Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Özet

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Özet

Carbohidratlar active enzymes (CAZymes) in vivo olarak birden fazla role sahiptir ve biyoyakıt, tekstil, deterjan, kağıt ve gıda endüstrilerinde endüstriyel işleme için yaygın olarak kullanılmaktadır. CAZymes'in daha derin bir şekilde anlaşılması, hem temel biyoloji hem de endüstriyel bakış açılarından önemlidir. Doğada (özellikle mikroorganizmalarda) çok sayıda CAZyme bulunur ve yüz binlercesi carbohydrate active enzyme veritabanında (CAZy) kataloglanmış ve tanımlanmıştır. Bununla birlikte, varsayılan enzimlerin keşif oranı, aktivitelerini biyokimyasal olarak karakterize etme yeteneğimizi geride bırakmıştır. Bunun bir nedeni, genom ve transkriptom dizilemedeki ilerlemelerin, ilişkili biyoinformatik araçlarla birlikte, aday CAZymes'in hızlı bir şekilde tanımlanmasına izin vermesi, ancak bir enzimin biyokimyasal özelliklerini belirleme teknolojisinin daha yavaş ilerlemesidir. Bu teknoloji boşluğunu gidermek için, çözünmeyen kromojenik substratlara dayalı yeni bir yüksek verimli tahlil kiti burada açıklanmaktadır. İki farklı substrat tipi üretildi: Chromojenik Polymer Hydrogel (CPH) substratları (saflaştırılmış polisakkaritler ve proteinlerden yapılmış) ve Içözünmeyen Chromojenik Biyokütle (ICB) substratları (karmaşık biyokütle malzemelerinden yapılmış). Hem CPH hem de ICB substratları, 96 oyuklu yüksek verimli bir tahlil sisteminde sağlanır. CPH substratları dört farklı renkte yapılabilir, bu da bunların birlikte karıştırılmasını sağlar ve böylece tahlil verimini artırır. Protokol, 96 oyuklu bir plaka testini tanımlar ve bu testin enzimlerin, enzim kokteyllerinin ve et sularının aktivitelerini taramak için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Giriş

Genom ve metagenom madenciliği için teknikler son yıllarda hızla gelişmiştir ve bu nedenle rekombinant enzimleri klonlamak ve eksprese etmek için orta ve yüksek verimli stratejiler geliştirmiştir. Ayrıca, biyoinformatik kaynaklar ve (CAZy)^1,2 gibi ilgili depolar büyük ölçüde genişlemiştir. Bununla birlikte, mikrobiyal enzim çeşitliliğinin endüstriyel amaçlar için kullanılmasının doğasında önemli zorluklar vardır ve enzim aktivitelerinin ampirik olarak belirlenmesi artık ciddi bir darboğaz haline gelmiştir. Örneğin, mevcut yöntemleri kullanarak, CAZy veri tabanındaki proteinlerin en fazla %4'ünün aktivitelerini güvenli bir şekilde tahmin edebileceğimiz tahmin edilmektedir. Enzim aktivitelerini izlemek için çok sayıda yöntem mevcut olmasına rağmen, hepsinin bazı sınırlamaları vardır. Glikosil hidrolaz (GH) aktivitelerinin oligomerik fragmanlarını değerlendirmek için kütle spektrometresi ile birleştirilmiş kromatografiye dayalı iyi bilinen teknikler mevcuttur^3,4. Ancak, bu yaklaşımlar emek yoğundur ve genellikle düşük aktarım hızıdır. Dinitrosalisilik asit⁵ ve Nelson-Somogyi⁶ tahlilleri gibi indirgeyici şekerlerin ölçümüne dayanan yöntemler, GH aktivitelerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu tahliller sınırlı verime sahiptir ve yan reaksiyonlara eğilimli olabilir. Azurin çapraz bağlı (AZCL) gibi bireysel kromojenik polisakkarit substratları, enzim aktivitelerinin belirlenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak tüm substratları ayrı ayrı satın almak ve substrat tozlarını tahlil plakası içinde manuel olarak dağıtmak zahmetli ve maliyetli olabilir⁷.

96 oyuklu bir filtre plakası ile birlikte kullanıldığında yüksek verimli bir tahlil sistemi oluşturan klorotriazin boyalarına dayalı yeni nesil kromojenik polimer hidrojel (CPH) substratları geliştirdik. Lignoselülozik biyokütlede bulunanlar gibi karmaşık polimer karışımları içinde substrat mevcudiyeti hakkında bilgi sağlayan ek Çözünmeyen Kromojenik Biyokütle (ICB) substratları geliştirilmiştir. Her bir alt tabaka dört renkten birinde üretilebilir ve farklı renkli alt tabakalar tek bir kuyuda birleştirilebilir. Bu protokolde, bu metodolojinin çok çeşitli polisakkaritlere ve proteinlere uygulanabileceği ve GH'leri, litik polisakkarit monooksijenazları (LPMO'lar) ve proteazları tarama potansiyeli gösterilmiştir. 96 oyuklu plakanın kullanımı için özel protokoller sağlanmıştır ve temsili sonuçlar, enzim taraması için araçlar olarak CPH ve ICB substrat kitlerinin yüksek verimliliğini göstermektedir.

