin, mevcut yöntemleri kullanarak, CAZy veri tabanındaki proteinlerin en fazla %4'ünün aktivitelerini güvenli bir şekilde tahmin edebileceğimiz tahmin edilmektedir. Enzim aktivitelerini izlemek için çok sayıda yöntem mevcut olmasına rağmen, hepsinin bazı sınırlamaları vardır. Glikosil hidrolaz (GH) aktivitelerinin oligomerik fragmanlarını değerlendirmek için kütle spektrometresi ile birleştirilmiş kromatografiye dayalı iyi bilinen teknikler mevcuttur^3,4. Ancak, bu yaklaşımlar emek yoğundur ve genellikle düşük aktarım hızıdır. Dinitrosalisilik asit⁵ ve Nelson-Somogyi⁶ tahlilleri gibi indirgeyici şekerlerin ölçümüne dayanan yöntemler, GH aktivitelerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu tahliller sınırlı verime sahiptir ve yan reaksiyonlara eğilimli olabilir. Azurin çapraz bağlı (AZCL) gibi bireysel kromojenik polisakkarit substratları, enzim aktivitelerinin belirlenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak tüm substratları ayrı ayrı satın almak ve substrat tozlarını tahlil plakası içinde manuel olarak dağıtmak zahmetli ve maliyetli olabilir⁷.

96 oyuklu bir filtre plakası ile birlikte kullanıldığında yüksek verimli bir tahlil sistemi oluşturan klorotriazin boyalarına dayalı yeni nesil kromojenik polimer hidrojel (CPH) substratları geliştirdik. Lignoselülozik biyokütlede bulunanlar gibi karmaşık polimer karışımları içinde substrat mevcudiyeti hakkında bilgi sağlayan ek Çözünmeyen Kromojenik Biyokütle (ICB) substratları geliştirilmiştir. Her bir alt tabaka dört renkten birinde üretilebilir ve farklı renkli alt tabakalar tek bir kuyuda birleştirilebilir. Bu protokolde, bu metodolojinin çok çeşitli polisakkaritlere ve proteinlere uygulanabileceği ve GH'leri, litik polisakkarit monooksijenazları (LPMO'lar) ve proteazları tarama potansiyeli gösterilmiştir. 96 oyuklu plakanın kullanımı için özel protokoller sağlanmıştır ve temsili sonuçlar, enzim taraması için araçlar olarak CPH ve ICB substrat kitlerinin yüksek verimliliğini göstermektedir.

Açıklanan tahlil kitlerinin önemli bir avantajı, substrattan bağımsız olarak, kitlerin aktivasyon adımından sonra 15 dakika içinde kullanıma hazır olmasıdır. Bu, diğer bazı yöntemlerde olduğu gibi, tahlilin ham substrat malzemelerinden zaman alıcı montajı ihtiyacını ortadan kaldırır⁷. CPH ve ICB substratları mükemmel depolamaya (oda sıcaklığında en az bir yıl), pH ve sıcaklık stabilitesine ⁸ sahiptir ve özel ekipman veya eğitim gerektirmez. CPH veya ICB tahlilleri, enzim ile reaksiyonun gerçekleştirildiği 96 oyuklu filtre plakasına dayanır. Enzim belirli bir substrat ile aktifse, çözünür boyalı oligomerler üretilir ve daha sonra bir vakum manifoldu veya bir santrifüj ⁸ kullanılarak normal bir açık kuyulu 96 oyuklu plakaya süzülebilen renkli bir süpernatant üretilir.

Substratlar, görünür spektrum (VIS) aralığında absorbe edilen klorotriazin boyaları ile boyanır ve farklı renklerdeki farklı CPH substratları tek bir kuyucukta karıştırılırsa ve enzim birden fazla substrat üzerinde etki ederse, tek tek renkler (kırmızı, mavi, sarı ve yeşil) doğrusal regresyon kullanılarak çözülebilir. Süpernatantlarla elde edilen plaka, VIS aralığında absorbansı ölçebilen standart bir mikrotitre plaka okuyucu kullanılarak ölçülebilir. Farklı alt tabakaların farklı renklerle tek bir kuyucukta karıştırılması, tahlil sisteminin verimini artırır ve 96 oyuklu bir plakada (oyuk başına farklı renklerde 4 farklı alt tabaka) toplam 384 deneye ulaşır.

CPH substratları, bir enzimin spesifik aktivitesini değerlendirmek için değerli bir araç sağlarken, ICB substratları, enzimlerin genellikle biyokütle içinde karşılaştığı karmaşık substrat karışımları bağlamında bir enzimin bir bileşeni sindirme kapasitesini değerlendirmek için kullanılır. ICB substratları, bireysel enzim özgüllükleri hakkında bilgi sağlamasa da, yine de enzimlerin, kokteyllerin veya et sularının ticari performansını değerlendirmek için yararlı araçlardır.

96 çukurlu bir levha formatında CPH Substratlar 1. kromojenik tahlille

1. Deney kiti plakasının etkinleştirme
   1. çalkalama olmaksızın oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon ile takip her kuyuya (kit ile elde edilmiş) 200 ul aktivasyon çözeltisi eklenerek deney kiti plakası (Malzeme listesi) (mavi CPH-ksilen içeren), 96-çukurlu bir filtre etkinleştirmek için kullanılır.
   2. günümüze kadar gelen aktivasyon çözeltisi kaldırmak için (iç boşluk bloğu ve herhangi bir standart bir toplama plakası gibi şeffaf 96 oyuklu tabanı ile), bir vakum manifoldu kullanılarak vakum uygulayın. Bunun yerine, vakum manifoldunun Bu aşama için 10 dakika boyunca 2700 x g'de santrifüje kullanmak da mümkündür.
   3. 100 ul steril su eklenerek CPH alt tabakaların yıkanması ve dengeleyici çıkması için vakum (ya da merkezkaç kuvveti) uygulanacaktır. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve plakalar artık kullanıma hazırdır.
2. Enzim reaksiyonu,
   NOT: Her zaman tampon içerirtek başına negatif kontrol olarak ve pozitif kontroller olarak mümkün olan, daha önce karakterize edilen enzimler durumunda. çoğaltır istatistiksel uygun sayıda kullanın. CPH substratlar 10.0'a pH 3.0 ve 180 uL geçmemelidir her çukuruna tampon ucu enzim çözeltisinin toplam hacmi arasındaki stabildir. Bitki ekstresi veya kültür brotu yerine de saflaştınlmış enzim çözeltisi kullanılabilir.
   1. 150 ul 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve tahlil kiti plakasının her oyuğuna (1 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar), 5 ul Endo -cellulase solüsyonu ekleyin.
   2. çalkalama sırasında reaksiyon plakasından herhangi bir olası kaçak toplamak için deney kiti plaka altında ürün plakası (mikrotitre plaka okuyucusu ile uyumlu berrak kuyucuklu plak) koyun.
   3. 150 rpm'de yatay çalkalayıcıda 30 dakika boyunca 25 ° C'de tahlil kiti plaka inkübe edin.
      Not: inkübasyon esnasında deney kiti plaka reaksiyonu Karıştırma tutarlı ve üreme elde edilmesi için çok önemlidirtekrarlanabilir sonucu. CPH substratlar 90 ° C 'ye kadar stabildir. CPH yüzeylerde bilinmeyen enzim konsantrasyonları içeren kültür broths test ederken inkübasyon süresi 24 saat kadar artırılmalıdır. Uygun enkübasyon süreleri enzim (ler) aktivitesine bağlı olduğuna dikkat edin, fakat 24 saat içinde tespit edilebilir bir etkinlik ise, genel olarak, enzim, test edilen alt-tabakanın bozmayan olasıdır. Bir aktif enzim renkli süpernatant olarak görünür çözünür kromojenik oligosakkaritler, içine CPH substrat çözünmeyen kromojenik polisakkaritler aşağılayıcı olduğunu.
   4. iç boşluk bloğu ile vakum manifoldunun içinde temiz ürün plaka koyun.
   5. üstte tahlil kiti plakası yerleştirin ve vakum (-60 kPa maksimum negatif basınç) uygulanır. 10 dakika boyunca 2700 x g'de santrifüje kullanmak da mümkündür.
      Not: Reaksiyon ürünü olarak renkli oligosakaritler ihtiva eden süzüntü, daha fazla analiz ⁸ ürün plaka artık
3. Algılama ve miktarının belirlenmesi
   1. Ürün bir levhanın her çukuruna sıvı hacmi yaklaşık görsel inceleme ile aynı olup olmadığını kontrol.
   2. Bir plaka okuyucusu kullanılarak mavi CPH-ksilan 595 nm'de toplama plakası absorbansı okuyun.
   3. veri analizi yaparken, bir enzim eklendi kuyulardan değerlerden tampon sadece negatif kontrol değerleri çıkarmak. Çoğaltmak kuyulardan ^8'den ortalama değerini ve (SEM) araçlarının standart hata hesaplayın.