Açıklanan tahlil kitlerinin önemli bir avantajı, substrattan bağımsız olarak, kitlerin aktivasyon adımından sonra 15 dakika içinde kullanıma hazır olmasıdır. Bu, diğer bazı yöntemlerde olduğu gibi, tahlilin ham substrat malzemelerinden zaman alıcı montajı ihtiyacını ortadan kaldırır⁷. CPH ve ICB substratları mükemmel depolamaya (oda sıcaklığında en az bir yıl), pH ve sıcaklık stabilitesine ⁸ sahiptir ve özel ekipman veya eğitim gerektirmez. CPH veya ICB tahlilleri, enzim ile reaksiyonun gerçekleştirildiği 96 oyuklu filtre plakasına dayanır. Enzim belirli bir substrat ile aktifse, çözünür boyalı oligomerler üretilir ve daha sonra bir vakum manifoldu veya bir santrifüj ⁸ kullanılarak normal bir açık kuyulu 96 oyuklu plakaya süzülebilen renkli bir süpernatant üretilir.

Substratlar, görünür spektrum (VIS) aralığında absorbe edilen klorotriazin boyaları ile boyanır ve farklı renklerdeki farklı CPH substratları tek bir kuyucukta karıştırılırsa ve enzim birden fazla substrat üzerinde etki ederse, tek tek renkler (kırmızı, mavi, sarı ve yeşil) doğrusal regresyon kullanılarak çözülebilir. Süpernatantlarla elde edilen plaka, VIS aralığında absorbansı ölçebilen standart bir mikrotitre plaka okuyucu kullanılarak ölçülebilir. Farklı alt tabakaların farklı renklerle tek bir kuyucukta karıştırılması, tahlil sisteminin verimini artırır ve 96 oyuklu bir plakada (oyuk başına farklı renklerde 4 farklı alt tabaka) toplam 384 deneye ulaşır.

CPH substratları, bir enzimin spesifik aktivitesini değerlendirmek için değerli bir araç sağlarken, ICB substratları, enzimlerin genellikle biyokütle içinde karşılaştığı karmaşık substrat karışımları bağlamında bir enzimin bir bileşeni sindirme kapasitesini değerlendirmek için kullanılır. ICB substratları, bireysel enzim özgüllükleri hakkında bilgi sağlamasa da, yine de enzimlerin, kokteyllerin veya et sularının ticari performansını değerlendirmek için yararlı araçlardır.