96 oyuklu bir formatta ICB Substratlar 2. kromojenik tahlille

1. Enzim reaksiyonu,
   1. 150 ul 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve 5 ekleme ul 31 U / ml endo -xylanase (de son enzim konsantrasyonu 1 U / ml), kırmızı ICB buğday samanı ihtiva eden deney kiti plakasının her oyuğuna Çözelti .
      Not: tahlil kiti levhalar (96-çukurlu bir filtre PLliteratürde tarif edildiği gibi ICB substratlar içeren ates) (Malzeme listesi bakınız) üretilmektedir. ICB substratlar 10.0'a pH 3.0 arasında bir pH aralığına sahip tampon stabildir. Her zaman, bir negatif kontrol olarak sadece tampon, bir pozitif kontrol olarak, ticari enzim ve yinelemeler istatistiksel uygun sayıda kullanımı bulunmaktadır.
      1. CPH alt-tabaka plaka gibi ICB alt tabakaların aktive ama vakumla süzülerek veya santrifüj, ardından 100 ul su ile üç kez yıkanarak dengeleyici kaldırın.
   2. sallayarak sırasında alt tabaka plaka herhangi bir potansiyel sızıntıyı toplamak için substrat plaka altında ürün tabak koydu.
   3. 2 saat süre ile, 150 rpm'de çalkalanarak 25 ° C'de bir reaksiyon inkübe edin.
      NOT: Bir aktif enzim renkli süpernatant olarak görünür çözünür oligosakkaritler, içine ICB substrat çözünmeyen kromojenik polisakkaritler aşağılayıcı olduğunu. ICB substratlar 90 ° C 'ye kadar stabildir. kuluçka tBöyle kültür sıvılarında olmayan saflaştırılmış enzimler kullanılması durumunda ime 24 saat kadar artırılmalıdır.
   4. iç boşluk bloğu ile vakum manifoldunun içinde ürün plaka koyun.
   5. üstte tahlil kiti plakası yerleştirin ve vakum (-60 kPa maksimum negatif basınç) uygulamak veya ürün plakasının kuyuya tahlil kiti plakadan ürünü süzmek için bir santrifüj kullanın.
      NOT: reaksiyon ürünü olarak renkli oligosakkaritler içeren süzüntü daha fazla analiz ⁸ toplama plakası artık.
2. Algılama ve miktar
   1. Toplama plakanın her bir sıvı hacmi yaklaşık görsel inceleme ile aynı olup olmadığını kontrol.
   2. Bir plaka okuyucusu kullanılarak kırmızı ICB buğday samanı 517 nm'de toplama plakası absorbansı okuyun.
   3. veri analizi yaparken - tampon çıkarma - sadece negatif kontrol değerlerini kuyulardan değerlerden nerede bir enzimeklendi. Çoğaltmak kuyulardan ^8'den ortalama değerini ve (SEM) araçlarının standart hata hesaplayın.
      NOT: bilinmiyor enzimler tarama durumda, enzimin aktivitesi dinamik aralık hakkında daha ayrıntılı veriler elde etmek amacıyla bir seyreltme serisi yapmanızı öneririz.

yüksek verimli ve bu tayinin çoklayıcı kapasitesi 96 oyuklu filtre plakası düzenlenmiş çözünmeyen kromojenik bir polimer (veya proteini), hidrojel (CPH) yüzeylere dayanır. Enzimler ayrıca negatif kontroller deney kiti plaka (Şekil 1 A) ilave edilir ve enzimler renkli bir süpernatant (Şekil 1B) üretilmesi karşılık gelen alt-tabakanın bozulmasına yol açar. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, süpernatan berrak oyuklu ürün bir levhasına aktarılır ve absorbans, 96 oyuklu plakalar (Şekil 1C) için uygun bir spektrofotometre kullanılarak doğrudan ölçülebilir.