Protokol

96 çukurlu bir levha formatında CPH Substratlar 1. kromojenik tahlille

1. Deney kiti plakasının etkinleştirme
   1. çalkalama olmaksızın oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon ile takip her kuyuya (kit ile elde edilmiş) 200 ul aktivasyon çözeltisi eklenerek deney kiti plakası (Malzeme listesi) (mavi CPH-ksilen içeren), 96-çukurlu bir filtre etkinleştirmek için kullanılır.
   2. günümüze kadar gelen aktivasyon çözeltisi kaldırmak için (iç boşluk bloğu ve herhangi bir standart bir toplama plakası gibi şeffaf 96 oyuklu tabanı ile), bir vakum manifoldu kullanılarak vakum uygulayın. Bunun yerine, vakum manifoldunun Bu aşama için 10 dakika boyunca 2700 x g'de santrifüje kullanmak da mümkündür.
   3. 100 ul steril su eklenerek CPH alt tabakaların yıkanması ve dengeleyici çıkması için vakum (ya da merkezkaç kuvveti) uygulanacaktır. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve plakalar artık kullanıma hazırdır.
2. Enzim reaksiyonu,
   NOT: Her zaman tampon içerirtek başına negatif kontrol olarak ve pozitif kontroller olarak mümkün olan, daha önce karakterize edilen enzimler durumunda. çoğaltır istatistiksel uygun sayıda kullanın. CPH substratlar 10.0'a pH 3.0 ve 180 uL geçmemelidir her çukuruna tampon ucu enzim çözeltisinin toplam hacmi arasındaki stabildir. Bitki ekstresi veya kültür brotu yerine de saflaştınlmış enzim çözeltisi kullanılabilir.
   1. 150 ul 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve tahlil kiti plakasının her oyuğuna (1 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar), 5 ul Endo -cellulase solüsyonu ekleyin.
   2. çalkalama sırasında reaksiyon plakasından herhangi bir olası kaçak toplamak için deney kiti plaka altında ürün plakası (mikrotitre plaka okuyucusu ile uyumlu berrak kuyucuklu plak) koyun.
   3. 150 rpm'de yatay çalkalayıcıda 30 dakika boyunca 25 ° C'de tahlil kiti plaka inkübe edin.
      Not: inkübasyon esnasında deney kiti plaka reaksiyonu Karıştırma tutarlı ve üreme elde edilmesi için çok önemlidirtekrarlanabilir sonucu. CPH substratlar 90 ° C 'ye kadar stabildir. CPH yüzeylerde bilinmeyen enzim konsantrasyonları içeren kültür broths test ederken inkübasyon süresi 24 saat kadar artırılmalıdır. Uygun enkübasyon süreleri enzim (ler) aktivitesine bağlı olduğuna dikkat edin, fakat 24 saat içinde tespit edilebilir bir etkinlik ise, genel olarak, enzim, test edilen alt-tabakanın bozmayan olasıdır. Bir aktif enzim renkli süpernatant olarak görünür çözünür kromojenik oligosakkaritler, içine CPH substrat çözünmeyen kromojenik polisakkaritler aşağılayıcı olduğunu.
   4. iç boşluk bloğu ile vakum manifoldunun içinde temiz ürün plaka koyun.
   5. üstte tahlil kiti plakası yerleştirin ve vakum (-60 kPa maksimum negatif basınç) uygulanır. 10 dakika boyunca 2700 x g'de santrifüje kullanmak da mümkündür.
      Not: Reaksiyon ürünü olarak renkli oligosakaritler ihtiva eden süzüntü, daha fazla analiz ⁸ ürün plaka artık Yukarı.
3. Algılama ve miktarının belirlenmesi
   1. Ürün bir levhanın her çukuruna sıvı hacmi yaklaşık görsel inceleme ile aynı olup olmadığını kontrol.
   2. Bir plaka okuyucusu kullanılarak mavi CPH-ksilan 595 nm'de toplama plakası absorbansı okuyun.
   3. veri analizi yaparken, bir enzim eklendi kuyulardan değerlerden tampon sadece negatif kontrol değerleri çıkarmak. Çoğaltmak kuyulardan ^8'den ortalama değerini ve (SEM) araçlarının standart hata hesaplayın.

96 oyuklu bir formatta ICB Substratlar 2. kromojenik tahlille

1. Enzim reaksiyonu,
   1. 150 ul 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve 5 ekleme ul 31 U / ml endo -xylanase (de son enzim konsantrasyonu 1 U / ml), kırmızı ICB buğday samanı ihtiva eden deney kiti plakasının her oyuğuna Çözelti .
      Not: tahlil kiti levhalar (96-çukurlu bir filtre PLliteratürde tarif edildiği gibi ICB substratlar içeren ates) (Malzeme listesi bakınız) üretilmektedir. ICB substratlar 10.0'a pH 3.0 arasında bir pH aralığına sahip tampon stabildir. Her zaman, bir negatif kontrol olarak sadece tampon, bir pozitif kontrol olarak, ticari enzim ve yinelemeler istatistiksel uygun sayıda kullanımı bulunmaktadır.
      1. CPH alt-tabaka plaka gibi ICB alt tabakaların aktive ama vakumla süzülerek veya santrifüj, ardından 100 ul su ile üç kez yıkanarak dengeleyici kaldırın.
   2. sallayarak sırasında alt tabaka plaka herhangi bir potansiyel sızıntıyı toplamak için substrat plaka altında ürün tabak koydu.
   3. 2 saat süre ile, 150 rpm'de çalkalanarak 25 ° C'de bir reaksiyon inkübe edin.
      NOT: Bir aktif enzim renkli süpernatant olarak görünür çözünür oligosakkaritler, içine ICB substrat çözünmeyen kromojenik polisakkaritler aşağılayıcı olduğunu. ICB substratlar 90 ° C 'ye kadar stabildir. kuluçka tBöyle kültür sıvılarında olmayan saflaştırılmış enzimler kullanılması durumunda ime 24 saat kadar artırılmalıdır.
   4. iç boşluk bloğu ile vakum manifoldunun içinde ürün plaka koyun.
   5. üstte tahlil kiti plakası yerleştirin ve vakum (-60 kPa maksimum negatif basınç) uygulamak veya ürün plakasının kuyuya tahlil kiti plakadan ürünü süzmek için bir santrifüj kullanın.
      NOT: reaksiyon ürünü olarak renkli oligosakkaritler içeren süzüntü daha fazla analiz ⁸ toplama plakası artık.
2. Algılama ve miktar
   1. Toplama plakanın her bir sıvı hacmi yaklaşık görsel inceleme ile aynı olup olmadığını kontrol.
   2. Bir plaka okuyucusu kullanılarak kırmızı ICB buğday samanı 517 nm'de toplama plakası absorbansı okuyun.
   3. veri analizi yaparken - tampon çıkarma - sadece negatif kontrol değerlerini kuyulardan değerlerden nerede bir enzimeklendi. Çoğaltmak kuyulardan ^8'den ortalama değerini ve (SEM) araçlarının standart hata hesaplayın.
      NOT: bilinmiyor enzimler tarama durumda, enzimin aktivitesi dinamik aralık hakkında daha ayrıntılı veriler elde etmek amacıyla bir seyreltme serisi yapmanızı öneririz.

Sonuçlar

yüksek verimli ve bu tayinin çoklayıcı kapasitesi 96 oyuklu filtre plakası düzenlenmiş çözünmeyen kromojenik bir polimer (veya proteini), hidrojel (CPH) yüzeylere dayanır. Enzimler ayrıca negatif kontroller deney kiti plaka (Şekil 1 A) ilave edilir ve enzimler renkli bir süpernatant (Şekil 1B) üretilmesi karşılık gelen alt-tabakanın bozulmasına yol açar. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, süpernatan berrak oyuklu ürün bir levhasına aktarılır ve absorbans, 96 oyuklu plakalar (Şekil 1C) için uygun bir spektrofotometre kullanılarak doğrudan ölçülebilir.

Enzimin, farklı konsantrasyonlarda ksilanaz CPH-arabinoksilan bir doz tepkisi bir örneği (0,00-0,75 U / ml) azaltılması Enzim konsantrasyonu, görsel gözlenebilir burada Şekil 1D 'de gösterilmiştir. Daha detaylı bir spektrofotometrik kantitatifUS-PS enzim konsantrasyonu (Şekil 1E) karşı absorbansı çizmek için kullanılabilmektedir. Sinyal yoğunluğu, enzim aktivitesine karşılık gelir. Testin tekrarlanabilirliği hata çubukları ile gösterilir (ortalamanın standart hatasını, SEM, üç kopyaları). Bu testin tekrarlanabilirlik ilgili daha detaylı deneyler yerde ⁸ yayınlanmaktadır.

CPH-arabinoksilan. A) CPH alt-tabaka ile (deney kiti plakasının bir şema Şekil 1. Xylanase tedavisi, örneğin, CPH-arabinoksilan gibi enzimler 1 ve 2 ve tamponun ilave edilmesinden önce 96 oyuklu filtre plakası yuvaları içine yüklenmiştir) -sadece kontrolü (enzim 1 endo -xylanase aktiviteye sahipti) C) vakum yardımlı Filtrat üzerine, enzim 1 ile CPH-arabinoksilan B) Parçalanma renkli süpernatant ürettiÜrün plaka için süpernatanların iyonu, absorbans spektrofotometrik olarak ölçülür, d) Ürün plakası 100 mM endo -β-1,4-ksilanaz farklı konsantrasyonları ile 4 farklı renkte CPH-arabinoksilan tedaviden sonra, reaksiyon ürünlerini ihtiva eden sodyum asetat tamponu, pH 4.5, oda sıcaklığında 60 dakika;. E) spectrofotometrisi kullanılarak D reaksiyon ürünlerinin Niceleme bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Enzim taramasında bu testte kullanmak için farklı seçenekler vardır. Bir seçenek, örneğin tarama için farklı polisakaritler, bilinmeyen aktiviteli (saflaştırılmış) Endo -enzymes az sayıda içeren 96 çukurlu bir plaka kullanmaktır. Bu durumda sonuç, degrad olan polisakaritler gösterirHedef enzimi ile mümkün. Bu prensibi göstermek için, bir endo -cellulase 25 ° C 'de, farklı CPH substratlara karşı test edilmiştir. (1.0 U / ml ve 5 U / ml, 0.5 U / ml), üç farklı enzim konsantrasyonları 30 dakika inkübe edildi. Sonuç ürün plakası (Şekil 2A) açıkça görülebilir. Tedarikçi tarafından sağlanan -cellulase bu endo ürün levha ksiloglukan (demirhindi) için yan aktivite, arpa beta-glukan, glucomannan, huş ağacı ksilan ve galaktomannan düşük yan aktivitesini belirler. Buna uygun olarak, selülaz ilave aktivitesi CPH-β-glukan (arpa) karşı bulundu, CPH-ksiloglukan (demirhindi) CPH-galaktomannan (Şekil 2B) karşı CPH-ksilan (kayın) ve düşük faaliyet. Glucomannan test edilmemiştir. Önceki ile aynı koşullar altında pozitif kontroller olarak kullanılmıştır: Aynı CPH substratlar ticari olarak temin edilebilen enzim (0.5 U / ml ve 1.0 U / ml 0.1 U / ml, üç farklı enzim konsantrasyonları) ile sindirildideney. Bütün yüzeyler pozitif kontrol enzimi vasıtasıyla parçalanır ve sinyal yoğunluğu daha yüksek enzim konsantrasyonunun (Şekil 2C) ile orantılı olarak artış.