Enzimin, farklı konsantrasyonlarda ksilanaz CPH-arabinoksilan bir doz tepkisi bir örneği (0,00-0,75 U / ml) azaltılması Enzim konsantrasyonu, görsel gözlenebilir burada Şekil 1D 'de gösterilmiştir. Daha detaylı bir spektrofotometrik kantitatifUS-PS enzim konsantrasyonu (Şekil 1E) karşı absorbansı çizmek için kullanılabilmektedir. Sinyal yoğunluğu, enzim aktivitesine karşılık gelir. Testin tekrarlanabilirliği hata çubukları ile gösterilir (ortalamanın standart hatasını, SEM, üç kopyaları). Bu testin tekrarlanabilirlik ilgili daha detaylı deneyler yerde 8 yayınlanmaktadır.

CPH-arabinoksilan. A) CPH alt-tabaka ile (deney kiti plakasının bir şema Şekil 1. Xylanase tedavisi, örneğin, CPH-arabinoksilan gibi enzimler 1 ve 2 ve tamponun ilave edilmesinden önce 96 oyuklu filtre plakası yuvaları içine yüklenmiştir) -sadece kontrolü (enzim 1 endo -xylanase aktiviteye sahipti) C) vakum yardımlı Filtrat üzerine, enzim 1 ile CPH-arabinoksilan B) Parçalanma renkli süpernatant ürettiÜrün plaka için süpernatanların iyonu, absorbans spektrofotometrik olarak ölçülür, d) Ürün plakası 100 mM endo -β-1,4-ksilanaz farklı konsantrasyonları ile 4 farklı renkte CPH-arabinoksilan tedaviden sonra, reaksiyon ürünlerini ihtiva eden sodyum asetat tamponu, pH 4.5, oda sıcaklığında 60 dakika;. E) spectrofotometrisi kullanılarak D reaksiyon ürünlerinin Niceleme bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Enzim taramasında bu testte kullanmak için farklı seçenekler vardır. Bir seçenek, örneğin tarama için farklı polisakaritler, bilinmeyen aktiviteli (saflaştırılmış) Endo -enzymes az sayıda içeren 96 çukurlu bir plaka kullanmaktır. Bu durumda sonuç, degrad olan polisakaritler gösterirHedef enzimi ile mümkün. Bu prensibi göstermek için, bir endo -cellulase 25 ° C 'de, farklı CPH substratlara karşı test edilmiştir. (1.0 U / ml ve 5 U / ml, 0.5 U / ml), üç farklı enzim konsantrasyonları 30 dakika inkübe edildi. Sonuç ürün plakası (Şekil 2A) açıkça görülebilir. Tedarikçi tarafından sağlanan -cellulase bu endo ürün levha ksiloglukan (demirhindi) için yan aktivite, arpa beta-glukan, glucomannan, huş ağacı ksilan ve galaktomannan düşük yan aktivitesini belirler. Buna uygun olarak, selülaz ilave aktivitesi CPH-β-glukan (arpa) karşı bulundu, CPH-ksiloglukan (demirhindi) CPH-galaktomannan (Şekil 2B) karşı CPH-ksilan (kayın) ve düşük faaliyet. Glucomannan test edilmemiştir. Önceki ile aynı koşullar altında pozitif kontroller olarak kullanılmıştır: Aynı CPH substratlar ticari olarak temin edilebilen enzim (0.5 U / ml ve 1.0 U / ml 0.1 U / ml, üç farklı enzim konsantrasyonları) ile sindirildideney. Bütün yüzeyler pozitif kontrol enzimi vasıtasıyla parçalanır ve sinyal yoğunluğu daha yüksek enzim konsantrasyonunun (Şekil 2C) ile orantılı olarak artış.