Şekil 2'de ise, farklı CPH alt-tabakalar farklı konsantrasyonda, 30 dakika. A) bir endo -cellulase ile sindirilmiş, farklı CPH substratların ürünü plaka 25 ° C sıcaklıkta ajitasyon altında inkübe edildi. B) aktivitesi ve çeşitli yan etkinliğinin miktarının belirlenmesi Endo -cellulase. . E-LAMSE CPH-pachyman, CPH-kurdlan, CPH-, hata çubukları, üç yinelemeler C) karşılık gelen alt-tabaka CPH (endo-selülaz ve 2-HE-selüloz farklı ticari enzim aktivitesinin ortalamanın standart hatasını temsil eder β-glukan (arpa); E-XYAN4 ve CPH-ksilen, e-XEGP ve CP'H-ksiloglukan, e-BLAAM CPH-amiloz, E-BMACJ CPH-galaktomannan; Megazyme tüm enzimler). Hata çubukları iki kopyaları ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Onlar kısmen biyokütle önemli bileşeni olan bitki hücre duvarlarında polisakkaritlerin doğal düzenleme korumak için çözünmez kromojenik biyokütle (ICB) yüzeylerde kromojenik alt tabaka repertuarına yararlı bir ek vardır. CPH ve usulü üzerinden alt tabakalar sıvı ortam içinde yetiştirildiğinde Phanerochaete chrysosporium salgılanmış enzimleri analiz için örnek kullanılmaktadır. Deney kiti plakasının plaka kurulumu 19 CPH substrat ve 5 ICB substratlar (her bir alt tabaka, Şekil 3B, 4 kuyu) ile birlikte, Şekil 3A'da gösterilmiştir. S. Chrysosporium cultivat olduÜç gün boyunca ed ve kültür süpernatanı analiz edilmiştir. Bu nedenle, 125 ul 200 mM tamponu her oyuğa 25 ul kültür yüzey eklendi aktarılmıştır. Üç farklı pH koşulları sodyum asetat tamponu pH 4.0 sodyum fosfat tamponu, pH 6.0 ya da pH 8.0 (Şekil 3C) kullanılarak test edilmiştir. Plaka 2 saat boyunca 25 ° C'de (150 rpm) çalkalanarak inkübe edildi.

Reaksiyon ürünler ürün plaka (Şekil 3D) aktarılmış ve analiz edilmiştir. S. Chrysosporium çeşitli glukan, nişasta ve ksilanlar (Şekil 3E) bozulması için enzimleri üretilmektedir. Alt sinyal yarı selülozlar arabinan (şeker pancarı) ve peptik galaktan hem de RGI (soya fasulyesi) için tespit edilebilir. üretilen enzimler nötr ya da hafif bazik koşullar (pH 8.0) daha asidik koşullar (pH değeri 4.0) daha aktifti. ICB alt tabakasma karşı düşük faaliyeti (Şekil 3F)polisakaridler daha doğal bir bağlamda olduğunda, enzim etkinliği saf polisakarid ile aynı olmadığını gösterir ve ham ya da önceden tatbik edilmesi halinde ICB alt-tabakalar, enzim etkinlik ile ilgili daha gerçekçi bir görünüm ortaya yüzden işlenmiş bitki malzemesi.

19 CPH, 5 ICB substratlar. A), her bir alt-tabaka 4 kuyucuklu bir plaka ortamında bir düzeni ihtiva eden bir çok alt-tabaka plakası kullanılarak Phanerochaete chrysosporium bir 3 günlük sıvı kültürden bir kültür üstte yüzen Şekil 3. Tarama (gri arka = CPH yüzeyler, turuncu arka plan = ICB yüzeyler). B) substrat. C içeren tahlil plakasının Resim) Programı (o deneyde kullanılan tampon koşulları gösteren200 mM sodyum asetat pH 4.0, sodyum fosfat, pH 6.0 ve sodyum fosfat pH 8.0) d.) 25 ° C. D) absorbans 2 saat sonra ürün plakasının resmi 517 nm'de ve her bir münferit CPH alt-tabaka ve F için çizildi ilgili enzimler için) ICB substrat sonuçları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kromojenik alt-tabakalar, aynı zamanda, tek enzimler kullanılarak ya da kokteyl enzim tek bir oyuk farklı renkli CPH alt tabakalar karışımı kullanılarak tedavi sonrası, reaksiyon süpernatant analiz ederek sinerjistik etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Şekil 4'te gösterilen örnekte, kırmızı CPH selüloz ve sarı CPH-ksilen substratlar yaklaşık ambalajlama birlikte karıştırılmıştır96 gözlü filtre plakası kuyuları al oranı. Şekil 4A, enzimsiz (kontrol), selüloz cel (2 U / ml), ksilanaz ksil (1 U / mL) ve bir oda sıcaklığında 1 saat işlemden sonra renkli reaksiyon ürünlerini gösteren her iki enzimin karışımı, 100 mM sodyum asetat tampon, pH 4.5 (3, her bir yaklaşım çoğaltır). Analizi için, reaksiyon ürünü, 700 nm'de (Şekil 4B) 350 nm absorbans spektrumunun tarama spektrofotometrik nicelleştirilmiştir. Genellikle yalnız gözle muayene farklı boyalar kaynaklanan absorbans spektrumları aynı zamanda her bozulması ölçüde daha doğru bir fikir vermesi için basit doğrusal regresyon ⁸ kullanılarak çözülebilir ancak kaydedilen enzim, bir veya birden fazla yüzeylerde hareket edip etmediğini bir göstergesidir verebilir karışımından alt-tabaka.

esas karışımları gibi CPH substratlar kullanarak SCR sağlayan tahlilin verimi artırırBir deneyde (bir de) kadar 4 farklı yüzeylerde karşı Eening. Gösterilen örnekte kullanılan dört farklı yüzeyler vardır: mavi CPH-β-glukan (arpa), sarı CPH-ksilen (kayın), yeşil CPH-amiloz ve kırmızı CPH-pektik galaktan (acı bakla). Alt-tabaka plakanın düzeni Şekil 4C ve Şekil 4D'de deney plakasının bir resim gösterilir. Reaksiyon 25 ° C ve 150 rpm'de 30 dakika boyunca 100 mM sodyum asetat tampon, pH 4.5 gerçekleştirilmiştir. Ürün plakası beklendiği gibi artan enzim konsantrasyonu ile ilk single enzimler gelen CPH substrat (Şekil 4E) ve renkli süpernatant ile test edildi alındı ​​(Şekil 4F, satır 1A - 12D). Sıra E içeren CPH-ksilen ve mavi CPH-β-glukan endo -xylanase ve endo glükanaz ilgili enzimlerin farklı oranlarda bozulmuş iki farklı CPH substratlar san. Tepkimeden sonra, sonuç visib olduğule ürün plakasında: reaksiyon ürününün rengi koyu yeşil, mavi, daha endo glükanaz mevcut iken (Şekil 4F, 4E-6E) ve (endo -xylanase konsantrasyon arttıkça, daha hafif sarı-yeşil dönüştü Şekil 4F, 10-12E). Aynı iki substratlar kırmızı CPH-pektik galaktan ve sarı CPH-ksilan endo -galactanase ve endo -xylanase ile bozulmuş edildi satır F, görülür. Dört farklı renkli CPH alt-tabaka, bu (Şekil 4F, 1G-12F) ve tek enzimler, uygun CPH substrat bozulmuş ve ek ilave renkli reaksiyon ürünleri kombine alındı ​​enzimleri ile idi.