Şekil 2'de ise, farklı CPH alt-tabakalar farklı konsantrasyonda, 30 dakika. A) bir endo -cellulase ile sindirilmiş, farklı CPH substratların ürünü plaka 25 ° C sıcaklıkta ajitasyon altında inkübe edildi. B) aktivitesi ve çeşitli yan etkinliğinin miktarının belirlenmesi Endo -cellulase. . E-LAMSE CPH-pachyman, CPH-kurdlan, CPH-, hata çubukları, üç yinelemeler C) karşılık gelen alt-tabaka CPH (endo-selülaz ve 2-HE-selüloz farklı ticari enzim aktivitesinin ortalamanın standart hatasını temsil eder β-glukan (arpa); E-XYAN4 ve CPH-ksilen, e-XEGP ve CP'H-ksiloglukan, e-BLAAM CPH-amiloz, E-BMACJ CPH-galaktomannan; Megazyme tüm enzimler). Hata çubukları iki kopyaları ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Onlar kısmen biyokütle önemli bileşeni olan bitki hücre duvarlarında polisakkaritlerin doğal düzenleme korumak için çözünmez kromojenik biyokütle (ICB) yüzeylerde kromojenik alt tabaka repertuarına yararlı bir ek vardır. CPH ve usulü üzerinden alt tabakalar sıvı ortam içinde yetiştirildiğinde Phanerochaete chrysosporium salgılanmış enzimleri analiz için örnek kullanılmaktadır. Deney kiti plakasının plaka kurulumu 19 CPH substrat ve 5 ICB substratlar (her bir alt tabaka, Şekil 3B, 4 kuyu) ile birlikte, Şekil 3A'da gösterilmiştir. S. Chrysosporium cultivat olduÜç gün boyunca ed ve kültür süpernatanı analiz edilmiştir. Bu nedenle, 125 ul 200 mM tamponu her oyuğa 25 ul kültür yüzey eklendi aktarılmıştır. Üç farklı pH koşulları sodyum asetat tamponu pH 4.0 sodyum fosfat tamponu, pH 6.0 ya da pH 8.0 (Şekil 3C) kullanılarak test edilmiştir. Plaka 2 saat boyunca 25 ° C'de (150 rpm) çalkalanarak inkübe edildi.

Reaksiyon ürünler ürün plaka (Şekil 3D) aktarılmış ve analiz edilmiştir. S. Chrysosporium çeşitli glukan, nişasta ve ksilanlar (Şekil 3E) bozulması için enzimleri üretilmektedir. Alt sinyal yarı selülozlar arabinan (şeker pancarı) ve peptik galaktan hem de RGI (soya fasulyesi) için tespit edilebilir. üretilen enzimler nötr ya da hafif bazik koşullar (pH 8.0) daha asidik koşullar (pH değeri 4.0) daha aktifti. ICB alt tabakasma karşı düşük faaliyeti (Şekil 3F)polisakaridler daha doğal bir bağlamda olduğunda, enzim etkinliği saf polisakarid ile aynı olmadığını gösterir ve ham ya da önceden tatbik edilmesi halinde ICB alt-tabakalar, enzim etkinlik ile ilgili daha gerçekçi bir görünüm ortaya yüzden işlenmiş bitki malzemesi.

19 CPH, 5 ICB substratlar. A), her bir alt-tabaka 4 kuyucuklu bir plaka ortamında bir düzeni ihtiva eden bir çok alt-tabaka plakası kullanılarak Phanerochaete chrysosporium bir 3 günlük sıvı kültürden bir kültür üstte yüzen Şekil 3. Tarama (gri arka = CPH yüzeyler, turuncu arka plan = ICB yüzeyler). B) substrat. C içeren tahlil plakasının Resim) Programı (o deneyde kullanılan tampon koşulları gösteren200 mM sodyum asetat pH 4.0, sodyum fosfat, pH 6.0 ve sodyum fosfat pH 8.0) d.) 25 ° C. D) absorbans 2 saat sonra ürün plakasının resmi 517 nm'de ve her bir münferit CPH alt-tabaka ve F için çizildi ilgili enzimler için) ICB substrat sonuçları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kromojenik alt-tabakalar, aynı zamanda, tek enzimler kullanılarak ya da kokteyl enzim tek bir oyuk farklı renkli CPH alt tabakalar karışımı kullanılarak tedavi sonrası, reaksiyon süpernatant analiz ederek sinerjistik etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Şekil 4'te gösterilen örnekte, kırmızı CPH selüloz ve sarı CPH-ksilen substratlar yaklaşık ambalajlama birlikte karıştırılmıştır96 gözlü filtre plakası kuyuları al oranı. Şekil 4A, enzimsiz (kontrol), selüloz cel (2 U / ml), ksilanaz ksil (1 U / mL) ve bir oda sıcaklığında 1 saat işlemden sonra renkli reaksiyon ürünlerini gösteren her iki enzimin karışımı, 100 mM sodyum asetat tampon, pH 4.5 (3, her bir yaklaşım çoğaltır). Analizi için, reaksiyon ürünü, 700 nm'de (Şekil 4B) 350 nm absorbans spektrumunun tarama spektrofotometrik nicelleştirilmiştir. Genellikle yalnız gözle muayene farklı boyalar kaynaklanan absorbans spektrumları aynı zamanda her bozulması ölçüde daha doğru bir fikir vermesi için basit doğrusal regresyon 8 kullanılarak çözülebilir ancak kaydedilen enzim, bir veya birden fazla yüzeylerde hareket edip etmediğini bir göstergesidir verebilir karışımından alt-tabaka.