Şekil 4. Farklı enzimler ile muamele, iki farklı CPH substrat kombinasyonu kırmızı CPH selüloz ve sarı CPH-ksilen. bir) Iki endo -cellulase (cel ile yüzeylerde) veya endo -xylanase (ksil) ya da her iki enzim. B) reaksiyon Süpernatantları absorbansı spektrumları tedavisinden sonra reaksiyon süpernatantlar. Farklı enzimler ile tedavi dört farklı CPH yüzeylerde kombinasyonu CPH substratlar içeren substrat plakasının C) Programı:. Mavi CPH-β-glukan (arpa), sarı CPH-ksilen (kayın), yeşil CPH-amiloz ve kırmızı CPH- pektik galaktan (bakla) farklı CPH substratlar içeren deney plakasının D) Resim eklendi enzimlerin oranını gösteren ürün plakası E) Programı (nominal konsantrasyonları (NC).:. glu = 1 U / ml endo glükanaz, = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amilaz ve Gal = 0,5 U / ml endo -galactanase) xyl. ürün plakasının F) resmi 30 dakika inkübe edildikten sonra, 25 ° C'de. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yüzey	Kaynak
CPH-2-hidroksietilselüloz	N / A
(CPH-2-HE-selüloz)
CPH-amilopektin	patates
CPH-amiloz	patates
CPH-arabinan	şekerpancarı
CPH-arabinoksilan	buğday
CPH-kazein	sığır süt
CPH-kitosan	hayvansal kökenli
CPH-kurdlan	Alcaligenes faecalis
CPH-dekstran	Leuconostoc spp.
CPH-galaktomannan	keçiboynuzu
CPH-Laminarin	Laminaria digitata
CPH-lichenan	İzlanda yosun
CPH-metilselüloz	N / A
CPH-pachyman	Poria cocos
CPH-pektik galaktan	patates
CPH-pullulan	Aureobasidium pullulans
CPH-ramnogalakturonan I (RG I) 'in	patates
CPH-ramnogalakturonan I (Gal) *	patates
CPH-ramnogalakturonan	soya fasulyesi
CPH-ksilan	kayın
CPH-eksiloglukan	demirhindi
arpadan CPH-β-glukan	arpa
yulaftan CPH-β-glukan	yulaf
mayadan CPH-β-glukan	Maya
ICB-Arabidopsis	Rozet Arabidopsis yaprakları thaliana Col-0 (yetişkin bitki)
ICB-Arabidopsis tohumları	Arabidopsis thaliana
ICB-küspe	Saccharum officinarum (kurutulmuş yetişkin bitki, kök ve yaprak)
ICB-kristalin selüloz (filtre kağıdı)	Ticari Whatman 3MM Chr Kromatografi kağıdı
ICB-çemen tohumu	Trigonella spp. Tohumları
ICB kendir	Esrar spp. (Kurutulmuş yetişkin bitki, kök ve yaprak)
ICB-acı bakla tohumu	Lupinus tohum angustifolius
ICB-polen P. pratense	Phleum pratense polen
ICB-ladin	Picea spp. (Mimecburiyetine ağaç gövdesi)
ICB tütün	Nicotiana benthamiana yaprakları (fidan)
ICB-buğday samanı	Triticum spp. (Kurutulmuş yetişkin bitki, kök ve yaprak)
ICB-söğüt	Salix spp. (Kurutulmuş yetişkin bitki, öğütülmüş ağaç gövde)
ICB-Sorgum	Sorgum spp. (Yetişkin bitki yaprakları)
* (çıkarıldı β-1,4-D-galaktan yan zincirler endo -β-1,4-D-Galaktanaz)

Tablo 1. Mevcut Kromojenik Polimer Hidrojel (CPH) ve çözünmez Kromojenik Biyokütle (ICB) yüzeylerde listesi.

Tartışma

Biz klorotriazin boyalar dayanmaktadır çok renkli CPH ve ICB yüzeylerde yeni nesil (Tablo 1 substratların tam listesi) kullanırken özel olarak tasarlanmış ticari tahlil kiti düzenlenmiş. Substratlann enzim sindirimi deney çözeltisi içinde tespit edilebilir ve bir plaka okuyucu ⁹ kullanılarak belirlenebilir küçük çözünür, boyanmış ürünleri elde edilir. Bu deney, endo -Oyunculuk enzimlerin değerlendirilmesi ve analiz duyarlılığı için tasarlanmış diğer yöntemler ekzo -Oyunculuk enzimler ^11,12 için uygun iken Azurine çapraz bağlanmış (AZCL) kullanılarak bir ¹⁰ alt tabakalar benzerdir. CPH olarak ICB substratlar ekzo muhtemelen -enzymes tarafından da parçalanabilir olduğu gibi, bu deney kiti güçlüğü boyası ve çapraz bağlayıcı moleküller ⁸ kaynaklanan sterik engelleme ile endo -enzim aktivitesinin saptanması yer alır.

Tahlil bir 96-wel gerçekleştirilirl biçimi ve bireysel tepkiler kuyularda gerçekleşecek. Reaksiyon tekrarlanabilir verileri almak için plaka karıştırılmalıdır. Elde edilen süpernatanlar, her bir gözün absorbansı absorbans spektrometresi kullanılarak belirlenebilir ürün plakasına filtrelenmiştir. Temel ilkeler ve tahlilin düzeni deney alt-tabakalar ile bir deney plakasına (96 oyuklu filtre plakası) oluşur. Şekil 1 'de gösterilmektedir, ve enzimler ile inkübasyondan sonra, yüzer berrak oyuklu bir plakaya içinden süzülür ve absorbansları enzim özgüllük ve aktivite yarı kantitatif ölçümü sağlayan okunur. CPH substratlar kullanarak bu tarama deneyi, aynı zamanda çözünen reaksiyon ürünleri gece boyunca inkübasyondan sonra renkli bir hale oluşturarak bir agar plaka biçiminde kullanılabileceğini Bu gösterilmiştir. ⁸

gösterildiği gibi tahlil kitleri saflaştırılmış enzimler ve potansiyel yan aktivitelerini taranması için kullanılabilirŞekil 2,. Yan faaliyetlerinin tek bir enzim ve rasgele özgüllük değil, aynı zamanda analiz örneği, farklı enzimlerin bir karışımı ve bunların sinerjik etkisi incelenmesi gereken bir gerçeği ortaya çıkabilir. Bu önceki çalışmalarda gösterilmiştir Ek olarak, mantar ⁸ hem de endojen bitki enzimi ve bakteriler (yayınlanmamış veriler) gelen enzim kokteyl, bağırsak Mikrobiyota ¹³ ve kültür sıvılarında enzim kaynağı olarak kullanılabilir.

ICB substratların biyokütle arıza endüstriyel işlemlerde karşılaşılan hücre duvarı bileşenlerin kompleks karışımlarını arayabilir. Bu yüzeyler polisakkarit durumunu değerlendirmek ve etkin daha verimli bozulma çıkışı için bozulma kokteyller nasıl optimize hakkında bilgi sağlamak üzere tasarlanmıştır. Şekil l'de gösterilen gibi 3 CPH ve usulü üzerinden yüzeyler yan enzim tarama tarafında kullanılabilir - Enzim özgünlüğü ile ilgili bilgi zenginliği ortayaTercih edilen bir alt-tabaka (CPH) daha yakından doğa (ICB) bulunan bir makromoleküler düzeneği taklit tercih edilen alt-tabaka yanı sıra diğer bileşenleri içeren, daha doğal bir kompleksi içinde hem de D aktivitesi. Birden fazla renk kullanımı deneyinde yüksek verimlilik ve multiplexity arttırır çok substratlara karşı farklı enzim aktiviteleri eş zamanlı saptanması için izin verir. Farklı boyaların Spectra basit doğrusal regresyon ile ve çok substrat etkinliği tek başına görsel muayene ile görülebilir çoğu durumda çözülebilir. Bu tür bir deney ve sonuçlarının ardından bir örnek, Şekil 4'te gösterilmiştir.

Bu tahlil araç ve uygulama çok yönlülüğü çok iyi bilinmeyen faaliyetleri ile enzimler ve kültür sıvılarında ilk seviye taraması için uygundur. Bu testte en önemli yönleri, yüksek verimli yapısı, isteğe göre uyarlanabilirlik, kullanıcı ve esneklik kolaylığı vardır. akılda, w ileE araçları bu yeni seti büyük ölçüde iyileştirmek ve endüstriyel enzim tarama işlemleri yanı sıra akademik uygulamaları hızlandırmak inanıyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
tahlil kiti plakaları	Glycospot		özelleştirilmiş tahlil kiti plakaları
aktivasyon solüsyonu	CPH substratlarını aktive etmek için	Glycospot
350 ml alıcı plakası vakum manifoldu için ara parça bloğu	Pall Corporation	5015	ara parça bloğu
96 kuyulu MultiScreen HV filtre plakası, 0.45 & m, berrak, steril olmayan	Millipore	MSHVN4510	tahlil plakası
96 Kuyulu Mikroplakalar, Polipropilen	Greiner Bio-One	651201	alt tabakaları yıkadıktan sonra toplama plakası
Nunc MicroWell 96 Kuyulu Mikroplakalar	Thermo Scientific	269620	ürün plakası
Diyaframlı pompa MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	vakum pompası vakum manifoldu
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	yatay çalkalayıcı
SpectraMax M5	Moleküler Cihazlar	10067-750 (VWR)	96 oyuklu plaka absorbans okuyucu
Vakum manifoldu	Pall Corporation	5017	vakum manifoldu
endo-selülaz (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	Megazyme	E-CELTR	selülaz [cel]
endo-β-1,4-mannanaz (Cellvibrio japonicus)	Megazyme	E-BMACJ	mannanaz [man]
endo-β-1,3-glukanaz (Trichoderma spp.)	Megazyme	E-LAMSE&	beta;-glukanaz [glu]
endo-β-1,4-D-galaktanaz (Aspergillus niger)	Megazim	E-EGALN	galaktanaz [gal]
endo-β-1,4-ksilanaz M4 (Aspergillus niger)	Megazim	E-XYAN4	ksilanaz [xyl]
endo-ksiloglukanaz (GH5) (Paenibacillus sp.)	Megazim	E-XEGP	ksiloglukanaz [xg]
&alfa;-amilaz (Bacillus licheniformis)	Megazyme	E-BLAAM	amilaz [amy]