esas karışımları gibi CPH substratlar kullanarak SCR sağlayan tahlilin verimi artırırBir deneyde (bir de) kadar 4 farklı yüzeylerde karşı Eening. Gösterilen örnekte kullanılan dört farklı yüzeyler vardır: mavi CPH-β-glukan (arpa), sarı CPH-ksilen (kayın), yeşil CPH-amiloz ve kırmızı CPH-pektik galaktan (acı bakla). Alt-tabaka plakanın düzeni Şekil 4C ve Şekil 4D'de deney plakasının bir resim gösterilir. Reaksiyon 25 ° C ve 150 rpm'de 30 dakika boyunca 100 mM sodyum asetat tampon, pH 4.5 gerçekleştirilmiştir. Ürün plakası beklendiği gibi artan enzim konsantrasyonu ile ilk single enzimler gelen CPH substrat (Şekil 4E) ve renkli süpernatant ile test edildi alındı ​​(Şekil 4F, satır 1A - 12D). Sıra E içeren CPH-ksilen ve mavi CPH-β-glukan endo -xylanase ve endo glükanaz ilgili enzimlerin farklı oranlarda bozulmuş iki farklı CPH substratlar san. Tepkimeden sonra, sonuç visib olduğule ürün plakasında: reaksiyon ürününün rengi koyu yeşil, mavi, daha endo glükanaz mevcut iken (Şekil 4F, 4E-6E) ve (endo -xylanase konsantrasyon arttıkça, daha hafif sarı-yeşil dönüştü Şekil 4F, 10-12E). Aynı iki substratlar kırmızı CPH-pektik galaktan ve sarı CPH-ksilan endo -galactanase ve endo -xylanase ile bozulmuş edildi satır F, görülür. Dört farklı renkli CPH alt-tabaka, bu (Şekil 4F, 1G-12F) ve tek enzimler, uygun CPH substrat bozulmuş ve ek ilave renkli reaksiyon ürünleri kombine alındı ​​enzimleri ile idi.

Şekil 4. Farklı enzimler ile muamele, iki farklı CPH substrat kombinasyonu kırmızı CPH selüloz ve sarı CPH-ksilen. bir) Iki endo -cellulase (cel ile yüzeylerde) veya endo -xylanase (ksil) ya da her iki enzim. B) reaksiyon Süpernatantları absorbansı spektrumları tedavisinden sonra reaksiyon süpernatantlar. Farklı enzimler ile tedavi dört farklı CPH yüzeylerde kombinasyonu CPH substratlar içeren substrat plakasının C) Programı:. Mavi CPH-β-glukan (arpa), sarı CPH-ksilen (kayın), yeşil CPH-amiloz ve kırmızı CPH- pektik galaktan (bakla) farklı CPH substratlar içeren deney plakasının D) Resim eklendi enzimlerin oranını gösteren ürün plakası E) Programı (nominal konsantrasyonları (NC).:. glu = 1 U / ml endo glükanaz, = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amilaz ve Gal = 0,5 U / ml endo -galactanase) xyl. ürün plakasının F) resmi 30 dakika inkübe edildikten sonra, 25 ° C'de. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1. Mevcut Kromojenik Polimer Hidrojel (CPH) ve çözünmez Kromojenik Biyokütle (ICB) yüzeylerde listesi.

96-çukurlu plaka CPH alt-tabaka deneyi 96 çukurlu ICB alt-tabaka deneyi (WO2015036000 ve Danimarka, PA 2015 70311) içeren açan iki patent başvurusu bulunmaktadır.